Marcadores moleculares e sua aplicação no melhoramento genético de plantas

DNA markers and their application in plant breeding

MARCADORES MOLECULARES E SUA APLICAÇÃO NO MELHORAMENTO GENÉTICO DE PLANTAS

DNA MARKERS AND THEIR APPLICATION IN PLANT BREEDING

- Revisão Bibliográfica -

Fernanda Bered¹ José Fernandes Barbosa Neto² Fernando Irajá Félix de Carvalho³

RESUMO

Na implantação de um programa de melhoramento, uma das principais necessidades do melhorista é a capacidade de identificar genótipos superiores em uma população segregante. O conhecimento das relações genéticas e a capacidade geral e específica de combinação entre os indivíduos é essencial para a seleção de genitores. Os marcadores genéticos poderão auxiliar na identificação de indivíduos através de suas diferenças genéticas. Estes marcadores podem ser divididos em morfológicos e moleculares (enzimáticos e de DNA). Os marcadores de DNA como o RFLP e o RAPD poderão contribuir para incrementar a eficiência do melhoramento de plantas através do mapeamento de espécies de interesse e de caracteres agronômicos. Além disto, diversos autores têm comprovado a sua eficiência em caracterizar e agrupar genótipos diferentes de várias espécies com bastante precisão.

Palavras-chave: marcadores de DNA, RFLP, RAPD.

SUMMARY

One of the most important factor in a plant breeding program is the capacity of the breeder to identify superior genotypes in a segregant population. The understanding of genetic relationships and combining ability among individuals is essential for parental selection. Genetic markers are divided in morphological and molecular (Enzyme or DNA). They may help in the identification of individuals based on their genetic similarities. DNA markers, as RFLP and RAPD, contribute to increase efficiency in plant breeding through linkage mapping and agronomic traits mapping. In addition, several researchers have pointed out the efficiency of these markers to characterize genotypes and to generate clusters of genetic similarity in germplasm from different species.

Key words: DNA markers, RFLP, RAPD.

INTRODUÇÃO

O melhoramento genético tem influenciado de maneira decisiva no incremento da adaptabilidade e produtividade dos cultivos; entretanto, para a eficiente obtenção de ganhos genéticos no melhoramento é necessário um conhecimento detalhado da constituição genética das espécies.

Com a introdução de técnicas de genética molecular no início da década de 80, os estudos de identificação, caracterização e mapeamento genético estão sendo realizados com maior segurança, rapidez e eficiência. A utilização de marcadores moleculares possibilitará a avaliação da variabilidade genética existente dentro e entre espécies distintas. Da mesma forma, as técnicas de mapeamento serão influenciadas positivamente pela utilização deste tipo de marcador genético, sendo que novos alelos provenientes de espécies evolutivamente relacionadas também poderão ser incorporados aos programas de melhoramento. Portanto, o emprego destas técnicas, juntamente com os conhecimentos de genética quantitativa e de condução de populações segregantes, permitirá a criação e o desenvolvimento de novos genótipos, onde o potencial genético de cada espécie será maximizado.

1. MELHORAMENTO GENÉTICO DE PLANTAS

Dois aspectos são fundamentais no planejamento de um programa de melhoramento genético: a seleção dos genitores e os mecanismos de herança dos caracteres a serem selecionados. Para a escolha de genitores o conhecimento da variabilidade genética existente é decisivo (BARBOSA NETO, 1995). O estreito relacionamento genético entre variedades cultivadas de trigo (Triticum aestivum L.) (MARTIN et al., 1995; BARBOSA NETO, 1995), aveia (Avena sativa L.) (O'DONOUGHUE et al., 1994) e cevada (Hordeum vulgare L.) (MELCHINGER et al., 1994), assim como a dificuldade de efetuar grande número de cruzamentos em espécies autógamas sugere a necessidade de cruzar genótipos que apresentem grande variabilidade genética. A classificação de genitores em grupos heteróticos e a realização de cruzamento entre tipos geneticamente distintos poderá contribuir para a ampliação da variância genética em populações segregantes (MESSMER et al., 1993).

Enquanto o aspecto da escolha de genitores é determinante do potencial máximo de progresso genético em plantas autofecundadas, o segundo aspecto, referente aos mecanismos de herança, possibilitará a obtenção deste potencial máximo. Os caracteres de herança qualitativa, os quais são menos influenciados pelo efeito de ambiente, são mais simples de serem selecionados; por outro lado, a expressão dos caracteres quantitativos é mais afetada pelo ambiente, o que dificulta a identificação de indivíduos geneticamente superiores. Rendimento e qualidade de grãos, resistência ao acamamento e arquitetura de planta em trigo e aveia são exemplos típicos de caracteres quantitativos.

2. MARCADORES GENÉTICOS

Marcadores genéticos são caracteres com mecanismo de herança simples que podem ser empregados para avaliar diferenças genéticas entre dois ou mais indivíduos. Estes marcadores podem ser divididos em dois grupos básicos, marcadores morfológicos e marcadores moleculares.

2.1 Marcadores morfológicos

Os marcadores morfológicos têm sido utilizados para a identificação de genótipos desde os tempos de Mendel. Mapas de ligação genética para as culturas do milho (Zea mays L.) (COE & NEUFFER, 1993) e do trigo (Triticum aestivum L.) (HART et al., 1993), entre outros, têm sido desenvolvidos com a utilização desta tecnologia. Entretanto, diversas limitações têm sido apontadas para a utilização de marcadores morfológicos no melhoramento de plantas (PATERSON et al., 1991b). O forte efeito dos genes determinantes de marcadores morfológicos podem afetar a análise genética de grande número de caracteres de importância agronômica; poucos caracteres podem ser estudados ao mesmo tempo devido aos efeitos das interações gênicas como a epistasia; e o ambiente pode modificar a expressão dos marcadores morfológicos, causando um confundimento na análise. Diversos trabalhos têm utilizado marcadores morfológicos para caracterizar agrupamentos de variedades em diferentes espécies (SOUZA & SORRELLS, 1991a; SOUZA & SORRELLS, 1991b; SORRELLS et al., 1993; ZHONG-HU, 1991). Estes estudos estão baseados na pressuposição de que similaridade morfológica indicará similaridade genética. Por outro lado, os marcadores morfológicos não têm sido utilizados intensamente para o mapeamento de caracteres agronômicos devido às limitações previamente discutidas.

2.2 Marcadores moleculares

A tecnologia de marcadores moleculares viabiliza a caracterização genética de grande número de genótipos através de procedimentos relativamente simples e rápidos. Com o auxílio destas técnicas serão possíveis progressos intensos na seleção de genitores com capacidade especifica e geral de combinação para a síntese de populações superiores. Da mesma maneira, este tipo de tecnologia poderá auxiliar na detecção de marcadores para genes de interesse agronômico. Como conseqüência, a seleção de genitores superiores em programas de melhoramento poderá ser realizada de forma objetiva e precisa, determinando a formação de populações segregantes com alta freqüência de genótipos superiores.

Apesar dos custos e do grau de conhecimento necessários, é previsível que esta tecnologia possa ser aproveitada por diversos programas de melhoramento, tendo em vista o alto grau de conservação das constituições genéticas entre diferentes populações dentro da mesma espécie e entre espécies evolutivamente relacionadas. Os marcadores moleculares podem ser divididos naqueles baseados em enzimas (isoenzimas e aloenzimas) e naqueles baseados em ácidos nucleicos (marcadores de DNA) (PATERSON et al., 1991b).

2.2.1 Marcadores moleculares enzimáticos

A habilidade de separar proteínas pelo ponto isoelétrico e peso molecular pode ser útil na caracterização das proteínas de sementes e na distinção entre indivíduos. Diversos pesquisadores têm utilizado enzimas na determinação de variabilidade genética entre variedades em diferentes espécies. HENN et al. (1992) utilizaram seis isoenzimas para avaliar dezessete cultivares de tomate e verificaram que, apesar do baixo grau de polimorfismo detectado em algumas enzimas, o método era adequado para a separação das cultivares uniformes de tomate. SMITH & SMITH (1988) concluíram que marcadores moleculares baseados em enzimas permitiam um alto grau de separação entre variedades de milho; por outro lado, os autores apontaram a necessidade da utilização de uma maior quantidade de marcadores para amostrar adequadamente todo o genoma. Em cereais de inverno, marcadores enzimáticos têm sido utilizados na determinação de relações filogenéticas entre espécies afins, principalmente em trigo e aveia (JAASKA, 1980; DE LA HOZ & FOMINAYA, 1989); entretanto, BEER et al. (1993) indicaram que este tipo de marcador era ineficiente na estimativa de distância genética entre linhagens de Avena sterilis L. De maneira similar, NODARI (1993) apontou que o reduzido número de sistemas enzimáticos apresentava limitações dependendo do objetivo do estudo ou atividade.

2.2.2 Marcadores moleculares de DNA

Novas técnicas de genética molecular têm possibilitado a utilização de marcadores genéticos a nível de DNA. O polimorfismo para comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), proposto por BOTSTEIN et al. (1980) é capaz de diferenciar indivíduos através de variações individuais nos nucleotídeos devido a mutação, deleção, inserção e inversão. Diversas vantagens têm sido apontadas para este tipo de marcador; RFLP estão disponíveis em grande número, exibem grande variabilidade natural, não são influenciados pelo ambiente e são livres de efeitos de epistasia, o que permite a avaliação de diversos marcadores ao mesmo tempo (TANKSLEY et al., 1989). De maneira similar, a técnica de polimorfismo de segmentos de DNA amplificados ao acaso (RAPD), proposta por WILLIAMS et al. (1990), apresenta as vantagens do RFLP.

2.2.2.1 RFLP (Restriction fragment lenght polymorphism)

A técnica consiste na hibridação de seqüências específicas de DNA (sondas) com o DNA total digerido por enzimas de restrição dos indivíduos a serem analisados. As sondas de DNA utilizadas em estudos de RFLP podem ser divididas em dois grupos. O primeiro grupo de sondas é produzido através da digestão do DNA total de uma espécie e da construção de uma biblioteca genômica. Estes tipo de sonda é caracterizado por um tamanho de até 5000 pb e inclui regiões de DNA que são ou não transcritas (WATSON et al., 1987). O segundo tipo de sonda é denominado de cDNA. As bibliotecas de cDNA são produzidas com a utilização de uma enzima denominada transcriptase reversa, a qual catalisa a síntese de uma seqüência de DNA a partir de uma seqüência de RNA. Este tipo de sonda é caracterizado por um menor tamanho (até 2000pb) e por ser composta de regiões cromossômicas que são transcritas (WATSON et al., 1987).

A caracterização da variabilidade genética através da utilização de RFLP tem sido realizada para diferentes espécies. O'DONOUGHUE et al. (1994) analisando 83 cultivares de aveia com RFLP detectaram grupos de similaridade, onde variedades de inverno foram classificadas em grupos distintos das variedades de primavera. Resultados similares na separação de cevadas de inverno e de primavera foram observados por MELCHINGER et al. (1994). Devido ao interesse de prever o desempenho de híbridos, os melhoristas de milho têm utilizado intensamente a técnica de RFLP para estimar a distância genética entre linhagens homozigotas. SMITH et al. (1990) estimaram similaridade genética entre um grupo de linhagens elite de milho e concluíram que informação proveniente da análise de RFLP poderia ser empregada para a determinação das melhores combinações híbridas. Por outro lado, MELCHINGER et al. (1990) não detectaram correlação significativa entre distância genética estimada através de RFLP e capacidade combinatória; entretanto, os autores recomendaram esta técnica para a separação de variedades em diferentes grupos de similaridade genética (genetic pools).

2.2.2.2 RAPD ( Random amplified polymorphism DNA )

A análise de RAPD envolve o emprego de uma tecnologia denominada de Reação de Polimerização em Cadeia (PCR). O PCR está baseado na amplificação enzimática de um fragmento de DNA flanqueado por dois primers hibridizados em fitas de DNA opostas. Ciclos repetidos de desnaturação, anelamento dos primers e extensão do DNA resultam na amplificação do fragmento alvo. Os primers são oligonucletídeos de até 20 ou 25pb que servem de iniciação para a síntese de DNA pela enzima Taq polimerase. A técnica de RAPD está caracterizada pela utilização de primers ao acaso com tamanho ao redor de 10pb; desta maneira, sempre que o genoma do indivíduo a ser analisado apresentar uma seqüência de nucleotídeos correspondente ao do primer, o processo de amplificação será iniciado, sendo que diferenças ao nível de DNA são inferidas pela presença ou ausência de um determinado fragmento amplificado.

A análise através de RAPD também tem sido empregada em estudos de caracterização da variabilidade genética em espécies de interesse econômico. MARTIN et al. (1995) estudaram o relacionamento entre sete variedades de trigo utilizando a técnica de PCR e concluíram que o grau de variabilidade genética entre os genitores não era uma variável adequada para a previsão da heterose nesta espécie. Nos últimos anos mapas de ligação genética com a técnica de RAPD têm sido construídos em várias espécies (SHOEMAKER et al., 1992; WEEDEN et al., 1994).

3. MAPAS DE LIGAÇÃO GENÉTICA

Através da utilização dos marcadores moleculares é possível mapear os grupos cromossômicos de ligação. Mapas de ligação genética têm sido construídos para diversas espécies, como cevada (Hordeum vulgare L. ) (HEUN et al., 1991), milho (BURR et al., 1993), arroz (McCOUCH et al., 1988) e tomate (TANKSLEY et al., 1992). Em trigo, aveia e triticale o emprego da tecnologia de marcadores moleculares e a construção de mapas de ligação são tarefas mais complexas devido a natureza poliplóide destas espécies. O mapeamento de espécies diplóides evolutivamente relacionadas, a utilização de estoques aneuplóides e o mapeamento comparativo podem ser métodos alternativos (SORRELLS, 1992). ANDERSON et al. (1992) desenvolveram um mapa cromossômico (arm map) em trigo baseados em estoques aneuplóides. O'DONOUGHUE et al. (1992) publicaram um mapa de ligação construído a partir de um cruzamento entre duas espécies de aveia diplóides, Avena atlantica L. x Avena hirtula. L. Mais recentemente, mapas de ligação para trigo (NELSON et al., 1995a; NELSON et al., 1995b; NELSON et al., 1995c) e aveia (O'DONOUGHUE et al., 1995) foram publicados. Estes mapas de ligação podem contribuir de forma decisiva no mapeamento de características de interesse agronômico e auxiliar na seleção de marcadores para estudos de caracterização de variabilidade genética.

O mapeamento de caracteres agronômicos em uma espécie exige a utilização de uma população segregante e a avaliação fenotípica destas características. Assim sendo, estudos de segregação genética e testes estatísticos para a detecção de associações podem ser realizados. Geralmente, populações F₂ ou retrocruzamentos F₁ são empregados com este objetivo; entretanto, para plantas de autofecundação, populações de linhagens homozigotas desenvolvidas pelo método de SSD ou duplo-haplóides são preferencialmente utilizadas. A facilidade de manutenção e multiplicação dos genótipos a serem estudados para o mapeamento é uma das vantagens da utilização de linhagens homozigotas. Recentemente, TANKSLEY & NELSON (1996) propuseram a utilização de gerações avançadas de retrocruzamentos para a construção de mapas de ligação em espécies autógamas anuais. Caracteres qualitativos e quantitativos podem ser mapeados, no entanto, diferentes mecanismos são utilizados para realizar cada uma destas tarefas.

O mapeamento de caracteres qualitativos pode ser realizado através de testes de segregação, levando em consideração a freqüência de recombinantes observada (HALDANE, 1919). LANDER et al. (1987) publicaram um programa de computador, denominado MAPMAKER, o qual estima a distância entre locos a partir da freqüência de recombinação. Diversos genes qualitativos têm sido mapeados nas mais diferentes espécies (AHN et al., 1992; SABELLI et al., 1992; YOUNG et al., 1988).

O mapeamento de QTL (quantitative trait loci) é uma tarefa bem mais complexa do que o mapeamento de caracteres qualitativos. Esta técnica esta baseada em procedimentos estatísticos que envolvem a utilização de modelos lineares (PATERSON et al., 1991a); entretanto, diversos aspectos da metodologia estatística ainda não estão completamente resolvidos. LANDER & BOTSTEIN (1989) e NELSON (1994) desenvolveram programas de computador que estimam parâmetros de ligação e ação gênica de QTL. KNOTT & HALEY (1992), KNAPP (1991) e DOERGE & CHURCHILL (1994) discutiram problemas ligados a detecção de associação genética entre marcadores moleculares e QTL.

Apesar dos problemas estatísticos relacionados à detecção de QTL, muitos trabalhos têm descrito associações entre marcadores moleculares e QTL em tomate (TANKSLEY et al., 1982; PATERSON et al., 1988), milho (Zea mays L. ) (STUBER et al., 1992), soja [Glycine max (L.) Merr.] (MANSUR et al., 1993), trigo (ANDERSON et al., 1993), cevada (HAYES, 1993) e aveia (Avena sativa L.) (BARBOSA NETO, 1995; SIRIPOONWIWAT et al., 1996). Muitos destes trabalhos têm possibilitado a confirmação dos QTL detectados através da utilização de ambientes e populações distintas. Recentemente, um QTL para qualidade de fruto em tomate está em processo de clonagem (STEVE TANKSLEY - Informe verbal).

4. VARIABILIDADE GENÉTICA

O reconhecimento de um genótipo ou o cálculo da similaridade genética entre possíveis genitores é um fator de importância e pode ser realizado de diferentes maneiras. Análises do coeficiente de parentesco (FRANCO et al., 1987; SOUZA e SORRELLS, 1989) e caracteres morfológicos (SOUZA & SORRELLS, 1991a; SOUZA & SORRELLS, 1991b) têm sido empregados; entretanto, ambas metodologias apresentam limitações. Atualmente, estimativas baseadas em marcadores moleculares a nível bioquímico e de DNA têm sido empregados (SMITH & SMITH, 1988; MELCHINGER et al., 1994; O'DONOUGHUE et al., 1994; BARBOSA NETO ,1995).

O coeficiente de parentesco pode ser definido como a probabilidade de que alelos homólogos de diferentes indivíduos sejam idênticos por descendência (FALCONER, 1960). Como conseqüência direta desta definição, a similaridade genética medida por esta metodologia avalia apenas similaridade por descendência, não considerando a similaridade genética total entre indivíduos. Desta forma, o conjunto de pressuposições realizadas para o cálculo do coeficiente de parentesco podem induzir a erros na estimação da similaridade genética entre indivíduos (BARBOSA NETO , 1995).

Por outro lado, o grau de similaridade baseado em marcadores moleculares (GS) reflete a semelhança entre os genótipos a partir de uma amostra direta do genoma (GRANER et al., 1994). Muitos trabalhos têm revelado uma estreita associação entre GS e COP. AJMONE-MARSAN et al. (1992), analisando linhagens híbridas de milho, obtiveram correlação significativa (r = 0,70) entre GS e COP calculados a partir de 18 pares de linhagens. Os autores concluíram que essas duas técnicas associadas poderiam ser muito úteis na identificação de relações filogenéticas entre linhagens de milho. Da mesma forma, MESSMER et al. (1993), também estudando milho, indicaram correlação significativa entre as duas técnicas; entretanto, os autores apontaram a existência de discordância no agrupamento das variedades. Por outro lado, GRANER et al. (1994) encontraram uma baixa correlação entre GS e COP em cevada. BARBOSA NETO (1995) também apontou baixas correlações entre COP e GS para diferentes grupos de variedades de trigo. A violação das pressuposições envolvidas na estimativa do coeficiente de parentesco e registros incompletos de genealogia podem ter sido fatores importantes na obtenção das reduzidas correlações observadas.

5. SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES MOLECULARES

Uma metodologia que tem alcançado êxitos é a da seleção indireta, a qual consiste na seleção para um caráter que está associado com o outro a ser melhorado. Esta metodologia é vantajosa quando a herdabilidade do caráter indireto e a correlação com o caráter alvo são elevadas. A seleção para ciclo de desenvolvimento em cevada (Hordeum vulgare L. ) foi indicada como eficiente para o desenvolvimento de genótipos de rendimento de grãos mais elevados (VAN OOSTEROM & CECCARELLI, 1993). Da mesma forma, a seleção indireta para peso de grão e número de grãos por espiga foi eficiente para o incremento do rendimento de grãos em trigo (McNEAL et al., 1978).

A seleção assistida por marcadores moleculares é uma forma de seleção indireta no qual o caráter indireto apresenta herdabilidade igual a 100%, uma vez que marcadores moleculares não são influenciados pelo ambiente. Esta tecnologia pode ser avaliada com a equação de ganho genético através da seleção artificial. O ganho genético através da seleção é função de (HALLAUER & MIRANDA, 1988):

onde:

k = diferencial de seleção, y = número de anos por ciclo de seleção, s²_a= variância aditiva, s²_e = variância de ambiente, s²_ge = variância da interação genótipo x ambiente e s²_g = variância genética. A utilização de marcadores moleculares na seleção de genótipos superiores poderá incrementar a eficiência no melhoramento de plantas em relação a vários fatores presentes na equação de ganho genético. Os marcadores moleculares não são influenciados pelo ambiente; desta forma, as variâncias de ambiente e da interação genótipo x ambiente podem ser eliminadas. Em adição, desde que a seleção é praticada diretamente no genótipo, o diferencial de seleção e a variância aditiva poderão ser levadas ao extremo. No caso de RFLP, onde o tipo de interação intra-loco é de codominância, a variância aditiva poderá ser explorada ao máximo. A falta de epistasia em marcadores moleculares também poderá possibilitar a seleção para vários caracteres ao mesmo tempo. O número de anos necessários para o processo de seleção também poderá ser reduzido drasticamente, uma vez que vários ciclos de seleção poderão ser praticados a cada ano, visto que a seleção com marcadores moleculares independe do ambiente.

Por outro lado, para o emprego da seleção assistida por marcadores moleculares é necessário o mapeamento de caracteres de interesse agronômico de forma a maximizar a correlação genética. Este procedimento é demorado e requer a construção de mapas de ligação genética saturados de marcadores (TANKSLEY et al., 1989). Da mesma forma, é importante considerar o custo envolvido na utilização desta tecnologia. Caracteres de alta herdabilidade e de fácil avaliação pelo melhorista podem não ser apropriados para a utilização da seleção assistida por marcadores moleculares; uma vez que a avaliação direta do caráter é eficiente para a separação das diferentes classes de genótipos e o custo envolvido na análise com marcadores moleculares não implicará uma maior eficiência no melhoramento. Em geral, caracteres de baixa herdabilidade, como rendimento de grãos, ou de difícil avaliação, como tolerância ao alumínio e resistência ao BYDV (vírus do nanismo amarelo da cevada), são considerados preferenciais para a seleção assistida por marcadores moleculares.

CONCLUSÃO

As técnicas de marcadores moleculares ampliaram de forma drástica o número de marcadores genéticos disponíveis, representando uma poderosa ferramenta para ser utilizada no melhoramento de plantas. Isto pode ser exemplificado pelo fato de que muitos caracteres de importância agronômica têm sido mapeados através desta técnica, demonstrando a sua viabilidade para o emprego no melhoramento genético. No entanto, algumas técnicas ainda não estão totalmente desenvolvidas. A utilização de seleção assistida para caracteres quantitativos por exemplo, ainda enfrenta algumas dificuldades, não sendo obtida uma precisão absoluta. Certamente com o crescente desenvolvimento de técnicas cada vez mais eficientes e precisas de genética molecular e de estatística, os marcadores poderão desempenhar um papel fundamental na seleção assistida e na clonagem de genes de interesse. Desta forma, os estudos realizados nesta área têm beneficiado diretamente a biologia básica e indiretamente os melhoristas, no sentido de facilitar o processo de seleção e tornar possível o aumento da produtividade das diferentes culturas.

INFORME VERBAL

STEVE TANKSLEY: Cornell University, Department of Plant Breeding and Biometry. 252 Emerson Hall, Ithaca, NY. 14853.

² Engenheiro Agrônomo, PhD, Professor Adjunto, Departamento de Plantas de Lavoura, Faculdade de Agronomia, UFRGS, Caixa Postal 776, 90001-970, Porto Alegre, RS. Autor para correspondência.

³ Engenheiro Agrônomo, PhD, Professor Adjunto, Departamento de Fitotecnia, Faculdade de Agronomia "Eliseu Maciel" - UFPel.

Recebido para publicação em 08.10.96. Aprovado em 04.12.1996.

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Bióloga, MsC, aluna de doutorado do Curso de Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Maio 2008
• Data do Fascículo
  Ago 1997

Histórico

• Aceito
  04 Dez 1996
• Recebido
  08 Out 1996