Conservação in vitro do germoplasma de capim-elefante por meio da micropropagação de meristemas axilares

In vitro conservation of elephantgrass germplasm of micropropagation of axillary meristems

CONSERVAÇÃO IN VITRO DO GERMOPLASMA DE CAPIM-ELEFANTE POR MEIO DA MICROPROPAGAÇÃO DE MERISTEMAS AXILARES

IN VITRO CONSERVATION OF ELEPHANTGRASS GERMPLASM OF MICROPROPAGATION OF AXILLARY MERISTEMS

Maria Coletta Vidigal¹ Leônidas Paixão Passos² José Luiz Oliveira da Silva³

RESUMO

Na conservação m vitro do capim-elefante foi observado que, ao longo dos subcultivos sucessivos de meristemas picais, ocorre gradual perda de vigor nas plântulas. Essa limitação torna necessária a reintrodução de acessos na coleção, comprometendo a eficiência do processo. Visando solucionar o problema, foi conduzido um estudo com 51 cultivares de capimelefante, onde, na repicagem efetuada a cada 4 a 6 meses, foram inoculados meristemas axilares da plântula, dispostos horizontalmente sobre meio MS, adicionado ou não de ácido naftalenoacético (ANA). Neste ciclo, que durou 45 dias, foram avaliadas as seguintes variáveis: número e comprimento dos explantes, gemas brotadas por explante, início e vigor da brotação, número de brotos desenvolvidos e percentagem de morte. Os resultados sugerem que esse método melhorou o vigor acentuadamente; embora as respostas, com e sem adição de ANA ao meio, tenham sido muito variadas entre cultivares. Apenas a cv. Mercker Comum Pinda não apresentou resposta satisfatória, devendo ser futuramente submetida a outras alternativas para propagação. Com base na produção de brotos, as cvs. Napier e Sem Pêlo apresentaram o melhor desempenho, na presença de ANA. O método mostrou-se promissor também pelo uso mínimo de reguladores do crescimento, reduzindo custos e a possibilidade de mutações.

Palavras-chave: capim-elefante, cultura de tecidos, germoplasma, micropropagação, Pennisetum purpureum.

SUMMARY

The continuous utiliwtion of explants obtainedfrom cultured apical meristems limits elephantgrass in vitro conservation because of gradual loss of vigor. Such a restriction makes it necessary to periodícally replace accessions in the coilection, reducing the efficiency of the technique. To overcome this problem, a study was carried out with 51 elephantgrass cultivars, where reculturing was conducted every 4 to 6 months using in vitro seediing axiliary meristems, with or without the addition of naphtaleneacetic acid (NAA) to the MS culture médium. During this reculturing cycle, which lasted 45 days, the following variables were evaluated: explant number and length, sprouted buds per explant, days to sprouting onset, sprouting vigor, number of developed shoots and percentage of death. The results suggest that the method improved seediing vigor markediy, altfwugh cultivar responses, regardiess of NAA addition, showed high variation. 'Mercker Comum Pinda' was the sole case showing no or weak response to either MS or NAA-enriched MS médium. Based on the number of sprouts developed, 'Napier' and 'Sem Pêlo' exhibited the best performance, when NAA was added to the médium. This method showed high potential to lower costs and reduce risks of mutations because of the limited utilization of growth regulators.

Key words:elephantgrass, germplasm, micropropagation, Pennisetum purpureum, tissue culture.

INTRODUÇÃO

A micropropagação in vitro tem se tornado importante para o manejo das plantas cultivadas, principalmente na limpeza clonal e multiplicação de espécies herbáceas e arbustivas (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1990). O método é aplicado na produção massal, economizando tempo e espaço; e, obtenção de indivíduos com características genéticas idênticas à matriz ou favorecendo a variabilidade genética (OLIVEIRA et al, 1991). Avanços mais recentes incluem sua aplicação em espécies recalcitrantes (MOLINA & SCHOBERT, 1996) e medição do crescimento rítmico com base na época de excisão e posição da gema (EL-MORSY & MILLET, 1996).

O capim-elefante {Pennisetum purpureum Schum.) é uma forrageira de elevada produtividade que apresenta crescente uso na produção de leite no Brasil. No entanto, o potencial dos diversos citótipos disponíveis ainda está por ser investigado, tornando necessária a criação de mecanismos que ermitam a rápida disseminação de genótipos desejáveis. Nos estudos conduzidos com a micropropagação da espécie, os seguintes resultados foram obtidos: RAJASEKARAN et al (1986) desenvolveram um procedimento eficaz para o híbrido triplóide P. glaucum x P. Purpureum obtido a partir de calos embriogênicos, após promoção de enraizamento em ágar semi-sólido com os sais inorgânicos do meio MS em meia força. ZANETTE et al (1988) cultivaram meristemas apicais em meio MS na produção de mudas da cv. Napier. Todavia, foi necessária uma repicagem para meio de enraizamento, tendo ocorrido deficiências de N, P e K, que exigiram correções. PASSOS & KATTERMAN (1994) obtiveram a multiplicação in vitro a partir de sementes para a produção de explantes, visando à indução de calogênese.

Apesar desse progresso, ainda é necessário que se estude genótipos contrastantes, para o estabelecimento de procedimentos abrangentes. Por exemplo, na conservação in vitro do banco ativo de germoplasma de capim-elefante da Embrapa-Gado de Leite, o uso de meristemas apicais induziu gradual perda de vigor com o decorrer dos ciclos de cultivo, comprometendo a eficiência do método pela necessidade frequente de reposições.

Diversas causas podem ser atribuídas para o problema. Segundo VASIL (1987), a relação entre genótipo e competência morfogenética in vitro é complexa e indireta, fortemente influenciada por fatores fisiológicos e ambientais. Estes, por sua vez, afeiam a síntese, transporte e disponibilidade de reguladores do crescimento. Assim, mesmo linhagens ou genótipos considerados altamente recalcitrantes podem ser induzidos à morfogênese, quando explantes apropriados, em estádios de desenvolvimento definidos, são removidos de plantas cultivadas em condições adequadas. Por outro lado, plantas que normalmente experimentam morfogênese in vitro são difíceis de se regenerar a partir de explantes não apropriados ou obtidos sob condições de crescimento adversas. Além disso, têm sido observadas variações nas respostas de culturas de órgãos e tecidos em diferentes genótipos de gramíneas, tais como arroz (ABE & FUTSUHARA, 1985) e trigo (MATHIAS & FUKUI, 1986).

Outros fatores morfológicos e fisiológicos podem também estar envolvidos. O ácido naftalenoacético (ANA) proporciona diferenciação da planta inteira a partir de meristemas, quando aplicado como única fonte exógena de reguladores do crescimento (KARTHA, 1981). Em decorrência, a conservação do capim-elefante in vitro poderia ser melhorada pelo subcultivo contínuo de meristemas axilares das plântulas e pela adição ou não de ANA.

O presente estudo objetivou examinar a conservação in vitro de 51 cultivares de capim-elefante, através da micropropagação de meristemas axilares, com ou sem adição de ANA ao meio.

MATERIAIS E MÉTODOS

A conservação in vitro de cultivares foi conduzida na Embrapa-Gado de Leite, em 51 acessos do Banco Ativo de Germoplasma de Capim-Elefante (BAG). As culturas foram estabelecidas usando gemas do segmento apical de brotos em expansão, que foram imersas em etanol 70%, por 5 a 10 min, e tratadas com solução de hipoclorito de sódio 1%, por 30 min. Após enxaguados três vezes em água destilada estéril, os explantes foram inoculados em meio salino MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), acrescido das vitaminas WPM (LLOYD & McCOWN, 1980), 2% de sacarose, 0,3% de carvão ativado e 0,8% de ágar lavado. A cada 4 a 6 meses, os cultivos foram repicados com a transferência do terço apical da plântula. O processo foi conduzido por 360 dias, sendo então iniciado o estudo de avaliação do vigor.

Foram usados segmentos de 0,4 a 2,0cm dos dois terços restantes do colmo das plântulas com meristemas axilares. Cada segmento foi disposto horizontalmente sobre a superfície do meio MS, acrescido das vitaminas WPM, 2% de sacarose e 0,8% de ágar e observados por 45 dias.

Após esse período, as cultivares que apresentavam bom desenvolvimento visual foram mantidas em meio MS; aquelas com menor vigor e as que não desenvolveram brotações foram inoculadas em meio MS, adicionado de ANA 0,125(LiM. Assim, algumas cultivares foram estudadas em meio MS, outras, tanto em meio MS como no meio MS+ANA, e ainda outras, somente em meio MS+ANA, conforme discriminação na Tabela 1.

Antes da autoclavagem, o pH dos meios foi corrigido para 5,7. As culturas foram incubadas a 30 ± 5°C, 57% de U.R., luminosidade de 72,07 W/m², radiação de 159,57 mmol/s/m² e 15h de período luminoso.

O período de estudo foi de 45 dias, com duas observações semanais das seguintes variáveis: número e comprimento dos explantes, gemas brotadas por explante, início e vigor da brotação (avaliado visualmente como A = exuberante, B = elevado, C = médio e D = baixo), número de brotos desenvolvidos, e percentagem de brotos mortos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A inoculação de explantes axilares na posição horizontal melhorou o vigor com relação ao uso de explantes apicais, como mostra o caso típico ilustrado na Figura 1. Todavia, as respostas a esse método, independentemente da adição de ANA ao meio, foram muito variadas e não dependeram dos grupos morfológicos ou fenológicos de cultivares (Tabela 1), confirmando observações de ABE & FUTSUHARA (1985) e MATHIAS & FUKUI (1986) em outras gramíneas. Possíveis diferenças de vigor inicial são pouco prováveis, haja vista a baixa variação no comprimento dos explantes usados e as condições ambientais uniformes de cultivo. Na realidade, o uso de explantes menores pareceu favorecer a obtenção de maior número de propágulos.

Geralmente, os explantes que propiciaram maior número de gemas brotadas também produziram maior número final de brotos. A data de início da brotação variou acentuadamente; mas não pareceu influenciar o desenvolvimento dos brotos; como se pode observar na Tabela 1, alguns explantes já apresentavam gemas axilares em desenvolvimento na inoculação, tais como o BAG 27-5, Elefante da Colômbia, King Grass e Kizozi; outros, como Duro de Volta Grande e Roxo, chegaram a ter início de brotação, respectivamente, no 41° e 42° dia após a inoculação.

Os dados da Tabela 1 mostram ainda que as seguintes cultivares apresentaram alta produção de brotos apenas no MS: BAG 27-5, IAC Campinas, Mercker Pinda, Mercker Santa Rita, Mole VG x 239 DA-2, Napier N° 2 e Napier x 239 DA-2. As cvs.

Elefante da Colômbia, Mercker Pinda México, Mott e Roxo não apresentaram problemas de vigor, mas o número de brotos produzidos para repicagem não foi elevado; a primeira delas apresentou alto índice de mortandade. O híbrido Mercker x 239 DA-2 não se desenvolveu e Mineiro x 239 DA-2 exibiu baixo crescimento.

Quando se comparou, por meio do número de brotos desenvolvidos, os tratamentos MS + ANA, verificou-se que as cvs. Albano, BAG 50, Mercker, Mercker S.E.A., Napier, Pusa Napier N°2, Sem Pêlo e Taiwan A-146 foram favorecidas pela adição de ANA. As cvs. Capim Cana d'África, Costa Rica, Cuba 116, Elefante de Pinda, Gramafante, King Grass, Mercker Comum Pinda, Mole VG x 23 A, Mott F l, Napier VG, P 241 Piracicaba, Roxo Anão, Três Rios e Vrukwona aparentemente não foram afetadas. As cvs. Elefante Cachoeiro do Itapemirim, Duro de VG, Gigante de Pinda, Kizozi, Napier ?2, Taiwan A-25, Taiwan A-26, Taiwan A-144, Taiwan A-148 e Turrialba tenderam a ser prejudicadas pela adição de ANA.

As cvs. BAG 27-5, Duro de VG, Elefante de Pinda, Kizozi, Mercker, Mercker Comum de Pinda, Mercker Santa Rita, Mercker S.E.A., Napier, Napier VG, Pusa Gigante Napier, Pusa Napier N°2,Taiwan A-144, Taiwan A-146, Taiwan A-148,Turrialba e Vrukwona não apresentaram brotações em alguns explantes. Considerando a produção de brotos, as cvs. Napier e Sem Pêlo apresentaram o melhor desempenho, quando o ANA foi adicionado ao meio. A cultivar Porto Rico 534-B foi a que mais se destacou entre aquelas micropropagadas com sucesso no meio contendo ANA.

É possível que níveis hormonais endógenos possam ter variado entre explantes da mesma cultivar e causado as variações apresentadas. Observações realizadas por EL-MORSY & MILLET (1996), sobre os efeitos da posição da gema e da época de excisão sobre o crescimento rítmico de Citrus aurantium parecem corroborar essa alternativa. A padronização dos ciclos de repicagem em 45 dias sugere que a mobilização de hormônios para o desenvolvimento das gemas pode ter sido limitante. Outra possibilidade seria uma variação no nível de proteínas receptoras de hormônios nos sítios de crescimento, que poderia também explicar o aumento de vigor dos brotos provenientes de explantes axilares. Determinações destes dois componentes seriam necessárias em trabalhos futuros, para verificar essas possibilidades.

Diferentemente do trabalho de ZANETTE et al (1988), não foram observadas deficiências de N, P e K, nem houve necessidade de indução ao enraizamento, indicando uma economia no uso de reguladores do crescimento.

A micropropagação também mostrou-se eficaz em plântulas propagadas por sementes (PASSOS & KATTERMAN, 1994), para as cvs. Napier, .Taiwan A-26 e Taiwan A-144 em meio MS. Essas plântulas mostraram-se adequadas como fontes de explantes para a produção de calos embriogênicos, visando à obtenção de novos citótipos. Entre tanto, o material obtido não poderia ser usado para reprodução vegetativa dos genótipos que lhe deram origem, por causa da segregação, decorrente da elevada heterozigose da espécie (HANNA, 1994). No presente estudo, as plântulas obtidas, por causa da propagação vegetativa, conservam as características do material de origem e apresentam a vantagem adicional de poderem ser usadas na indução de calogênese e de variação somaclonal pelas técnicas in vitro adequadas.

CONCLUSÕES

A técnica de inoculação de meristemas axilares pode ser aplicada a numerosos genótipos da espécie, revertendo a progressiva perda de vigor causada pelo subcultivo continuado de meristemas apicais. Não há limitações para o desenvolvimento radicular dos micropropágulos, dispensando repicagens para meios indutores. Essa facilidade reduz o uso de reguladores do crescimento, com relação aos outros métodos relatados na literatura, diminuindo custos e riscos de indução de mutações a longo prazo.

Embora o uso do ácido naftalenoacético possa ser descartado para algumas cultivares estudadas, sua necessidade, em outros casos, indica que essa alternativa deve ser abordada com mais critério. Por exemplo, quando ele é adicionado ao meio, as cvs. Napier e Sem Pêlo apresentam o melhor desempenho do estudo.

As cultivares de capim-elefante devem ser examinadas individualmente para o estabelecimento de condições ótimas de conservação in vitro. A expansão do uso do método para os demais acessos existentes no banco ativo de germoplasma de capim-elefante torna-se prioritária, visando permitir pronta disponibilidade da biodiversidade da espécie para estudos genéticos. As implicações da melhoria do sistema são evidentes para a rápida disseminação de material vegetativo de interesse.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a colaboração do laboratorista Sebastião de Castro Evaristo na condução do experimento. As cultivares de capim-elefante, provenientes do BAG da Embrapa Gado de Leite, foram gentilmente cedidas pelo Dr. Antônio Vander Pereira.

² Engenheiro Agrônomo, Ph.D., Pesquisador Embrapa, CNPGL.

³ Engenheiro Agrônomo, MSc., Pesquisador Embrapa-CNPGL.

Recebido para publicação em 25.06.97. Aprovado em 14.01.98

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Out 2007
• Data do Fascículo
  Set 1998

Histórico

• Aceito
  14 Jan 1998
• Recebido
  25 Jun 1997