Modificações na técnica de digestibilidade in vitro para avaliar forragens de baixa qualidade

Modification on technique for in vitro digestibility to assess low quality forage

MODIFICAÇÕES NA TÉCNICA DE DIGESTIBILIDADE IN VITRO PARA AVALIAR FORRAGENS DE BAIXA QUALIDADE¹

MODIFICATION ON TECHNIQUE FOR IN VITRO DIGESTIBILITY TO ASSESS LOW QUALITY FORAGE

Simone de David Antonio² Maria Beatriz Fernandez Gonçalves³ Luis Maria Bonnecarrère Sanchez⁴ Alfredo Acosta Backes⁵ Lisiane Furtado da Silva⁵

RESUMO

Dois experimentos foram desenvolvidos no Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), para estudar modificações na técnica de digestibiüdade in vitro para avaliar forragens de baixa qualidade. O experimento I consistiu na determinação dos coeficientes de digestibilidade in vivo da matéria orgânica (MO), envolvendo 10 fenos de gramíneas tropicais e 2 palhas provenientes da colheita de grãos. No experimento II, determinaram-se os coeficientes de digestibilidade in vitro através da técnica proposta por TILLEY and TERRY (1963), tratamento M1- 48 horas de incubação com inóculo ruminal (fermentação microbiana) + 48 horas de incubação com pepsina (fermentação enzimática) e estudaram-se modificações sobre esta, denominadas: M2- prolongação no período de incubação (de 48h para 96h), com renovação do inóculo ruminal, após 48h de incubação, (adição de novo inóculo sobre a fase sólida das amostras, após centrifugação e desprezada a fase líquida); M3- 96h de incubação com inóculo ruminal, com reinoculação, após 48h de incubação, (adição de novo inóculo sobre as amostras, sem a centrifugação e retirada da fase líquida); M4- 96h de incubação com inóculo ruminal diluído, com renovação do inóculo; M5- 96h de incubação com inóculo ruminal diluído, com reinoculação; M6- 96h de incubação com inóculo ruminal, renovação do inóculo e prolongação no período de incubação com pepsina (de 48h para 72h) e M7- 96h de incubação com inóculo ruminal, reinoculação, digestão com pepsina de 72 horas. Foi efetuada a análise de correlação entre as médias dos coeficientes de digestibilidade in vivo e a digestibilidade in vitro das modificações, para todas as forragens e a análise de regressão sobre o tratamento que apresentou correlações altas e significativas. Pelos resultados obtidos, pode-se constatar que o método in vitro de TILLEY and TERRY (1963) não apresentou boa precisão para estimar a digestibilidade de forragens de baixo valor nutritivo e que, dentre as modificações testadas, a com 96h de fermentação com líquido de rúmen (LR), com reinoculação do LR após 48h de incubação + 48h com pepsina (M3), foi a que demonstrou melhor eficiência para estimativa da digestibilidade.

Palavras-chave: digestibilidade, forragens, baixa qualidade.

SUMMARY

Two experiments were undertaken at the Department of Animal Science at UFSM in arder to study in vitro digestibility technique modifications to assess low quality forages. Experiment I consisted of organic matter (OM) in vivo digestibility coefficients estimation, involving 10 tropical grass hay and two grain harvest straws. On Experiment II, one determined the in vitro digestibility coefficients through the TILLEY and TERRY technique (1963), MJ treatment - 48 hours of incubation with ruminal liquor (microbian fermentation) + 48 hours of pepsin incubation (enzymatic fermentation) and one studied the modifications over this technique named as M2 - incubation period delay (from 48h to 96h), with ruminal liquor renewal after 48h of incubation (new ruminal liquor addition over the solidphase of the samples, after centrifugation and liquid phase disregard); M3 - 96h of incubation with ruminal liquor with reinoculation after 48h of incubation (new liquor addition over the samples, without the centrifugation and liquid phase withdrawai); M4 - 96h of incubation with diluted ruminal liquor, with liquor renewal; M5 - 96h of incubation with diluted ruminal liquor with reinoculation; M6 - 96h of incubation with ruminal liquor, liquor renewal and pepsin incubation period delay (from 48 h to 72h) and M7 - 96h of incubation with ruminal liquor, reinoculation, digestion with 72h pepsin. A correlation analysis was undertaken between in vivo digestibility coefficient means and in vitro digestibility from the modifications to overall forages and a regression analysis over the treatment that presented high and significant correlations. From the results that were determined one could find that TILLEY and TERRY (1963) in vitro method does not present good precision to estimate low nutritional value forage digestibility and that among the tested modifications that one with 96h of fermentation with ruminal liquor (LR), with LR reinoculation after 48h of incubation + 48h with pepsin (M3) was the one that demonstrated to have the best efficiency to estimate the digestibility.

Key word: digestibility, low quality forage.

INTRODUÇÃO

Tem-se consciência da necessidade, cada vez maior, de se conhecer o valor nutritivo dos alimentos para poder utilizá-los, da melhor forma possível, em formulação de rações, de maneira a possibilitar o melhor desempenho animal e eficiência produtiva. Através das análises químicas bromatológicas, pode-se obter uma noção da composição nutricional de um alimento, mas somente através da digestibilidade, pode-se ter uma ideia melhor da qualidade e do valor nutritivo do mesmo. Atualmente, o método de avaliação da digestibilidade dos alimentos, utilizando animais (in vivo), é o único capaz de fornecer valores com alto grau de confiabilidade. No entanto, é dispendioso, demorado e apresenta limitações quanto à avaliação simultânea de um grande número de alimentos.

A técnica de digestibilidade in vitro em duas fases, desenvolvida por TILLEY & TERRY (1963) na Inglaterra, é a mais utilizada em todo o mundo. Apresenta um alto coeficiente de correlação com a técnica in vivo e também um erro médio padrão da estimativa menor, quando utilizada na avaliação de forragens de alta qualidade, POTT (1976). No entanto, FAY et al (1989a), observaram que a técnica de TILLEY & TERRY (1963), quando usada para alimentos de baixa qualidade, apresenta baixos coeficientes de correlação entre a digestibilidade in vitro e in vivo. Os autores justificam esta diferença de resultados entre in vitro e in vivo, pelo fato da Técnica de TILLEY & TERRY (1963) ter sido desenvolvida para avaliar forragens de média e alta qualidade.

Pela necessidade de maior conhecimento sobre a digestibilidade de alimentos forrageiros de espécies tropicais e palhas da resteva de lavoura, e também pela importância econômica que estas forragens possuem em muitas regiões, deve-se procurar aperfeiçoar e/ou desenvolver métodos mais eficientes na determinação da digestibilidade in vitro. Devido a isto, conduziu-se o presente trabalho com o objetivo de estudar modificações na técnica de digestibilidade in vitro desenvolvida por TILLEY & TERRY (1963), a fim de melhorar sua precisão, quando empregada na avaliação de alimentos de baixo valor nutritivo.

MATERIAIS E MÉTODOS

O experimento I foi conduzido no período compreendido entre maio e novembro de 1994. Os tratamentos, constituíram-se de 12 tipos de fenos de baixa qualidade (Tabela 1), que formaram as dietas dos animais. Os fenos de gramíneas tropicais foram confeccionados em diferentes estádios de crescimento das plantas e os fenos provenientes de resteva de lavoura foram obtidos após colheita de grãos. Foram avaliados os seguintes fenos: Feno de capim papuã (Brachiaria plantaginea (Link) Hitchc.) - estádio de maturação de semente; feno de pensacola (Paspalum notatum Flugge) - Cotrijuí; feno de milheto (Penni- setum americanum (L.) Leeke) - Cotrijuí; feno de bermuda (Cynodon dactylon (L.) Pers. coast cross l) - UFSM, estádio vegetativo, 45 dias de diferimento - (feno de bermuda C); feno de bermuda {Cynodon dactylon (L.) Pers. coast cross l) - Cotrijuí A, estádio vegetativo - (feno de bermuda A); feno de bermuda (Cynodon dactylon (L.) Pers. coast cross l) - Cotrijuí B, estádio de florescimento - (feno de bermuda B); feno de capim elefante (Pennisetum purpureum Schumach.) - cortado com l,0m. de altura - (feno de capim elefante l); feno de capim elefante {Pennisetum purpureum Schumach.) - cortado com l,60m. de altura - (feno de capim elefante 2); feno de setária (Setaria sphacelata) - estádio vegetativo - (feno de setária l) e feno de setária (Setaria sphacelata) - estádio de florescimento - (feno de setária 2); Feno de palha de arroz (Oriza sativa L.) - (palha de arroz) e feno de aveia (Avena sativa L.) + azevém (Lolium multiflorum Lam.) - (palha de aveia + azevém).

Os alimentos na forma de feno foram picados em desintegrador de forragem, para evitar a seleção e facilitar o consumo por parte dos animais. Para o estudo da digestibilidade in vivo, foram utilizados 24 ovinos machos, castrados, da raça Corriedale, com idade de 18 a 24 meses. Sendo a condução do experimento de digestibilidade in vivo, com ovinos, em gaiolas metabólicas, realizada seguindo-se as recomendações feitas por HARRIS (1970), técnica padrão.

O delineamento experimental utilizado foi o de blocos completos ao acaso, sendo cada bloco representado pelo período de duração de cada ensaio de digestibilidade in vivo (3 ensaios in vivo), com dois animais por tratamento em cada bloco.

O experimento II foi conduzido no período compreendido entre dezembro de 1994 a junho de 1995. Os tratamentos foram compostos da combinação de dois fafores: 12 alimentos x 7 métodos (- sendo um a técnica de TILLEY & TERRY (1963), modificado por ALEXANDER (1967) e por PIRES et al. (1979), e os outros constituídos pelas 06 modificações na técnica de digestibilidade in vitro), em que: M1 - 48 horas de incubação com inóculo ruminal + 48 horas de incu- bação com pepsina, (técnica de TILLEY & TERRY, 1963); M2 - 96 horas de incubação com inóculo ruminal, com renovação do inóculo, após 48 horas de incu- bação + 48 horas de incubação com pepsina; M3 - 96 horas de incubação com inóculo ruminal, com reinoculação do inóculo, após 48 horas de incubação + 48 horas de incubação com pepsina; M4 - 96 horas de incubação com inóculo ruminal diluído, com renovação do inóculo, após 48 horas de incubação + 48 horas de incubação com pepsina; M5 - 96 horas de incubação com inóculo ruminal diluído, com reinoculação do inóculo, após 48 horas de incubação + 48 horas de incubação com pepsina; M6 - 96 horas de incubação com inóculo ruminal, com renovação do inóculo, após 48 horas de incubação + 72 horas de incubação com pepsina; M7 - 96 horas de incubação com inóculo ruminal, com reinoculação do inóculo, após 48 horas de incubação + 72 horas de incubação com pepsina. Em todas as modificações foi utilizada fonte de Nitrogênio (uréia adicionada na saliva artificial).

A renovação do inóculo ruminal foi realizada após 48h de fermentação, e consistiu na adição de novo inóculo ruminal sobre a fase sólida das amostras, após estas sofrerem centrifugação e ter sido desprezada a fase líquida. A reinoculação, também efetuada após 48h de fermentação, consistiu na adição de novo inóculo sobre as amostras, sem a centrifugação do material e a retirada da fase líquida. A diluição do inóculo foi na proporção de 1ml de líquido de rúmen para 50 ml de saliva artificial (modificação de Den BRAVER, 1977).

Os alimentos constituíram-se de 12 tipos de fenos, os mesmos utilizados no ensaio de digestibilidade in vivo, descritos no experimento I. A amostragem do alimento oferecido para cada animal foi realizada diariamente, compondo uma única amostra para o período, de onde se retirou uma subamostra para a digestibilidade in vitro. Foi utilizado um bovino, dotado de fístula ruminal, alimentado com uma dieta de feno de alfafa e água à vontade, como doador de líquido de rúmen.

O delineamento experimental utilizado foi blocos ao acaso, sendo que cada bloco era representado por uma corrida , num total de 3; utilizou-se o esquema fatorial 7 x 12 (7 métodos x 12 alimentos) com 2 amostras para cada tratamento. Os dados das digestibilidades foram submetidos à análise de variância, análise de correlação e análise de regressão.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Através da análise de variância dos coeficientes de digestibilidade in vivo da matéria orgânica, observou-se que houve diferenças significativas entre os alimentos avaliados. A média da digestibilidade in vivo, obtida em seis repetições, para MO de cada um dos 12 alimentos avaliados, com seus respectivos coeficientes de variação, são apresentados na Tabela 2. Os valores médios de digestibilidade da MO variaram de 43,37% a 58,96%, com coeficientes de variação de 1,91% a 9,84%. Observa-se que os coeficientes de variação apresentaram valores considerados aceitáveis, ou seja, abaixo dos 10% para todos os alimentos avaliados. Variações muito grandes foram constatadas por BARNES (1965) e CHIFFLET & ROSSO (1993), entre animais nos ensaios in vivo. Estas variações individuais são de maior magnitude quando os animais consomem forragens de baixa qualidade (Van ES and Van DER MEER, 1980).

Os coeficientes médios de digestibilidade in vitro da matéria orgânica (MO), para cada uma das modificações e tipo de forragem, são apresentados na Tabela 3. Pela análise de variância, observou-se que houve diferenças significativas entre as corridas (blocos), entre alimentos e entre os métodos estudados. O coeficiente de variação da matéria orgânica foi de 11,98%. Também constatou-se que a interação alimento X método foi altamente significativa (P < 0,0001), indicando que as forragens apresentaram comportamento diferenciado para a digestibilidade, em função do método estudado.

Foi efetuada a análise de correlação entre as médias dos coeficientes de digestibilidade in vivo e os coeficientes in vitro obtidos com as modificações no método de TILLEY & TERRY (1963), da matéria orgânica dos 12 tipos de forragens utilizadas. Tabela 4. A modificação (M3) - que consistiu em 96h de fermentação com líquido ruminal (LR), com reinoculação do LR após 48h de incubação, + 48h com pepsina, apresentou o melhor coeficiente de correlação: 0,80 para DIVMO (P < 0,0017). Logo em seguida, a modificação (M6) - caracterizada por 96h de fermentação com líquido ruminal (LR), com renovação do LR após 48h de incubação, + 72h com pepsina, teve coeficientes de correlação com valor de 0,60 para DIVMO (P<0,04).

Para as demais modificações, que também testaram o aumento no tempo de fermentação com líquido ruminal, os valores de correlação foram baixos e não significativos. Discordando de GRANT et al. (1974), que avaliando alimentos tropicais, submetidos aos períodos de fermentação de 48, 72 e 96h in vitro, constataram diferenças altamente significativas na digestibilidade da matéria seca, para cada 24 h de aumento no período de fermentação. Também HOLECHEK et al. (1986), quando utilizaram vários períodos de digestão microbiana (0, 4, 8, 24, 36, 60, 72, 84, e 96h), como também o período padrão de 48h, constataram que o período de 36h para leguminosas e 72-96h para as gramíneas poderia fornecer estimativas da digestibilidade in vivo mais precisas do que o período padrão de 48 horas.

A análise de regressão foi efetuada sobre os métodos M3 e M6 que apresentaram coeficientes de correlação (r) altos e significativos. A equação de regressão para o coeficiente de digestibilidade da MO pelo método M3 foi Yi = 26,91 + 0,46Xi onde, (Yi)= coeficiente de digestibilidade determinado com a técnica in vivo, (Xi)= coeficiente de digestibilidade determinado com a técnica in vitro, com erro padrão da estimativa (S_y.x = 3,11) e coeficiente de determinação (r² = 0,64). Para o método M6, a equação de regressão foi Yi = 41,41 + 0,18Xi, com erro padrão da estimativa (S_y.x = 4,16) e coeficiente de determinação (r² = 0,36). BARNES (1965) também encontrou erros padrões da estimativa da digestibilidade, variando de 2,0 a 4,0 para estimativa da digestão in vivo, pelos resultados in vitro. Também afirmou que uma equação de regressão, para ser de uso prático, deveria ser capaz de predizer a digestibilidade com um erro padrão não maior que 2 unidades absolutas de digestão. Como no tratamento M6, também FAY et al. (1989a) e FREITAS et al. (1990) encontraram valores mais adequados de digestibilidade in vitro, quando houve aumento no tempo de fermentação microbiana e enzimática para forragens de baixa qualidade , sendo que o período de fermentação ruminal (LR) de 96h +72 h com pepsina foi o que apresentou resultados mais confiáveis.

No presente trabalho, o método M1, de TILLEY & TERRY (1963), apresentou correlação baixa e não significativa com os coeficientes de digestibilidade in vivo, não sendo possível realizar a análise de regressão. No entanto, REID et al. (1973), através da técnica de TILLEY & TERRY, (modificada por BARNES, 1969), estudaram a relação entre a DMS in vivo e DIVMS, de amostras de gramíneas e leguminosas em vários estádios de crescimento. Encontraram uma correlação significativa de 0,74 e equação de regressão, Y= 33,17 + 0,64X, e erro padrão da estimativa (S_y.x = 4,40), para o conjunto de todos os dados. Em um trabalho posterior com três forragens tropicais, os autores obtiveram uma equação de regressão: Y = 29,00 + 0,56X, e S_y.x = 3,20, para a relação entre digestibilidade da MS in vitro e in vivo obtida com ovinos.

Também os métodos (M4 e M5) que utilizaram inóculo ruminal diluído (1 ml de LR + 50ml de saliva artificial de McDougal, FAY et al., 1989b) na incubação das amostras de forragem, não apresentaram resultados satisfatórios de digestibilidade in vitro, quando comparados com os coeficientes de digestibilidade in vivo. Entretanto, FAY et al. (1989b), que trabalhando com inóculo diluído (simulando o inóculo proveniente de um animal alimentado com forragem de baixa qualidade), juntamente com a adição de uréia e aumento do tempo de incubação para 96h, obtiveram aumento na digestibilidade in vitro para as forragens de baixa qualidade (DMS in vivo - 36,1 a 51,9%).

FREITAS et al. (1990), utilizando 96h de fermentação com líquido ruminal diluído ( l ml LR + 50ml de saliva artificial, com ou sem uréia), mais 72h de incubação com pepsina, para estimar a digestibilidade in vitro de amostras de feno de hemártria (Hemartria altissima), silagem de milho {Zea mayz) e feno de alfafa (Medicago sativa), observaram uma subestimação da digestibilidade in vitro da MO para os alimentos testados, embora os dados tenham sido obtidos em apenas uma corrida experimental.

Acredita-se que as diferenças e variações ocorridas entre os métodos para estimar a digestibilidade in vitro de forma precisa, devam-se a fatores relacionados à própria técnica laboratorial, empregada rotineiramente no laboratório onde foi desenvolvida a pesquisa, técnica esta que apresenta grande manipulação de ordem humana. Também, cabe discutir os fatores de maior variação que são diretamente ligados aos procedimentos descritos pela técnica in vitro original e que são amplamente abordados na literatura. Os fatores de maior importância que podem ter contribuído nos resultados finais são: tipo do animal doador de LR, variação no LR de dia para dia, temperatura e anaerobiose no recipiente de fermentação durante a manipulação do inóculo, pH do inóculo, temperatura de secagem das amostras, período decorrente da extração do LR até a incubação e quantidade de inóculo adicionado ao recipiente de incubação.

CONCLUSÕES

O método de digestibilidade in vitro proposto por TILLEY & TERRY (1963) não apresenta boa precisão para estimar a digestibilidade de alimentos de baixa qualidade (DMO< 55%). As técnicas de digestibilidade in vivo devem ser reavaliadas, e deve-se estabelecer uma padronização para melhor efeito de comparação entre os resultados obtidos em diferentes pesquisas. O aumento no tempo de fermentação ruminal associado à reinoculação do inóculo ruminal, mais a digestão enzimática, apresenta melhor eficiência para estimar a digestibilidade das forragens de baixo valor nutritivo. É necessário realizar um maior número de ensaios de digestibilidade, testando-se modificações sobre a técnica in vitro, para melhorar a eficiência da mesma com forragens de baixa qualidade.

² Zootecnista, Aluno do Curso de Pós-graduação em Zootecnia da UFSM. Rua Demétrio Ribeiro, 227, 97070-270, Santa Maria, RS. Autor para correspondência.

³ Zootecnista, Mestre, Professor Assistente, Departamento de Zootecnia da UFSM.

⁴ Engenheiro Agrônomo, Doutor, Professor Titular, Departamento de Zootecnia da UFSM.

⁵ Acadêmicos do Curso de Zootecnia da UFSM.

Recebido para publicação em 21.10.97. Aprovado em 27.05.98

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¹

Parte da Dissertação do primeiro autor apresentada à Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) para obtenção do título de Mestre em Zootecnia.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Out 2007
• Data do Fascículo
  Dez 1998

Histórico

• Aceito
  27 Maio 1998
• Recebido
  21 Out 1997