Herpesvírus bovino tipo 1 no sêmen

Bovine herpesvirus-1 in semen

HERPESVÍRUS BOVINO TIPO 1 NO SÊMEN

BOVINE HERPESVIRUS-1 IN SEMEN

Maurilio Andrade Rocha¹ Aurora Maria Guimarães Gouveia² Rômulo Cerqueira Leite¹

- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA -

RESUMO

O herpesvírus bovino tipo 1 (HVB-1) é o agente causador da rinotraqueíte infecciosa bovina, além de estar associado a doenças do trato genital em bovinos. A transmissão do HVB-1 através da inseminação artificial (IA) pode ocasionar problemas reprodutivos nas vacas inseminadas, como endometrite, infertilidade, absorção embrionária e abortos. Animais infectados tornam-se portadores vitalícios do HVB-1 e podem apresentar episódios intermitentes de reexcreção viral. O HVB-1 poder ser encontrado no sêmen de touros, independente do desenvolvimento de anticorpos neutralizantes. Uma vez que os testes sorológicos não são suficientes para se estimar a presença do HVB-1 no sêmen e que as condições de processamento e armazenamento do sêmen são ideais para a preservação do vírus, somente o exame individual das partidas pode assegurar a comercialização de sêmen livre do vírus. Testes laboratoriais para detecção do HVB-1 no sêmen bovino e medidas adicionais para controlar a transmissão do vírus através da IA são apresentados.

Palavras-chave: rinotraqueíte infecciosa bovina, herpesvírus bovino 1, sêmen, latência, inseminação artificial.

SUMMARY

Bovine herpesvirus 1 (BHV-1) is the causative agent of infectious bovine rhinotracheitis (IBR) and is also associated with genital disease in cattle. BHV-1 transmission by artificial insemination (AI) may cause reproductive problems in inseminated cows, such as endometritis, infertility, embryonic absorption and abortion. Infected animals are lifelong reservoirs of BHV-1 and may go through intermittent episodes of virus reexcretion. It is important to note that conditions of semen storage are optimal for virus survival. Additionally, BHV-1 can be found in bovine semen despite of the development of neutralizing antibody. Since serological tests are not sufficient to ascertain the presence of the virus in semen, the laboratory testing of all semen batches for BHV-1 is the only way to ensure the BHV-1-free status of the semen for commercialization. Laboratory tests used for BHV-1 detection in bovine semen and additional approaches to prevent the spread of BHV-1 through AI are presented.

Key words: infectious bovine rhinotracheitis; bovine herpesvirus 1, semen, latency, artificial insemination.

INTRODUÇÃO

O herpesvírus bovino tipo 1 (HVB-1), causador da Rinotraqueíte Infecciosa Bovina (IBR), é membro da família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae. Seu genoma consiste de uma fita dupla de DNA de aproximadamente 137-139 kpb (FIELDS & KNIPE,1992). Estudos de restrição enzimática possibilitaram a divisão do HVB-1 em três subtipos: HVB-1.1, HVB-1.2a e HVB-1.2b (MILLER et al.,1991). A importância biológica desta classificação não está bem definida, porém uma menor virulência tem sido indicada para o subtipo 2b, o qual parece não causar aborto, enquanto os subtipos BHV1.1 e BHV1.2a têm sido isolados de fetos bovinos abortados (MILLER et al.,1991).

A infecção pelo HVB-1 pode resultar em diversas manifestações clínicas, incluindo doença respiratória, vulvovaginite (KENDRICK et al., 1958), balanopostite (STUDDERT et al., 1964) e diminuição nos índices de fecundação (ELAZHARY et al.,1980). Formas nervosas da doença, há até pouco tempo atribuídas ao HVB-1, são atualmente atribuídas a um tipo diferente de vírus, classificado como herpesvírus bovino tipo 5 ou HVB-5 (ROIZMANN et al., 1992).

A vulvovaginite pustular infecciosa das vacas e a balanopostite infecciosa dos touros já eram reconhecidas na Europa desde antes de 1900, mas a sua importância econômica era subestimada, uma vez que o único sinal clínico detectado era uma breve interferência sobre a eficiência reprodutiva (MILLER et al.,1991). Porém, na década de 1950, pesquisadores americanos reconheceram o papel do HVB-1 como causador também de uma grave infecção do trato respiratório superior de bovinos, a rinotraqueíte infecciosa bovina, conhecida pelas iniciais IBR ("Infectious Bovine Rhinotracheitis"). A enfermidade foi descrita nos EUA pela primeira vez por MILLER (1955), e o primeiro isolamento do vírus a partir de animais com doença respiratória ocorreu naquele país em 1956 (MADIN et al.,1956).

O primeiro isolamento do HVB-1 no Brasil foi realizado em 1978 (ALICE,1978) a partir de pústulas vaginais de vacas no estado da Bahia. No mesmo ano, MUELLER et al. (1978) conseguiram isolar o vírus a partir do rim de um feto bovino proveniente de um matadouro em São Paulo. A partir daí, vários autores vêm relatando a presença do agente em rebanhos bovinos brasileiros com problemas respiratórios, reprodutivos e neurológicos (MUELLER et al.,1979; GALVÃO,1984; RIETCORRÊA et al.,1989; WEIBLEN et al.,1989; LOVATO et al., 1995a). Os primeiros estudos sorológicos no Brasil foram realizados por GALVÃO et al. (1962/63), que testaram 458 bovinos no estado da Bahia pelo teste de soroneutralização (SN), detectando anticorpos específicos anti-HVB-1 no soro de 34,4% dos animais. Desde então, diversos autores detectaram sorologicamente a presença do HVB-1 em bovinos de vários Estados da Federação, em percentuais variando entre 18,8% e 85,7% (WIZIGMAN et al.,1972; MUELLER et al.,1981; GALVÃO,1984; CASTRO,1988; ANUNCIAÇÃO et al.,1989; RAVAZZOLO et al.,1989; LOVATO et al.,1995b; ROCHA et al.,1995a; FAVA et al., 1997; FILHO et al.,1997).

Latência

Uma característica marcante do HVB-1, e dos alfaherpesvírus em geral, é sua capacidade de estabelecer latência no hospedeiro. Após a infecção primária, o vírus pode apresentar-se na forma latente nos gânglios sacrais (ACKERMANN & WYLER,1984; VAN DER ENGELENBURG et al.,1995) e no gânglio trigêmio (SHEFFY & DAVIES, 1972). A latência é caracterizada pela presença do genoma, ausência de expressão gênica considerável e pela ausência na produção de progênie viral (ENGELS & ACKERMANN, 1996). Dessa forma, os animais infectados tornam-se portadores vitalícios e podem voltar a eliminar o vírus no sêmen durante episódios de reativação viral. Fatores que causem depressão no sistema imunológico do hospedeiro, como estresse ou tratamento com corticóides, podem afetar o estado de latência e propiciar a reativação da infecção (MILLER & VAN DER MAATEN,1987; FIELDS & KNIPE, 1992; MARSI et al.,1996). Mesmo animais clinicamente saudáveis, nos quais a reativação do HVB-1 está ocorrendo, podem apresentar infecções leves ou subclínicas e eliminar grandes quantidades de vírus no sêmen (SNOWDON,1965; VAN DER ENGELENBURG et al., 1995). Esses achados ressaltam o risco de se utilizar touros soropositivos como doadores de sêmen para IA (SHEFFY & KRINSKY, 1973).

Excreção viral no sêmen

Sob condições naturais, os touros são infectados pelas vias aérea ou/e genital. Pequenos nódulos avermelhados na mucosa do prepúcio e do pênis evoluem para pústulas. O pênis torna-se avermelhado e dolorido, podendo o animal apresentar micção freqüente e incapacidade para monta (WEIBLEN,1992). Tem sido postulado que o HVB- 1, por replicar predominantemente na mucosa prepucial e na uretra, contamina o sêmen durante a ejaculação, quando o líquido seminal passa sobre as mucosas infectadas. Isto foi confirmado por VAN DER ENGELENBURG et al. (1993) que encontraram mais de 90% do DNA do HVB-1 no fluido seminal, praticamente não havendo detecção do vírus junto aos espermatozóides.

SNOWDON (1965) isolou o HVB-1 no prepúcio de touros por um período de até 361 dias após infecção experimental. Straub (1967), citado por SPRADBROW (1968), demonstrou que o HVB- 1 pode estar presente na secreção prepucial de touros em títulos de 10⁸ TCID₅₀/ml, podendo facilmente contaminar o sêmen. VAN DER ENGELENBURG et al. (1995), através do método de PCR, verificaram excreção do HVB-1 no sêmen de touros por um período de até 65 dias após infecção experimental. MARSI et al. (1996) detectaram o HVB-1 no sêmen de quatro touros através de PCR por até 18 dias após a infecção experimental primária e por até 14 dias após a reativação experimental da infecção. XIA et al.(1995b), utilizando PCR, detectaram o vírus em sêmen de touros até 40 dias após a inoculação experimental pela via intraprepucial.

Resistência do vírus no sêmen

O HVB-1 é o patógeno viral mais freqüentemente encontrado no sêmen bovino (AFSHAR & EAGLESOME,1990) e sua transmissão tem sido amplamente favorecida pelo desenvolvimento de processos de criopreservação do sêmen, uma vez que as condições de processamento e armazenamento do sêmen são ideais para a preservação do HVB-1. A infectividade do HVB-1 no sêmen pode permanecer conservada por até sete dias em temperatura de 4° C e por cinco dias em temperatura ambiente (DREW et al. 1987). CHAPMAN et al. (1979) demostraram, através do isolamento em cultivo celular e quantificação, não haver perda no título do HVB-1 em sêmen bovino armazenado por mais de um ano em nitrogênio líquido. SPRADBROW (1968), examinando o sêmen de 40 touros provenientes de três centrais de sêmen australianas, isolou o HVB-1 em três ampolas provenientes de uma mesma coleta e descongeladas em épocas diferentes, utilizando cultivo celular de rim bovino. Após 12 meses de armazenamento, o vírus ainda estava presente em uma das amostras na concentração de 10^4.3 TCID₅₀/ml.

Soropositividade

Não existe uma correlação obrigatória entre a presença de infecção pelo HVB-1 e a detecção de anticorpos específicos circulantes, uma vez que tem sido relatada a detecção do HVB-1 em amostras clínicas obtidas de animais soronegativos (HUCK, 1971; PARSONSON & SNOWDON, 1975; KUPFERSCHIMIED et al.,1986; XIA et al.,1995a; GEE et al.,1996). SCHULTZ et al. (1976) citam três possibilidades em que o vírus pode ser detectado no sêmen de touros soronegativos: a) animais susceptíveis com infecção ativa e excretando o vírus antes do desenvolvimento de anticorpos ; b) baixa sensibilidade do teste em detectar reduzidos níveis de anticorpos; c) alguns animais infectados podem desenvolver a imunidade celular sem resposta humoral mensurável. Desta forma, apesar de ser um importante instrumento para detecção de infecção, a pesquisa de anticorpos constitui-se em uma forma incompleta de se determinar a presença do HVB-1 no sêmen.

O uso generalizado de vacinas convencionais anti-HVB-1 não parece ter reduzido a prevalência da infecção. Por outro lado, um grande número de animais soropositivos tem sido detectado nos testes sorológicos, sem poder ser realizada a diferenciação entre animais infectados e vacinados. Vacinas marcadas permitem essa diferenciação e parecem ser mais indicadas, principalmente para uso em touros de centrais e em programas de erradicação do HVB- 1 (FLORES et al., 1993; VAN OIRSCHOT et al., 1996).

Infecção em touros de centrais de IA

BOECKX et al. (1968) detectaram o HVB-1 em touros de uma central de IA localizada na Bélgica, através de testes de isolamento e neutralização viral. Os autores verificaram que os animais inseminados com sêmen dessa central apresentavam baixas taxas de concepção. KNOBLAUCH (1962) não verificou interferência sobre as taxas de concepção ou sobre a qualidade do sêmen obtido de touros soropositivos ao HVB-1 de uma central de IA. HUCK (1971) isolou o HVB-1 a partir de “swab” prepucial de 4 touros de uma central de IA, sendo que um destes animais apresentava sorologia negativa no momento do isolamento viral. GÓLAN et al.(1990) realizaram estudos sobre a infecção pelo HVB-1 em touros alojados em centrais de sêmen, localizadas na província de Santa Fé, Argentina. Os autores isolaram e identificaram o HVB-1 como causador de efeito citopático (ECP) em sete dentre 40 amostras estudadas. VAN OIRSCHOT et al. (1993), estudando uma central de sêmen holandesa na qual nenhum sinal clínico de IBR havia sido observado, verificaram que pelo menos 75 touros de um total de 116 examinados apresentavam infecção subclínica pelo HVB-1, sendo o vírus isolado de 43 amostras de sêmen destes animais. Os autores verificaram eliminação intermitente do vírus no sêmen. GEE et al.(1996) relataram um surto de infecção pelo HVB-1 em touros de uma central de IA holandesa supostamente negativa para HVB-1. Dois animais mostraram sinais clínicos de IBR, tendo o HVB-1 sido detectado em “swab” nasal através de PCR. Subseqüentemente, o DNA do vírus foi detectado através de PCR em "swabs" nasais provenientes de outros 23 animais. Tem sido também relatada a infecção pelo HVB-1 em touros alojados em centrais de IA localizadas em diversos países, como África do Sul (MARÉ, 1961), Alemanha (STRAUB & MÄCKLE,1965), Austrália (SPRADBROW, 1968), Dinamarca (AUTRUP & BITSCH, 1978), Noruega (SAXEGAARD, 1966) e Suíça (BRUNNER et al.,1988).

WEIBLEN et al.(1991) descreveram isolamentos de HVB-1 em sêmen e “swabs” prepuciais de touros de uma central de IA brasileira, onde alguns animais vieram a apresentar sinais clínicos em um período de 13 dias após o primeiro isolamento. ROCHA et al. (1995a, 1997) detectaram infecção subclínica pelo HVB-1 em touros de uma central brasileira de IA. Os autores detectaram anticorpos específicos em 60,7% dos touros examinados através de testes de soroneutralização, verificando-se inclusive um caso de soroconversão, além de terem isolado o vírus em 20 dentre 101 amostras de sêmen, sem que nenhum touro apresentasse sintomatologia clínica. PITUCO (1988) detectou anticorpos específicos em 72,5% de 131 touros alojados em centrais de IA em São Paulo, Minas Gerais e Rio Grande do Sul, através de testes de soroneutralização. PASSOS et al. (1992) não observaram soroconversão nem isolaram o vírus do sêmen de touros soropositivos alojados em uma central brasileira de IA, durante dois anos de estudo.

Efeitos do uso de sêmen contaminado sobre a reprodução

A inseminação artificial com sêmen contaminado pode ocasionar sérias perdas reprodutivas às vacas inseminadas. KENDRICK & McENTEE (1967), inseminando 12 vacas com sêmen artificialmente contaminado pelo HVB-1, detectaram 10 vacas com endometrite, lesões nos ovidutos e encurtamento do ciclo estral (abaixo de 18 dias). Cinco animais apresentaram encistamento do corpo lúteo, sendo que 11 vacas falharam na concepção. WHITE & SNOWDON (1973) examinaram taxas de fertilidade em 149 vacas de 20 rebanhos. Animais inseminados com sêmen contaminado pelo HVB-1 apresentaram taxa de não retorno ao serviço de 13,4% comparada com uma taxa de 60,8% quando sêmen não contaminado foi utilizado. Das vacas que retornaram ao serviço, 22,1% apresentaram encurtamento do ciclo estral (<18dias). PARSONSON & SNOWDON (1975), utilizando sêmen livre e contaminado pelo HVB-1 e também touros livres e contaminados pelo vírus, observaram baixa taxa de fecundação (40%) e necessidade de 4,5 serviços por concepção no grupo de vacas que recebeu sêmen contaminado através da IA, em comparação aos outros grupos. Entre as vacas do grupo que apresentou baixa taxa de concepção, 28% dos animais exibiram encurtamento do ciclo estral e sinais clínicos de vulvovaginite pustular infecciosa (VPI). Vacas cobertas naturalmente por touros infectados apresentaram sinais clínicos de VPI e uma taxa de concepção de 89%, com baixa interferência na fertilidade; as cobertas por touros normais apresentaram taxa de concepção de 100%, sem nenhum sinal clínico. ELAZHARY et al (1980) isolaram o HVB-1 do conteúdo uterino de oito vacas de um grupo de 11 animais com baixa taxa de prenhez e alto número de serviços por concepção. O touro utilizado no programa de reprodução do plantel eliminava o vírus no sêmen. MILLER & VAN DER MAATEN (1984) observaram endometrite necrótica, corpo lúteo cístico, necrose focal do corpo lúteo em novilhas inoculadas com HVB-1 pela via intra-uterina. KUPFERSCHIMIED et al.(1986) relataram a contaminação de vacas através da inseminação com sêmen importado, contaminado pelo vírus, proveniente de touro soronegativo. As vacas inseminadas apresentaram taxas de não retorno ao cio 10% abaixo da média do rebanho, além de soroconversão. O risco de transmissão da doença através da transferência de embriões parece ser de menor importância (PHILPOTT, 1993).

Detecção laboratorial do vírus no sêmen

O isolamento viral em cultivo de células é o método laboratorial de diagnóstico mais utilizado para a detecção do HVB-1 no sêmen (AFSHAR & EAGLESOME, 1990). DREW et al. (1987) conseguiram detectar 1 TCID₅₀ de HVB-1 em sêmen artificialmente contaminado. Segundo os autores, o cultivo em microplacas de 24 cavidades se mostrou mais adequado do que o cultivo em tubos Leighton para o estudo de grandes quantidades de amostras. O isolamento viral a partir de sêmen pode apresentar algumas dificuldades, como citotoxicidade, contaminação bacteriana, (DARCEL & COULTER, 1976; ROCHA et al., 1995b) e perda da capacidade infectiva do material durante a coleta, diluição e processamento da amostra (FLORES & WEIBLEN, 1989). A diluição do sêmen antes da inoculação no cultivo vem apresentando bons resultados no sentido de se eliminar os efeitos tóxicos do sêmen sobre os cultivos celulares (LOEWEN & DARCEL, 1985). BRUNNER et al. (1988) conseguiram detectar 5 TCID₅₀/0,5 ml de sêmen artificialmente contaminado pelo HVB-1, utilizando a pré-diluição do sêmen.

A técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR) vem sendo apontada como uma alternativa para a detecção laboratorial de diversos microrganismos (BELAK & BALLAGI-PORDÁNY, 1993). Recentes pesquisas vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de se estabelecer uma PCR sensível e rápida na detecção do HVB-1 em sêmen, para uso na rotina laboratorial. VAN DER ENGELENBURG et al.(1993), YASON et al., (1995) e ROCHA et al., (1998) obtiveram sensibilidade de 0,05 TCID₅₀/50µl, 1 TCID₅₀/50µl e 0,001 TCID₅₀/50µl em seus testes, respectivamente. Por ser um teste bastante sensível, procedimentos rigorosos de controle são recomendados para se evitar contaminações durante a realização da PCR (KWOK,1990).

Medidas de controle

A infecção pelo HVB-1 torna-se mais crítica em touros reprodutores de centrais de sêmen, uma vez que o vírus permanece viável no sêmen congelado e pode ser distribuído para diversas propriedades que utilizam programas de inseminação artificial. Uma vez demostrado que nem todas coletas de sêmen de um animal estão necessariamente contaminadas, somente o exame individual das partidas coletadas pode assegurar que o sêmen a ser comercializado é livre de HVB-1, mesmo quando obtido de touros infectados (SHEFFY et al.,1973; KUPFERSCHIMIED et al.,1986; AFSHAR & EAGLESOME,1990). SHEFFY et al.(1973) recomendam, como medidas de controle nas centrais de coleta de sêmen, o recrutamento de touros soronegativos sempre que possível; manutenção de touros soropositivos sob condições livres de estresse; cuidadosa observação clínica para sinais de recrudescência e teste das coletas de sêmen suspeitas de contaminação pelo HVB-1. SCHULTZ et al. (1976) recomendam não coletar sêmen de touros com sinais de IBR, não tratar animais soropositivos com corticóides e mantê-los em situações de baixo estresse. KUPFERSCHIMIED et al. (1986) recomendam novo exame sorológico para touros exportadores de sêmen quatro a seis semanas após a coleta, e antes da comercialização do sêmen. AFSHAR & EAGLESOME (1990) recomendam somente coletar sêmen de touros soropositivos quando estes não estiverem apresentando sinais clínicos de IBR; testar número representativo de amostras de sêmen de cada dia de coleta para a presença do HVB-1; liberar o sêmen congelado para inseminação somente após a confirmação do estado negativo e, principalmente, tentar estabelecer um plantel livre de anticorpos para o HVB-1. O uso de vacinas marcadas tem sido indicado para permitir diferenciação entre anticorpos induzidos por vacinação ou por infecção natural (KAASHOEK et al., 1995). Segundo GEE et al.(1996) todos os touros alojados em centrais de inseminação artificial oficialmente aprovadas pela Comunidade Européia devem ser soronegativos para o HVB-1, devido ao fato de os animais infectados se tornarem portadores vitalícios do vírus.

CONCLUSÃO

A infecção pelo herpesvírus bovino 1 pode ocasionar importantes perdas reprodutivas em bovinos, principalmente quando transmitida através da inseminação artificial. Uma vez que os touros com infecção latente podem voltar a eliminar o vírus no sêmen durante episódios de reativação viral e que as condições de processamento e estocagem do sêmen são ideais para a preservação do HVB-1, tornase desaconselhável o uso de touros soropositivos como doadores de sêmen. Alternativamente, medidas adicionais de manejo devem ser empregadas nesses animais. A vacinação de touros doadores de sêmen deve ser evitada, porém, se adotada, devem ser utilizadas vacinas anti-HVB-1 com marcadores antigênicos, por permitirem a diferenciação entre animais vacinados e naturalmente infectados. A associação entre detecção laboratorial de amostras de sêmen contaminadas pelo HVB-1 e a adoção de medidas adicionais de manejo dos touros doadores de sêmen pode contribuir substancialmente para o controle da transmissão do HVB-1 através da inseminação artificial. Apenas o exame individual das partidas de sêmen coletadas para a presença do vírus pode assegurar a comercialização de sêmen livre de HVB-1.

² Médico Veterinário; Doutor, Professor Adjunto, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Escola de Veterinária, UFMG, CP. 567, 30161-970, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil. Autor para correspondência. Email: [e-mail].

Recebido para publicação em 01.04.98. Aprovado em 09.12.98

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Médico Veterinário, Doutor, Professor Adjunto, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva - Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Dez 2006
• Data do Fascículo
  Jun 1999

Histórico

• Aceito
  09 Dez 1998
• Recebido
  01 Abr 1998