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Ciência Rural

Print version ISSN 0103-8478

Cienc. Rural vol.29 no.3 Santa Maria July/Sept. 1999

http://dx.doi.org/10.1590/S0103-84781999000300002 

METODOLOGIA PARA PRODUÇÃO DE Metarhizium anisopliae (METSCH.) SOROKIN EM CULTIVO SUBMERSO: ESPORULAÇÃO DA BIOMASSA, EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE AÇÚCAR E CUSTO DO INOCULANT1

 

METHODOLOGY FOR PRODUCTION OF Metarhizium anisopliae (METSCH.) SOROKIN IN SUBMERGED CULTIVATION: BIOMASS SPORULATION, SUGAR CONCENTRATION EFFECT AND INOCULANT COST

 

Sonia Regina de Mello Pereira2 Augusto Ferreira da Eira3

 

 

RESUMO

Desenvolveram-se um método de cultivo e um meio de cultura para produção massal do fungo Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, 1883, com maior pureza e concentração de conídios. Este método envolveu o cultivo submerso da linhagem M-61 do entomopatógeno em meio líquido de arroz parboilizado, extrato de levedura, extrato do percevejo da soja (Nezara viridula (L., 1758) Hemiptera, Pentatomidae), sob seis diferentes níveis de concentração de açúcar (0, 2, 4, 6, 8, 10g l-1), além do meio convencional sólido de arroz em grão. As biomassas obtidas foram separadas através de tela de nylon (63 mesh) e dispostas em estufa para a esporulação. Os efeitos dos tratamentos foram avaliados pelos parâmetros pesos fresco e seco do micélio, número de conídios por grama de substrato, viabilidade e patogenicidade dos conídios sobre o percevejo. Observou-se que 2.0g l-1 de açúcar em meio de cultura de extrato de N. viridula produziu o dobro do número de conídios por grama de substrato em relação à concentração de 10.0g l-1, a um custo 51 vezes inferior ao obtido no processo convencional de produção do fungo. A viabilidade não foi afetada nos diferentes meios utilizados. Não ocorreram diferenças significativas na patogenicidade em função dos meios de cultura e métodos de cultivo.

Palavras-chave: Metarhizium anisopliae, cultivo submerso, custo de produção, Nezara viridula.

 

SUMMARY

A method of cultivation and a culture medium were developed aiming at the mass production of fungus Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin, 1883, with great concentration and purity of conidia. This method involved the M-61 strain of entomopathogenic fungus in liquid medium of rice, yeast extract, soybean bug extract (Nezara viridula (L., 1758) Hemiptera, Pentatomidae), under six differents concentrations of sugar (0, 2, 4, 6, 8, 10g l-1), and the solid conventional medium of rice grains. The biomasses obtained were filtered and put in an incubator to promote sporulation. The treatments were evaluated through the parameters wet and dry-weight of micelium, number of conidia per gram of substrate, viability and pathogenicity of conidia against the bug. It was observed that the sugar concentration of 2.0g l-1 in extract of N. viridula produced two times more conidia per gram of substrate when compared to 10.0g l-1, and 51 times cheaper than the conventional process of production of fungus. Viability was not affected by the different culture media. Significant differences did not occur in the pathogenicity among culture media and cultivations methods.

Key words: Metarhizium anisopliae, submerged cultivation, production cost, Nezara viridula.

 

 

INTRODUÇÃO

A produção, em larga escala no Brasil, do fungo M. anisopliae teve início na região dos canaviais nordestinos, objetivando o controle biológico da cigarrinha da cana-de-açúcar, Mahanarva posticata (Stal, 1855).

A produção do fungo em meio sólido de arroz em grão foi comprovada por GUAGLIUMI et al. (1974), COSTA et al. (1974) e VILLACORTA (1976); assim como em meio sólido de farinha de arroz (COSTA & MAGALHÃES, 1974; FRIGO & AZEVEDO, 1986).

A partir da década de 60, algumas pesquisas direcionaram-se para a produção de fungos entomopatogênicos em cultivo submerso, visando à produção de maior número de conídios infectivos a um menor custo, visto ser esta a condição essencial para o uso de microrganismos no controle biológico de insetos (ADAMEK, 1965). Este método utiliza meio líquido inoculado disposto em agitador a 150 rpm. A biomassa é filtrada, lavada com água destilada, pesada e desidratada. A reidratação de amostra da biomassa fornece material para os testes de viabilidade (ADAMEK, 1965; ROBERTS, 1966; BARNES et al., 1975). Na literatura nacional, os trabalhos sobre produção do fungo em cultivo submerso diferem quanto a esta metodologia, pois não se promove a agitação (BASTOS CRUZ et al., 1983; GREGHI, 1987); os frascos são expostos à luz por 10 horas por dia (BASTOS CRUZ et al., 1985) e vários meios líquidos à base de melaço, farinha de soja e sais minerais são utilizados (ALVES, 1986).

Desta forma, observa-se que os autores ignoraram que sob cultivo submerso não ocorre esporulação e, para a obtenção de conídios, era necessário deixar os sistemas em repouso (ALVES, 1986), ou trabalharam apenas com a biomassa desidratada e, portanto, sem conídios.

No presente trabalho, estudou-se os efeitos de meios de cultura e de diferentes concentrações de açúcar na produção massal de M. anisopliae.

 

MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi realizado no Departamento de Defesa Fitossanitária da Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP, Campus de Botucatu (SP). Utilizou-se a linhagem M-61 do fungo M. anisopliae, cedida pelo Centro Nacional de Pesquisa de Soja - CNPSo de Londrina (PR). A criação do percevejo Nezara viridula (L., 1758) foi mantida de acordo com a metodologia descrita por CORRÊA-FERREIRA (1985).

Os meios de cultura utilizados foram: meio sólido de arroz em grão (50% de umidade); meio líquido de extrato de arroz parboilizado em pó (1,5%); meio líquido de extrato do percevejo N. viridula (0,2%) e glicose (1,0%), além das diferentes concentrações de sacarose comercial (0, 2, 4, 6, 8 e 10g l-1) apenas para o meio líquido de extrato do percevejo e meio líquido de extrato de levedura (0,2%). Para a preparação do meio natural de extrato de N. viridula, os percevejos, secos em estufa a 105 ± 5°C por 24 horas, foram fragmentados em gral de porcelana, fervidos por 10 minutos em água destilada e o extrato foi filtrado em gase esterilizada e acrescido dos ingredientes restantes. Todos os meios de cultura foram autoclavados a 120°C por 30 minutos.

Nos diferentes tratamentos, os frascos receberam 1,0ml da suspensão de conídios de Metarhizium (106con ml-1) obtidos nos respectivos meios sólidos, e foram incubados em agitador rotatório (114rpm) por 72 horas à temperatura de 27 ± 1°C. O conteúdo dos frascos foi filtrado por sistema de kitassatos associados a uma bomba aspirante (vácuo). Um funil de porcelana com tela de nylon (63 mesh) separou os "pellets" produzidos. Assim, cada biomassa recebeu os respectivos tratamentos de lavagem: sem lavagem, uma lavagem (500ml) com água destilada e duas lavagens (500ml cada) com água destilada.

A esporulação deu-se em câmara de crescimento a 26 ± 1°C, umidade relativa de 65 a 85% e fotoperíodo de 16 horas, durante 72 horas. A biomassa foi desidratada em estufa a 32°C e fluxo de aeração de 0,01 l l-1 min-1, durante 48 horas. A partir destas, obtiveram-se as suspensões de conídios.

Prepararam-se quatro repetições para o meio sólido de arroz em grãos, seis para os meios com diferentes concentrações de açúcar e dezoito para os demais meios. A viabilidade dos conídios foi verificada em três repetições por tratamento, pela contagem de conídios germinados e não germinados em 10 campos aleatórios por placa.

Para a avaliação da patogenicidade do fungo sobre o percevejo, utilizaram-se gaiolas de PVC branco com 75mm de diâmetro e 5cm de altura com tela de malha fina numa das extremidades e dispostas em placa de Petri contendo papel filtro. Três potenciais de inóculo (2,3x105, 2,3x106 e 2,3x107conídios ml-1) foram aplicados com pulverizador de Vilbs, em quatro repetições de 15 insetos por tratamento, em experimento inteiramente casualizado. Dos insetos mortos, reisolou-se o patógeno, segundo metodologia descrita por ALVES (1986).

Para a estimativa do custo por grama de substrato de cada meio de cultura, têm-se: coleta manual do percevejo (300 insetos homem-1 hora-1, 1g de peso seco = 7 insetos) corresponde a US$ 0,00091g-1; glicose a US$ 0,00136g-1; extrato de levedura a US$ 0,00273g-1; sacarose comercial a US$ 0,00055g-1; e arroz parboilizado a US$ 0,00064g-1.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O fungo M. anisopliae produziu maior quantidade de matéria fresca e seca em meio de extrato do percevejo (tabela 1). A metodologia proposta com o emprego desse meio de cultura líquido natural é bastante promissora (BASTOS CRUZ et al., 1983; BATISTA FILHO et al., 1985), já que a melhor avaliação da produção de biomassa fúngica é através do parâmetro peso seco (LATGÉ, 1980; BASTOS CRUZ et al., 1983; CAMPBELL et al., 1983; GREGHI, 1987). Observa-se que, na ausência da lavagem, os pesos frescos e secos representam a quantidade de biomassa produzida pelo fungo e os sólidos solúveis em suspensão, cujos valores se reduzem de acordo com o número de lavagens. COCHRANE (1958) e FRIGO & AZEVEDO (1986) mencionam que substratos pobres levam à indução de esporulação de fungos com maior produção de conídios.

 

 

Verifica-se que a produção de biomassa em meio de N. viridula não diferiu quando utilizou-se 2,0 g l-1 ou 10,0 g l-1 de sacarose comercial (tabela 2) e que a concentração de 2,0g l-1 sobressaiu-se quanto ao número de conídios produzidos (tabela 2), com um custo 51 vezes inferior ao meio convencional (tabelas 3 e 4). Cabe ressaltar que uma das características mais desejáveis de um meio de cultura para produção de conídios infectivos a determinado inseto é a produção do maior número possível de conídios por grama de substrato a um menor custo (ADAMEK, 1965; GOETTEL, 1984).

 

 

 

 

Com uma lavagem, embora os pesos da matéria seca no meio de extrato de N. viridula e de arroz tenham sido iguais, a produção de conídios foi menor no meio de arroz (tabela 1), confirmando a hipótese do meio de cultura natural de um inseto poder proporcionar melhor desempenho do microrganismo em termos de produção de conídios (NAHAS & ARAI, 1987). Também o uso de meios naturais complexos pode evitar a seleção de mutantes nutricionais menos patogênicos muito comum quando se utiliza meios artificiais (MARSHALL, 1915; POCHON & BARJAC, 1958; STANIER et al., 1969).

O número médio de conídios produzidos por grama de substrato em meio de arroz em grão foi inferior ao meio de N. viridula, utilizando-se a técnica de esporulação proposta neste trabalho, enquanto que a viabilidade e a patogenicidade foram similares (tabela 5, tabela 6). Alguns trabalhos preconizam resultados similares de esporulação, entretanto a técnica utilizada foi em bandejas, mantendo-se o sistema em repouso de tal forma que a biomassa esporulasse apenas na superfície (BASTOS CRUZ et al., 1985; ALVES, 1986). Entretanto, os fungos não esporulam em cultivo submerso (LILLY & BARNET, 1951; COCHRANE, 1958; METZ & KOSSEN, 1977; EIRA, 1981), mas somente com a disposição da biomassa sob aeração direta é que ocorre a estimulação da esporulação, tal como observado neste trabalho. Na literatura consultada, os estudos relativos ao processo de produção do fungo M. anisopliae em meio líquido não ousaram processar a biomassa em condições favoráveis à esporulação, nem tampouco a produziram em verdadeiro cultivo submerso. Estas técnicas são realmente vantajosas em termos biotecnológicos e são muito comuns, inclusive, em trabalhos sobre tratamento de efluentes da indústria de chapas de madeira (EIRA, 1981), na microbiologia industrial (PRESCOTT & DUNN, 1959; RHODES & FLETCHER, 1969; JORGENSEN, 1978) e em outros processos industriais (METZ & KOSSEN, 1977).

 

 

 

 

Verifica-se que a viabilidade dos conídios nestes ensaios não foi influenciada pelos tratamentos realizados (tabela 1 e 2, tabela 5). Nos testes de patogenicidade, a interação entre os meios de cultura e os potenciais de inóculo não evidenciaram diferenças em relação aos tratamentos empregados (tabela 6). Verificou-se que o contato direto dos insetos com os conídios não foi suficiente para provocar infecção, apesar da concentração empregada ter sido eficaz contra Ceratitis capitata (GARCIA et al., 1984) e Diatraea saccharalis (ALMEIDA & ALVES, 1982). É possível que as diferentes respostas do inseto ao patógeno estejam relacionadas à necessidade de nutrientes específicos para o início da germinação dos conídios (SAMUELS et al., 1989), à adaptação e conseqüente especificidade de uma linhagem do fungo a determinada espécie de inseto hospedeiro (FERRON et al., 1972; FERRON & ROBERT, 1975; TULLOCH, 1976; BARBOSA et al., 1985) e aos métodos e condições de inoculação e às fases de desenvolvimento do inseto (FOLEGATTI et al., 1990).

 

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1 Parte da Dissertação de Mestrado em Proteção de Plantas do primeiro autor, Faculdade de Ciências Agronômicas da Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP. Bolsa de estudos concedida pela CAPES.

2 Engenheiro Agrônomo, Mestre em Proteção de Plantas, Doutorando em Fitotecnia, Departamento de Horticultura e Silvicultura, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, CP 776, 91501-970, Porto Alegre, RS. E-mail: sonmello@pro.via- rs.com.br. Autor para correspondência.

3 Engenheiro Agrônomo, Professor Titular, Departamento de Defesa Fitossanitária, Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista.

Recebido para publicação em 16.07.97. Aprovado em 11.11.98