Diversidade antigênica entre amostras de Arcobacter spp isoladas de suínos no Rio Grande do Sul e presença de anticorpos aglutinantes em amostras de soro de porcas com problemas reprodutivos

Antigenic diversity among strains of Arcobacter spp isolated from pigs in Rio Grande do Sul, Brazil and presence of agglutinin titers in serum samples of sows with reproductive problems

DIVERSIDADE ANTIGÊNICA ENTRE AMOSTRAS DE Arcobacter spp ISOLADAS DE SUÍNOS NO RIO GRANDE DO SUL E PRESENÇA DE ANTICORPOS AGLUTINANTES EM AMOSTRAS DE SORO DE PORCAS COM PROBLEMAS REPRODUTIVOS

ANTIGENIC DIVERSITY AMONG STRAINS OF Arcobacter spp ISOLATED FROM PIGS IN RIO GRANDE DO SUL, BRAZIL AND PRESENCE OF AGGLUTININ TITERS IN SERUM SAMPLES OF SOWS WITH REPRODUCTIVE PROBLEMS

Sérgio José de Oliveira¹ David Emilio Santos Neves de Barcellos² Sandra Maria Borowski³

RESUMO

O teste de aglutinação microscópica, usando a técnica descrita para o diagnóstico de leptospirose, foi utilizado para verificar a antigenicidade de 47 amostras de Arcobacter cryaerophilus e duas amostras de Arcobacter butzleri isoladas de suínos no Rio Grande do Sul, Brasil, em frente a soros hiperimunes produzidos em coelhos a partir de amostras padrões das bactérias. Verificou-se grande heterogeneidade antigênica e apenas quatro amostras provocaram títulos acima de 1.600 com os anti-soros padrões. A classificação genética dos microorganismos foi confirmada no teste em 48,97% dos antígenos. Igualmente, utilizando a técnica de aglutinação microscópica, foram testadas amostras de soro de porcas que apresentaram problemas reprodutivos, procedentes de granjas de onde foram isoladas amostras de Arcobacter spp. Não existe registro anterior na literatura sobre o uso do referido teste em infecções por Arcobacter spp. Os exames sorológicos em fêmeas suínas reprodutoras revelaram títulos de até 1.600, possibilitando indicar que houve a presença de aglutininas para Arcobacter spp.

Palavras-chave: diversidade antigênica, teste de aglutinação microscópica, Arcobacter spp, suínos.

SUMMARY

Microscopic Agglutination Test (MAT) described as a diagnostic test for Leptospirosis was used to check antigenicity on 47 samples of Arcobacter cryaerophilus and two samples of Arcobacter butzleri isolated from pigs in Rio Grande do Sul, Brazil. Rabbit antisera used in the test were produced against reference strains of Arcobacter spp. Antigenic heterogenicity among the samples was shown. Only four samples provoked titres higher than 1.600 with standard antisera. 48.97% of the antigens confirmed the genetic classification of the microrganisms. MAT was used also to identify serum samples from sows with reproductive problems from farms where Arcobacter spp had been isolated. There is no reference in the literature on the use of the test as diagnostic tool in Arcobacter infections. Serologic tests in sows showed titres as high as 1,600, suggesting that there was presence of agglutinins in serum samples.

Key words: antigenic diversity, microscopic agglutination test, Arcobacter spp, pigs.

INTRODUÇÃO

O gênero Arcobacter foi assim denominado por VANDAMME et al. (1991) e compreende bactérias anteriormente incluídas no gênero Campylobacter, as quais devido às características de aerotolerância e crescimento em baixas temperaturas, distinguiam-se das demais espécies de Campylobacter. As espécies que têm sido isoladas com maior freqüência são Arcobacter cryaerophilus, anteriormente denominada Campylobacter cryaerophilus, descrita em 1985 (NEILL et al.,1985), que foi cultivada de animais em ocorrências de problemas reprodutivos e Arcobacterbutzleri, isolada de casos de enterite em seres humanos (VANDAMME et al., 1992a). Mais raramente tem sido isolada de animais a espécie Arcobacter skirrowii (VANDAMME et al., 1992b). Relatos sobre a ocorrência de Arcobacter spp são restritos a poucos países. No Brasil, foram isoladas amostras de A. cryaerophilus em 1994 (OLIVEIRA et al., 1994) de fetos suínos abortados e, posterior-mente, as bactérias foram isoladas também de órgãos genitais de reprodutores suínos, bem como A. butzleri (OLIVEIRA et al., 1995; 1997; 1998). Esses foram os primeiros relatos sobre a presença das bactérias em casos de problemas reprodutivos em suínos em nosso país.

A classificação de amostras de Arcobacter spp tem sido realizada através de técnicas utilizadas em biologia molecular (KIEHLBAUCH et al., 1991; 1994; WESLEY et al., 1995; HARMON & WESLEY, 1996; SCHROEDER-TUCKER et al., 1996), sendo poucas as tentativas de estudos sobre a antigenicidade. Foi utilizado teste de aglutinação em lâmina para classificação de amostras de Arcobacter (Campylobacter) cryaerophilus isoladas de suínos (JAHN, 1983) e não houve reações cruzadas entre amostras de A. cryaerophilus e C. fetus,C. coli e C. jejuni.

Foi observada grande variação antigênica em amostras de A. cryaerophilus isoladas de casos de aborto e infertilidade em suínos, no teste de aglutinação em lâmina ante soro de porcas (SADTLER & SCHIMMELPFENNIG, 1990). Os autores verificaram que porcas com aborto anterior e das quais haviam sido isoladas as bactérias, apresentaram títulos sorológicos mais elevados que aqueles animais sem problemas reprodutivos.

O teste de aglutinação em tubos (BOUDREAU et al., 1991) teve como referência o método usado por LIOR & WOODWARD (1991) e foi observado que em comparação com a sorologia para C. jejuni e C. coli, um sistema de identificação para A. cryaerophilus parece ser mais complicado devido à elevada heterogeneidade antigênica entre as amostras da bactéria.

LIOR & WOODWARD (1991) desenvolveram um esquema de sorotipagem para Arcobacter butzleri, consistindo no uso de antígenos vivos e anti-soros adsorvidos, em teste de aglutinação em lâmina.. Através dos testes, foram reconhecidos 14 sorogrupos. Amostras de Arcobacter butzleri isoladas de crianças em uma escola na Itália (VANDAMME et al., 1992a) foram classificadas pelo esquema de LIOR & WOODWARD (1991) como pertencendo ao sorogrupo 1.

Como se observa, até o momento, pouco tem sido realizado no sentido de classificar por sorologia amostras de bactérias do gênero Arcobactere os resultados têm revelado grande variação antigênica através de testes de aglutinação em lâmina e em tubos. No presente trabalho, foi utilizado o teste de aglutinação microscópica, visando a estabelecer diferenças antigênicas entre amostras de Arcobacter spp isoladas de suínos no Rio Grande do Sul, bem como verificar a ocorrência de reações sorológicas em reprodutoras suínas em granjas de onde foram isoladas as bactérias.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizadas 49 amostras de Arcobacter spp, classificadas anteriormente por RFLP - "Restriction Fragment Length Polymorphism" (OLIVEIRA et al., 1997) como A. cryaerophilus 1B (33 amostras), A. cryaerophilus 1A (14 amostras) e duas amostras de A. butzleri, originárias de suínos de sete granjas com problemas reprodutivos e de suínos de abate em frigorífico, como segue: cinco amostras isoladas de fetos abortados, da granja A; uma amostra isolada de feto e duas de corrimentos vaginais de porcas da granja B; três de úteros e cinco de ovidutos de porcas da granja C; cinco de úteros, três de ovidutos e uma de placenta de porcas da granja D; uma de útero, uma de oviduto de porcas e duas de líquido prepucial de reprodutores da granja E; três de fetos abortados da granja F; uma de corrimento vaginal de porca da granja G; 16 amostras isoladas de líquido prepucial de suínos machos castrados abatidos em frigorífico, cuja origem não foi conhecida. Foram testadas no total 49 amostras de Arcobacter spp através do teste de aglutinação microscópica (COLE et al., 1973) usando a técnica descrita para o diagnóstico de leptospirose. Foram preparados soros hiperimunes em coelho, no National Animal Disease Center (NADC - PO Box 70, Ames, Iowa, USA ), obtidos através da inoculação de amostras padrões de A. cryaerophilus 1A (Neill, 02766 ATCC), A. cryaerophilus 1B (CDC 2610- ATCC), A. butzleri (CDC 2686 - ATCC) e A. skirrowii (B. Pasteur). A partir de cada amostra de Arcobacter spp isolada de suínos, foram preparados antígenos através do cultivo em meio líquido de BHI em tubos, incubados durante 48 horas. Os cultivos vivos foram utilizados no teste como antígenos.

O teste de aglutinação microscópica consistiu em verificar a ocorrência de aglutinação, ao microscópio de campo escuro, entre os antígenos e as diluições dos soros padrões. Foram feitas diluições de cada soro hiperimune a partir de 1:10 até 1:12.800. Alíquotas de 50µl de cada diluição foram depositadas juntamente com igual quantidade de cada antígeno, nas cavidades de placa para microtitulação. Foram preparados padrões negativos para cada amostra, isto é, misturas de antígeno e salina, sem soro. A leitura foi feita após 2 horas de incubação a 30°C, comparando-se gotas de padrões negativos com gotas de cada uma das diluições de soro com os antígenos, sendo examinadas sobre lâmina de vidro ao microscópio, com aumento de 200 vezes.

Utilizando-se a técnica de aglutinação microscópica foram testadas 19 amostras de soro de porcas que apresentavam problemas de reprodução, procedentes de uma das granjas de onde foram isoladas amostras de Arcobacter spp. Para a realização do teste de aglutinação microscópica em porcas da granja D, cujo resultado consta na tabela 1, foram escolhidos antígenos representantes de Arcobacter spp isolados de suínos das diferentes granjas estudadas, de fetos abortados (amostras FFT, F3T e FFAT) de suínos machos (SP24, SP37 e SPR3) e fêmeas (U10T, OP3 e O6TP), incluindo amostras de classificação genética A. cryaerophilus 1A, A. cryaerophilus 1B e A. butzleri. As amostras de soro das porcas foram diluídas para a obtenção de título final no teste em frente aos antígenos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A tabela 2 apresenta os resultados dos testes de aglutinação microscópica realizados em 49 amostras de Arcobacter spp em frente a anti-soros preparados a partir de amostras padrões. Observa-se na coluna da direita a classificação genética. A tabela 1 apresenta os resultados dos testes de aglutinação microscópica em soros de porcas da granja D, ante antígenos obtidos desta e de outras granjas. Através da tabela 2, é possível observar que houve grande heterogeneidade antigênica, com algumas amostras sendo negativas ante os soros padrões de Arcobacter spp e apenas quatro amostras induziram títulos acima de 1.600, sugerindo que estas, talvez, possuam semelhança antigênica com as amostras padrões utilizadas na inoculação em coelhos para a obtenção dos soros. JAHN (1983) detectou poucos antígenos comuns entre as amostras de A.cryaerophilus isoladas de suínos, no teste de aglutinação em lâmina. Na observação do autor, 60% das amostras aglutinaram, 20% foram negativas e 20% auto-aglutinaram. BOUDREAU et al. (1991) também observaram grande heterogeneidade antigênica no teste de aglutinação em tubos, e atribuíram ao fato de que as amostras procediam de diferentes origens. Entre 14 amostras de A. cryaerophilus isoladas de casos de aborto em suínos por SADTLER & SCHIMMELPFENNIG (1990), apenas duas possuíam antígenos idênticos.

Na tabela 2, também se observa que houve reações cruzadas em alguns casos com títulos iguais, geralmente baixos (10 ou 50) para mais de um soro. Os antígenos que não aglutinaram em frente a anti-soros preparados com amostras padrões de Arcobacter spp constituíam bactérias classificadas no gênero pelos testes de RFLP (OLIVEIRA et al., 1997; 1998). A classificação genética foi confirmada em 48,97% dos antígenos no teste de aglutinação microscópica. Na tabela 2, pode ser observado que apenas uma amostra isolada de feto (FFT) e duas de divertículo prepucial de suíno castrado (SP30 e SP37) apresentaram títulos elevados com os soros padrões, respectivamente 1.600, 6.400 e 12.800, significando que possuem alguma identidade com as amostras padrões. Os títulos apresentados pelas demais amostras não permitem dizer que tenham a mesma caracterização antigênica das amostras padrões de Arcobacter spp.

Os exames sorológicos em fêmeas suínas reprodutoras, como demonstra a tabela 1, revelaram títulos até 1.600. Em apenas uma amostra de soro, (nº555) os títulos não ultrapassaram a 100 em frente aos nove antígenos, na aglutinação microscópica. Todas as porcas testadas apresentavam histórico de problemas reprodutivos, variando entre falta de concepção (retorno ao cio), aborto entre 50 e 102 dias de gestação e corrimento vulvar (metrite). SADTLER & SCHIMMELPFENNIG (1990) relataram casos de porcas que haviam abortado ou com problemas de fertilidade, das quais havia sido isolado A.cryaerophilus, e que apresentaram títulos sorológicos mais elevados no teste de aglutinação em lâmina que porcas sem problemas de reprodução. Aqui foram testadas apenas porcas que apresentavam infertilidade ou já haviam abortado, mas comprovou-se que as mesmas reagiram no teste de aglutinação microscópica com títulos acima de 50, ocorrendo apenas duas reações negativas, respectivamente da amostra de soro 8507 ante o antígeno SP24 e da amostra 7347 ante o antígeno FFT. Foi constatado, através do teste sorológico em porcas, que o antígeno F3T reagiu com títulos finais mais elevados para o maior número de amostras de soro (13 entre 19). Este antígeno corresponde à amostra de classificação genética A. cryaerophilus 1B, isolada de feto suíno abortado procedente da granja A. Por outro lado, o antígeno FFT, também obtido de A. cryaerophilus 1B isolado de feto suíno abortado da granja A, foi o que apresentou títulos sorológicos mais baixos entre todos os nove antígenos, apresentando apenas um título de 200 em frente à amostra de soro 3157, sendo os demais títulos abaixo de 100. Os antígenos O6TP e SP24, geneticamente classificados como A. butzleri também apresentaram diferenças antigênicas entre si, pois o primeiro reagiu em título de 800 com sete amostras de soro, ocorrendo reações cruzadas com outros antígenos, para cinco amostras, no mesmo título final, ao passo que as reações sorológicas em frente ao antígeno SP24 ocorreram em níveis mais baixos, com apenas uma reação 800 (amostra de soro 3347). Estes e outros resultados que constam na tabela 1 comprovam a grande diferença antigênica entre as amostras, como relatado anteriormente.

Ainda observando a tabela 1, o antígeno SP37, que havia revelado homologia antigênica com a amostra padrão de A. cryaerophilus 1B com título de 12.800 (tabela 2), apresentou título máximo de 800 para apenas uma amostra de soro de porca (3645) e em reação cruzada de mesmo título com outros dois antígenos, reagindo com título de 400 com outras duas amostras de soro; as demais amostras reagiram abaixo de 200 para o antígeno SP37. Este fato sugere que antigenicamente as amostras de A. cryaerophilus que infectaram o rebanho D seriam diferentes da amostra padrão deA. cryaerophilus 1B. A amostra SP37 foi isolada de líquido prepucial de suíno castrado de origem não determinada colhido em frigorífico (OLIVEIRA et al., 1999).

CONCLUSÕES

O teste de aglutinação microscópica, exatamente como utilizado no diagnóstico de leptospirose, foi usado para verificar a antigenicidade de amostras de Arcobacter spp e para identificar rebanho suíno infectado, sendo os primeiros registros da utilização do teste para este gênero de bactérias. Ficou constatado que há grande variação antigênica entre as amostras isoladas de suínos no Brasil, como ocorreu em outros países, conforme relatos anteriores. Através do teste sorológico de aglutinação microscópica em reprodutoras de um rebanho infectado, verificou-se a ocorrência de reações com soro de animais dos quais haviam sido isolados Arcobacter spp.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem a atenção do Dr. Albert L. Baetz e Dr. Irene V. Wesley, do National Animal Disease Center, IA, USA, pelo fornecimento dos soros hiperimunes. À auxiliar de laboratório Jane Mendez Brasil, pelo prestimoso auxílio na realização dos testes sorológicos.

² Médico Veterinário, MSc., Professor, Medicina de Suínos, Faculdade de Veterinária, UFRGS.

³ Médico Veterinário, MSc., Pesquisador, Laboratório de Patologia Suína CPVDF - FEPAGRO.

Recebido para publicação em 27.07.98. Aprovado em 20.1.99

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Dez 2006
• Data do Fascículo
  Dez 1999

Histórico

• Aceito
  20 Jan 1999
• Recebido
  27 Jul 1998