Análises isoenzimáticas em somaclones de morangueiro (fragaria x ananassa Duch.) cv. Vila Nova

Isozymic analyses of somaclones from strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) cv. Vila Nova

ANÁLISES ISOENZIMÁTICAS EM SOMACLONES DE MORANGUEIRO (Fragaria x ananassa DUCH.) cv. VILA NOVA

ISOZYMIC ANALYSES OF SOMACLONES FROM STRAWBERRY (Fragaria x ananassa DUCH.) cv. VILA NOVA

Rejane Flores¹ Beatriz Gomes Rocha² José Antonio Peters³ Eliane Augustin⁴ Gerson Renan de Luces Fortes⁵

RESUMO

Análises isoenzimáticas foram utilizadas para investigar variações bioquímicas em somaclones de morangueiro cultivar Vila Nova, o btidos a partir de calos. Utilizaram-se como amostras folhas jovens de plantas durante a multiplicaç ão in vitro e após a aclimatização em casa de vegetação. Os sistemas enzimáticos utilizados para a análise dos clones foram fosfatase ácida e esterase (pH 6,5 e 8,3). Durante o cultivo in vitro, dois padrões de fosfatase ácida foram detectados entre os regenerantes; já para a esterase, todos os genótipos exibiram o mesmo padrão de bandas. Em casa de vegetação, foram encontrados três padrões de bandas distintos de fosfatase ácida. Não foram verificadas alterações quanto ao número e posição das bandas de esterase em pH 6,5, enquanto que para a esterase em pH 8,3 observou-se polimorfismo entre os clones. Ambos os sistemas enzimáticos mostraram-se influenciados pelas condições de crescimento (in vitro e in vivo) e pelos estádios de desenvolvimento das plantas.

Palavras-chave: morangueiro, cultivo in vitro, variação somaclonal, esterase, fosfatase ácida.

SUMMARY

Isozymic analyses were used to investigate biochemical variations of somaclones from strawberry cultivar Vila Nova, obtained starting from calli. Analyses were performed using young leaves collected from plants during the in vitro multiplication and afther aclimatation at greenhouse. The enzyme systems used for the analysis of the clones consisted of acid phosphatase and esterase (pH 6.5 and 8.3). During the in vitro culture, two patterns of acid phosphatase were detected among the regenerants, however for the esterase all the genotypes exhibited the same pattern of bands. At greenhouse, were found three patterns of bands different for acid phosphatase. Alterations were not verified in relation to the number and band position for esterase (pH 6.5), while, for esterase (pH 8.3) polymorphism was observed among the clones. Both enzyme systems were influenced by the growth condiction (in vitro and in vivo) and by the developing stage of the plants

Key words: strawberry, in vitro culture, somaclonal variation, esterase, acid phosphatase.

INTRODUÇ ÃO

Marcadores bioquímicos, como as isoenzimas possibilitam detectar alterações metabólicas que ocorrem durante o crescimento, desenvolvimento e diferenciação da planta (PRAMANIK et al. 1996). Outras contribuições das isoenzimas para o melhoramento genético vegetal incluem a identificação de cultivares, avaliação de germoplama e uso como marcadores genéticos (TANKSLEY & ORTON, 1983), possibilitando a seleção precoce de genótipos superiores. Em morangueiro, elas têm sido utilizadas para caracterização de cultivares (BRINGHURST et al., 1981; ROCHA et al. 1998), estudo da herança de sistemas enzimáticos (ARULSEKARet al. 1981), análise da variabilidade enzimática em espécies do gênero Fragaria (ARULSEKAR & BRINGHURST, 1983) e na detecção de alterações enzimáticas em somaclones (NEHRA et al., 1992; DAMIANO et al., 1995).

Neste trabalho, dois sistemas enzimáticos foram utilizados para estudar a variabilidade entre somaclones de morangueiro cv. Vila Nova durante o cultivo in vitroe em casa de vegetação.

MATERIAL E MÉTODOS

O trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais e no Laboratório de Eletroforese da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária de Clima Temperado (Embrapa Clima Temperado), Pelotas, RS.

O meio de cultura básico utilizado foi o MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), com 30g

^-1 de sacarose, 100mg^-1 de mio-inositol e 6g ^-1 de ágar. O pH foi ajustado para 5,9.

Para a indução de calos, discos foliares de morangueiro cv. Vila Nova foram cultivados no meio básico, contendo 5mM de 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) e 5mM de BAP (6-benzilaminopurina). O material foi incubado no escuro, em sala de crescimento, com temperatura de 25 ± 2° C por um período de três semanas. Posteriormente, os calos foram mantidos em sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas de luz e radiação de 19 mmol.m^-2.s^-1. Após quatro semanas de cultivo, os calos foram transferidos para meios de regeneração contendo 5mM BAP, 10mM BAP, 15mM de TDZ (thidiazuron) e 10mM de TDZ + 500mg^-1 de caseína hidrolizada (CH). A cultura foi mantida em sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas, radiação de 19m mol.m^-2.s^-1 e temperatura de 25± 2° C durante o restante do cultivo in vitro.

As brotações regeneradas foram individualizadas e denominadas de clones. Os clones representados pela letra A foram provenientes do meio com 5mM de BAP. Os clones com letras B foram regenerados em meio acrescido de 10mM de BAP. A letra C representa o meio contendo 15mM de TDZ e os clones com letra D são provenientes do meio com 10mM de TDZ + 500mg

^-1 de CH. Brotações regeneradas diretamente a partir de meristemas, sem passar pelo cultivo de calos, foram multiplicadas no mesmo meio e representadas pela letra E.

Os clones foram multiplicados no meio MS com nitrogênio reduzido a ¾, 40g

^-1 de sacarose e acrescido de 0,05mM de ANA (ácido a -naftalenoacético), 0,4mM de AG₃ e 2,2mM de BAP. Posteriormente, as plantas foram enraizadas em meio MS isento de reguladores de crescimento e aclimatizadas em casa de vegetaç&atild e;o.

Os sistemas isoenzimáticos utilizados na análise dos clones de morangueiro foram fosfatase ácida (FAC) e esterase (EST). Como amostras, utilizaram-se folhas novas, as quais foram retiradas quinze dias após o subcultivo em meio de multiplicação e 30 dias do plantio em casa de vegetação. Foi adotada a técnica de eletroforese horizontal em gel de poliacrilamida, utilizando o sistema de tampão descontínuo, descrito por SCANDALIOS (1969) em pH 8,3, com a concentração 6% para ambos os sistemas. No preparo dos géis da FAC, foi acrescentado 2% de polietileno glicol. Para o sistema EST, também foi utilizado o tampã o contínuo tris-citrato (pH 6,5), segundo NICHOLS & RUDDLE (1973), na concentração de 5% de poliacrilamida.

Os géis consistiram de 100m do tampão do gel com 5,7g de acrilamida e 0,3g de bis-acrilamida (EST pH 8,3 e FAC) ou 4,75g de acrilamida e 0,25 de bis-acrilamida (EST pH 6,5), acrescidos de 0,10m de N,N,N¢ ,N¢ - tetrametilenodiamina e 1ml de persulfato de amônio a 10%. Foram maceradas dez mg de cada amostra com 10m do tampão do gel, na diluição de 1:1, acrescido de 0,15% de 2-mercaptoetanol e 2,5mg de polivinilpolipirrolidona. As migrações foram feitas aplicando-se uma diferença de potencial de 10v/cm linear. Posteriormente, os eletroforegramas foram imersos em tampão de coloração específico para cada sistema com 20% de acetona, durante um período de 20 minutos.

Para a revelação dos géis, foram utilizados os sistemas de coloração descritos por SCANDALIOS (1969), no escuro e a 37° C durante, aproximadamente, 15 horas. Após a revelação, os géis foram colocados em fixador com água destilada, metanol e ácido acético na proporção de 5:5:1.

O cálculo da mobilidade relativa (MR) para os sistemas enzimá ticos foi realizado registrando as distâncias migradas pelas bandas a partir do ponto de aplica&ccedil ;ão e dividindo-as pela medida de uma banda tomada como padrão, sendo comum a todos os clones.

A estimativa da similaridade genética entre os clones de morangueiro foi realizada através do coeficiente de associação, utilizando o índice de Jaccard (CRISCI & ARMENGOL, 1983). A análise de grupamento dos clones foi feita pelo método da média aritmética não ponderada (UPGMA) analisada através do programa NTSYS – pc (ROHLF, 1989).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As análises de todas as amostras coletadas 15 dias após o subcultivo das plantas em meio de multiplicação apresentaram seis bandas anódicas de FAC, com mobilidades relativas de 1,50; 1,35; 1,25; 1,12; 1,00 e 0,88 (Padrão A). Nos clones A2, A3, A7, A13, A18, B2 e B5, foi detectada, além dessas, uma banda com MR de 0,72 (Padrão B) (Figura 1-A). Os clones foram classificados em dois grupos de acordo com as diferenças observadas (Tabela 1). Verificou-se que a maioria dos clones (68%) apresentaram o mesmo padrão de bandas da testemunha (E) (Padrão A) e 32% apresentaram o padrão B, principalmente os provenientes do meio acrescido de 5mM de BAP.

DAMIANO et al. (1995), estudando organogênese a partir de calos e suspensões celulares em cinco cultivares de morangueiro, também observaram diferenças nos padrões da FAC, peroxidase e glutamato desidrogenase, as quais foram , detectadas entre as cultivares, sendo menos freqüentemente entre os regenerantes de cada cultivar.

Não foram verificadas alterações quanto ao número e posição das bandas de EST em todas as amostras coletadas in vitro. O sistema EST (pH 6,5) apresentou três bandas estáveis e nítidas com MR de 0,33; 0,56 e 1,00. Os zimogramas da EST (pH 8,3) apresentaram duas bandas com MR de 1,00 e 1,03 (Figura 1-A). Embora tenha sido verificada a presença de outras bandas, não foi possível considerá-las na análise, pois devido à alta atividade da esterase durante o cultivo in vitro, , não apresentaram nitidez.

Nas análises da FAC nas plantas, após a aclimatização e transferência para a casa de vegetação, foram encontrados três padrões distintos, com seis a oito bandas (Figura 1-B). Diferente do ambiente in vitro vitro, verificou-se que 59% dos clones (incluindo o E) apresentaram o padrão B (Tabela 2), indicando que o estágio de desenvolvimento das plantas afeta os padrões isoenzimáticos.

Nessas plantas, também não se detectou polimorfismo para a EST (pH 6,5), pois todos os clones apresentaram três bandas com MR de 0,33; 0,56 e 1,00 (Figura 1-B).

O decréscimo na atividade da EST (pH 8,3) nas plantas provenientes da casa de vegetação, permitiu a visualização de diversas bandas polimórficas. Observaram-se sete padrões eletroforéticos para esse sistema, com duas a seis isoenzimas (Figura 1-B). As diferenças observadas permitiram classificar os clones em sete grupos (Tabela 3). A maioria dos clones (50%) apresentou o mesmo padrão do clone E (Padrão A), no qual se detectou o maior número de bandas. Os clones A3, A18, C6 e D15 apresentaram padrões exclusivos, denominados de B, C, E e F, respectivamente. As bandas com MR de 1,03 e 1,00, presentes nas plantas durante o cultivo in vitro, não foram detectadas nos clones A18 e C6 (Tabela 3).

Em macieira, análises isoenzimáticas têm sido ú teis para detectar variabilidade entre os somaclones (MARTELLIet al., 1993). No entanto, de forma semelhante aos resultados obtidos com a cv. Vila Nova, os padrões isoenzimáticos foram bastante influenciados pelas condições de crescimento do material, uma vez que amostras de folhas dos mesmos clones de macieira, crescidos in vitro e in vivo, mostraram diferentes padrões de bandeamento (MARTELLIet al., 1993).

Os padrões de isoenzimas e a intensidade das bandas são específicos para órgãos ou tecidos e para os estádios de desenvolvimento e maturidade. O estádio de desenvolvimento em que aparecem ou desaparecem refletem a ativaç ão ou repressão dos genes que codificam essas isoenzimas (SCANDALIOS, 1974). Essas alterações são refletidas nos padrões de bandas, como foram verificados nos diversos clones.

ROCHA et al. (1998), estudando cultivares de morangueiro sob diferentes condições ambientais (in vitro, casa de vegetação, telado e campo), não observaram diferenças em padrões isoenzimáticos da FAC. Em todas as cultivares (inclusive Konvoy-Cascata e Lassen), os autores detectaram seis bandas monomó rficas, que também foram verificadas na cv. Vila Nova. Essa similaridade pode ser devida à genealogia das cultivares, pois a Vila Nova é proveniente do cruzamento entre Konvoy-Cascata e Lassen.

Estudos demostraram que, durante a morfogênese de Plantago ovata (planta medicinal), apareceram duas novas bandas, as quais estavam ausentes no controle e nas plantas já regeneradas (PRAMANIK et al, 1996). Os autores salientam que estas duas novas formas moleculares da esterase resultam da ativação de genes essenciais durante o processo de multiplicação.

Sabe-se que em experimentos de variação somaclonal baseados em isoenzimas, os padrões devem ser comparados não apenas pela presença ou ausência de bandas, mas pela quantidade de proteína por banda. Neste trabalho, em ambos os sistemas estudados, registraram-se alterações na intensidade das bandas, porém não foram repetitivas, que podem ser decorrentes do estágio de desenvolvimento das folhas analisadas.

Análises isoenzimáticas em somaclones de morangueiro, cv. Redcoat, não demonstraram alterações qualitativas nos padrões de leucina aminopeptidase (LAP), fosfoglucomutase (PGM), fosfoglucose isomerase (PGI) e esterase (EST). No entanto, foram verificadas alterações na intensidade das bandas da EST que, à semelhança do observado neste trabalho, não foram repetitivas (NEHRA et al,, 1992).

Considerando-se os 22 clones e os sistemas enzimáticos da FAC e EST em pH 8,3, estimou-se a similaridade genética entre os clones. Não foi considerado, neste estudo, a EST em pH 6,5, pois não apresentou polimorfismo.

Pela análise de agrupamento dos clones, foi possível classificar os mesmos em dois grupos. O primeiro, foi constituído pela maioria dos clones e dividido em quatro subgrupos. Nota-se, no segundo subgrupo, que quatro clones (B7, B8, B10 e B11) provenientes do meio de regeneração, contendo 10mM de BAP, apresentaram similaridade máxima com o clone testemunha (E). O segundo grupo foi constituído apenas pelos clones A18 e C6, os quais se encontraram mais distantes dos demais (Figura 2).

Os métodos bioquímicos, como a análise de isoenzimas, são amplamente utilizados para detectar polimorfismo genético em várias espécies. Entretanto, a principal limitação dessa técnica é o limitado polimorfismo que elas são capazes de detectar entre populações muito próximas (CROCHEMORE, 1998), o que dificultou a análise dos clones obtidos no presente trabalho. Análises de isoenzimas detectam apenas alterações genéticas que modificam a estrutura (ALFENAS et al.., 1991) e/ou a carga elétrica das proteínas, em regiões do DNA que correspondem a um número limitado de genes que codificam para as enzimas (TORGGLER et al., 1995). Portanto, não cobrem todo o genoma. Por outro lado, estudos baseados no DNA possibilitam a detecção de alterações genéticas, em regiões codificadoras ou não codificadoras (TORGGLER et al., 1995), em qualquer estádio de desenvolvimento da planta e independentemente dos efeitos do meio ambiente. Dessa forma, estudos neste sentido devem ser realizados com o intuito de confirmar e caracterizar possíveis alterações genéticas nos diversos clones obtidos neste trabalho.

CONCLUSÕES

O estádio de desenvolvimento das plantas afeta os padrões isoenzimáticos.

A análise de isoenzimas de fosfatase ácida e de esterase (pH 8,3) possibilitam a identificação de plantas variantes regeneradas a partir de calos.

Ciência Rural, v. 30, n. 6, 2000.

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¹

Biólogo, Mestre em Ciências pela Universidade Federal de Pelotas (UFPel). Rua Floriano Peixoto, 979, 97400-000, São Pedro do Sul, RS. Autor para correspondência.

²

Engenheiro Agrônomo, Doutor na Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Pelotas,RS.

³

Engenheiro Agrônomo, Professor, Doutor, Instituto de Biologia, UFPel.

⁴

Engenheiro Agrônomo, Pesquisador, Doutor, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, RS.

⁵

Engenheiro Agrônomo, Pesquisador, Doutor, Embrapa Clima Temperado, Pelotas, RS.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Ago 2006
• Data do Fascículo
  Dez 2000