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Ciência Rural

versão impressa ISSN 0103-8478

Cienc. Rural v.34 n.1 Santa Maria jan./fev. 2004

http://dx.doi.org/10.1590/S0103-84782004000100022 

ARTIGOS CIENTÍFICOS
CLÍNICA E CIRURGIA

 

Solução hipersaturada de sal ou de glicerina a 98% como conservantes de centros frênicos caninos utilizados na reparação de defeitos musculares em ratos wistar

 

Over saturated salt or 98% glycerin as preservation solutions for canine frenic center utilized in the reparations of muscle lesions in wistar rats

 

 

Maurício Veloso BrunI, 1; Ney Luis PippiII; David DriemeierIII; Emerson Antônio ContesiniIII; Carlos Afonso de Castro BeckIII; Olicies da CunhaIV; Saulo Tadeu Lemos Pinto FilhoV; Claudio RoehsigVI; Rafael StedileVII; Thiago Félix da SilvaVIII

IMédico Veterinário, Mestre, Doutor. Professor da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo (UPF), Campus I, Bairro São José, BR 285, km 171, 99025-000, Passo Fundo, RS. E-mail:mbrun@upf.tche.br
IIMédico Veterinário, Mestre, Doutor, Professor do PPG em Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM)
IIIMédico Veterinário, Mestre, Doutor, Professor do Faculdade de Medicina Veterinária, UFRGS
IVMédico Veterinário Autônomo, Mestre
VMédico Veterinário, Mestre, Professor da Faculdade de Medicina Veterinária, PUC
VIMédico Veterinário, Residente da Universidade Estadual de Londrina
VIIMédico Veterinário, Aluno do PPG em Medicina Veterinária da UFSM
VIIIMédico Veterinário Autônomo

 

 


RESUMO

Com os objetivos de testar a solução hipersaturada de sal (na proporção de 1,5g de sal comercial para 1ml de água tridestilada) como conservante de centro frênico canino e de comparar seus resultados com os da solução de glicerina a 98% utilizada para o mesmo fim, foram realizados implantes dessa membrana em lesões musculares produzidas em 28 ratos Wistar. Previamente às cirurgias, as soluções foram avaliadas quanto à presença de bactérias e fungos, com resultados negativos. Os defeitos foram produzidos em ambos os músculos retos abdominais de cada animal, e posteriormente reparados com centros frênicos conservados. Os ratos foram separados em sete grupos de igual número, sendo sacrificados aos três, cinco, sete, 10, 15, 30 e 60 dias do pós-operatório, o que permitiu as avaliações macro e microscópicas das regiões de implantação. Ao exame macroscópico foi constatado substituição dos implantes por tecido vivo, sem a ocorrência de eliminação dos mesmos. Ao exame microscópico, observou-se que as substituições ocorreram com a deposição de tecido conjuntivo fibroso, sendo que ao final do período de observação, já não existam membranas. Não ocorreram diferenças entre as reações teciduais no local de implantação entre os dois tratamentos. Esses resultados demonstram que os meios de conservação estudados apresentam respostas semelhantes na conservação de centro frênico canino, sendo ambos adequados para tal fim.

Palavras-chave: conservação tecidual, soluções conservantes, aloimplante.


ABSTRACT

Aiming to evaluate the over saturated salt solution (1.5g commercially available salt in 1.5ml of tridestilled water) as tissue conservator of the canine frenic center and to compare its conservator potential with the well-established glycerin 98% conservator solution, peaces of this tissue were implanted to repair produced muscle lesions in 28 Wistar rats. Previously both solutions had been tested for bacterial and fungal contaminations, both exams with negative results. In each experimental animal, lesions were made in both Rectus abdominis muscles and repaired with the tissue preserved in both solutions. The animals were divided in seven groups and sacrificed in three, five, seven, 10, 15, 30 and 60 days after reparation for histological evaluation of the implanted region. In macroscopic exam the complete substitution of the implants by live tissue was observed, without rejection of the implanted tissue. In the microscopic evaluation we observed that the substitutions were made by fibrous conjunctive tissue deposition. At the end of the evaluation period, the implanted membranes were not present in repaired regions. In both conserved tissues there were not differences in tissue reactions. The over saturated salt, and 98% glycerin solutions presented similar results in the canine frenic center preservation indicating that both solutions may be utilized to preserve this membrane.

Key words: tissue preservation, storage solutions, alograft.


 

 

INTRODUÇÃO

Durante muitos séculos, a procura do melhor método para conservação de materiais biológicos vem sendo constante, seja pelo crescente uso dos transplantes homólogos e heterólogos em cirurgia restauradora, seja pela suas vantagens sobre os demais (LEITE et al., 1979).

Os métodos de conservação para os diferentes tecidos animais podem ser classificados em duas grandes categorias: os que mantêm a vitalidade celular e os que não mantêm (LEITE et al., 1979). Neste último grupo, encontra-se a glicerina a 98%, que atualmente é um dos meios mais amplamente utilizados, tanto em casos clínicos quanto em estudos experimentais (DALECK et al., 1992; LAVALLE et al., 1998; COSTA NETO et al., 1999; OLIVEIRA et al., 1999; BRUN et al., 2000; CONTESINI et al., 2001; RAISER et al., 2001). Uma das principais características da glicerina é a capacidade de desidratação celular (PIGOSSI, 1964; PIGOSSI, 1967; ALVARENGA, 1977; DALECK et al., 1987; ALVARENGA, 1992) a qual se atribui a sua ação ação anti-séptica (CHIRIFE et al., 1982), atuando contra fungos e bactérias gran-negativas e gran-positivas, com exceção para as formas esporuladas (PIGOSSI, 1967). Cabe ressaltar que a desidratação obtida com a glicerina não altera a concentração iônica das células, o que mantém a integridade celular (PIGOSSI, 1964).

Tal meio também reduz a antigenicidade dos tecidos conservados (PIGOSSI, 1964; PIGOSSI, 1967; RAZANI et al., 1990), o que dispensa a necessidade de utilização de fármacos imunosupressores durante os períodos trans e pós-operatórios. Após a implantação, os materiais biológicos mantidos em glicerina atuam como uma estrutura de sustentação temporária e orientam o crescimento do tecido vivo no leito receptor (OLIVEIRA et al., 1999; RAISER et al., 2001).

Na busca de um meio de conservação alternativo que apresentasse características desidratantes, anti-sépticas e anti-imunogênicas semelhantes ou superiores à glicerina, trabalhos foram desenvolvidos testando o mel não processado (AMENDOLA et al., 2000; AMENDOLA, 2001), a solução hipersaturada de açúcar (GONÇALVEZ, 2000; MAZZANTI et al., 2001) e, mais recentemente, a solução hipersaturada de sal (BRUN et al., 2002). Estes últimos autores utilizaram uma diluição de 1,5g de sal grosso comercial para cada 1ml de água tridestilada, na qual mantiveram o pericárdio canino por um período mínimo de 90 dias. O meio de conservação demonstrou ausência de bactérias e fungos nos testes de cultura realizados. O implante conservado foi utilizado na reparação de defeitos musculares de 24 ratos Wistar, sacrificados aos três, cinco, sete, 10, 15 e 30 do período pós-operatório. Nos exames macroscópico e microscópico foi demonstrada neovascularização do local reparado, que paulatinamente foi decrescendo. Ao exame microscópico, pode-se constatar a substituição gradativa do implante por tecido conjuntivo fibroso, sem a ocorrência de eliminação do pericárdio ou contaminação. A solução testada demonstrou apresentar propriedades anti-sépticas, além de manter as características estruturais do pericárdio. O implante funcionou como um arcabouço para o crescimento do tecido vivo, sendo completamente reabsorvido.

O presente trabalho teve como objetivos testar a viabilidade da solução hipersaturada de sal como conservante de centro frênico canino, e comparar os resultados da implantação desta membrana quando conservada neste meio ou em glicerina a 98%.

 

MATERIAL E MÉTODO

Os centro frênicos foram coletados de dois cães adultos, sadios, de forma não asséptica, sendo lavados em água corrente e armazenados em frascos limpos contendo solução de glicerina a 98% ou solução hipersaturada de sal, composta de 300g de sal grosso comerciala e 200ml de água tridestilada. Os frascos foram mantidos em temperatura ambiente por um período de 90 dias. Anteriormente às implantações, os líquidos conservantes foram analisados quanto a presença de bacterias e fungos nos meios agar sangue (AS), thioglycollate (TIO), brain heart infusion (BHI), micobiotic e sabouraud chloranphenicol agar.

Foram utilizados 28 ratos Wistar, fêmeas, pesando em média 226,6g (200-288g). Durante o período de experimentação, os animais foram separados em sete grupos de igual número (GI, GII, GIII, GIV, GV, GVI e GVII), e mantidos em gaiolas apropriadas recebendo ração comercial e água ad libitum.

Os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia dissociativa, mantendo-se os animais em decúbito dorsal. Como medicação pré-anestésica foi utilizado cloridrato de xilazinab na dose de 5mg.kg-1, via intramuscular (IM). Na seqüência, os animais receberam cloridrato de cetaminac, via IM, na dose de 50mg.kg-1e ampicilina sódicad, na dose de 20mg.kg-1, via intraperitonial.

Realizou-se uma incisão mediana ventral de 3,5cm de comprimento, até a proximidade da linha alba. O tecido subcutâneo foi dissecado com tesoura de Metzenbaum, permitindo a visibilização de ambos músculos retos abdominais. Inicialmente, foi removido um segmento de 1,5cm de comprimento pela metade da largura do músculo reto abdominal direito, procurando-se não perfurar o folheto interno e o peritônio. Manobra semelhante foi realizada no músculo reto abdominal esquerdo. A lacuna produzida do lado direito foi reparada com centro frênico conservado em solução hipersaturada de sal, enquanto a do lado esquerdo com a membrana conservada em glicerina.

Previamente à implantação, os centro frênicos foram mantidos imersos, em cubas separadas, em solução fisiológicae por um período mínimo de 15 minutos. Teve-se o cuidado de irrigar abundantemente o tecido conservado em sal a fim de se remover o excesso de soluto.

Uma vez hidratados, os centros frênicos foram suturados aos músculos oblíquos abdominais internos, oblíquos abdominais externos e retos abdominais, em padrão contínuo simples com náilon monofilamentar 6-0f. O tecido subcutâneo e a pele foram suturados com o mesmo fio em padrões contínuo simples e isolado simples, respectivamente.

Para se realizar as avaliações macro e microscópicas das regiões implantadas, os animais foram sacrificados com sobredose de tiopental sódicog aos três, cinco, sete, 10, 15, 30 e 60 dias do período pós-operatório, conforme o grupo (GI aos três dias, GII aos cinco dias, e assim sucessivamente). Na análise microscópica, as áreas do implante foram clivadas e incluídas em parafina. Cortes de aproximadamente 3mm foram obtidos em micrótomo vertical e corados pela hematoxilina-eosina e Masson, conforme PROPHET et al. (1992). Nessa análise foram considerados o tipo de reação inflamatória presente, a intensidade de reabsorção do implante e a ocorrência ou não de eliminação do implante.

 

RESULTADOS

Ambas as soluções conservantes demonstraram a inexistência de bactérias ou fungos, uma vez que não ocorreu crescimento desses agentes nos meios de culturas analisados.

Não ocorreram complicações transoperatórias, sendo as implantações realizadas em tempo médio de 33,6 minutos (28-43 min.). No pós-operatório, foi observada deiscência parcial da sutura de pele em dois animais (GII e GIII), sem que esta alteração se estendesse até a região de implantação.

Em todos os animais, foi possível evidenciar os locais de implantação, tanto pela presença do fio de sutura como pela coloração das membranas. Na avaliação macroscópica realizada aos três dias de pós-operatório (GI), observou-se que a membrana conservada em solução hipersaturada de sal apresentava coloração amarelada, enquanto a mantida em glicerina coloração esbranquiçada. Ao decorrer das avaliações, o centro frênico conservado em glicerina tornou-se mais opaco em relação à outra membrana. Esta condição foi melhor evidenciada do décimo quinto dia pós-operatório em diante (GV, GVI e GVII). Durante este mesmo período, tornou-se difícil a delimitação entre o tecido do hospedeiro e os implantes, principalmente na região reparada com o tecido conservado em sal (Figura 1). A vascularização local, que nos animais do GI estava bastante evidente, foi gradativamente decrescendo durante a evolução pós-operatória.

Na avaliação microscópica, observou-se, nos animais do GI, a presença de implantes íntegros circundados por reação inflamatória polimorfonuclear multifocal moderada, associada a infiltrado mononuclear difuso com macrófagos. Essa reação estendeu-se a partir dos centros frênicos até as fáscias musculares profundas. No GII, a reação inflamatória mononuclear associou-se à proliferação de fibroblastos circundando as membranas implantadas, com infiltrados nos feixes musculares. Também se constatou a presença de infiltração mononuclear perivascular. A reação observada nos ratos do GIII não variou de intensidade em relação ao grupo anterior, sendo evidenciada diminuição do tamanho dos implantes, associada a infiltrado mononuclear de fibroblastos e presença de fibrócitos com secreção de colágeno. No décimo dia pós-operatório (GIV), havia proliferação acentuada de tecido conjuntivo fibroso circundando pequenas áreas das membranas implantadas remanescentes, que se estendia ao tecido adjacente. No GV, ainda se evidenciava restos das membranas implantadas, mas a fibrose estava menos acentuada em comparação ao grupo anterior. Em três animais, já não existiam implantes, apenas tecido fibroso. Aos 30 dias (GVI) as observações foram semelhantes. Nos ratos do GVII evidenciou-se ausência do implante associada a formação de uma tênue camada de tecido conjuntivo. Durante todos os períodos de observação, não foram constatadas variações nas reações inflamatórias ou na reabsorção do implante entre os dois tratamentos. Evidenciou-se também que os implantes foram absorvidos mais lentamente nos locais onde se formaram pequenas dobras (junto à área de sutura). A figura 2 demonstra alterações microscópicas observadas em diferentes grupos.

 

DISCUSSÃO

As amostras coletadas de ambos os conservantes apresentaram resultados negativos quanto à presença de bactérias e fungos, não havendo crescimento destes agentes nos meios analisados ou no tecido dos animais. A ação anti-séptica da glicerina tem sido comprovada em diferentes trabalhos (PIGOSSI, 1964; PIGOSSI, 1967), podendo ser mantida por períodos superiores a 10 anos (BRUN et al., 2000). De forma semelhante ao presente estudo, BRUN et al. (2002) demonstraram que a solução hipersaturada de sal, na proporção de 1,5g para 1ml de água tridestilada, quando utilizada para a conservação de tecidos por período inferior ao supracitado também possui esta ação, provavelmente explicada pela diminuição da atividade de água. Nesse aspecto, a solução de sal analisada pode apresentar vantagens em relação a outros meios alternativos, uma vez que se constatou a presença de bacilos no mel não processado (AMENDOLA, 2001) e que ainda não é possível descartar que a solução hipersaturada de açúcar, na proporção de 3g para 1ml de água tridestilada, destrua completamente os contaminantes bacterianos (MAZZANTI et al., 2001).

O tempo de hidratação de 15 minutos para o tecido conservado em glicerina segue as indicações de SARTORI FILHO et al. (1997). A membrana conservada em sal foi hidratada pelo mesmo período, conforme a constatação prévia de BRUN et al. (2002). Em ambos os casos, os implantes tornaram-se maleáveis e aparentemente mantiveram sua resistência. Devido à comprovada ação anti-séptica dos dois meios, observadas em estudos anteriores (PIGOSSI, 1964; PIGOSSI, 1967; DALECK et al., 1987; BRUN et al., 2002) e no presente trabalho, optou-se pela não inclusão de antibióticos na solução hidratante. Conduta semelhante é indicada por GONÇALVES (2000) e MAZZANTI et al. (2001) e demonstra ser apropriada.

Nas observações macroscópicas e microscópicas nos diferentes tempos, evidenciaram-se a ausência de eliminação do implante e sua progressiva substituição pelo tecido do tecido do hospedeiro. Este padrão de resposta tem sido constatado após a implantação de materiais biológicos conservados em diferentes meios, como a glicerina (DALECK et al.,1988; RANZANI et al.,1990; COSTA NETO et al., 1999; OLIVEIRA et al., 1999; MAZZANTI et al., 2000; RAISER et al., 2001), o mel não processado (AMENDOLA et al., 2000; AMENDOLA, 2001), a solução hipersaturada de açúcar (GONÇALVES, 2000; MAZZANTI et al., 2001), a solução hipersaturada de sal (BRUN et al., 2002), e comprova que o centro frênico canino conservado na solução estudada atua como arcabouço para o desenvolvimento do tecido vivo.

A manutenção do implante nos sete primeiros dias pós-operatórios demonstra a ausência de reação hiperaguda, conforme a declaração de RAZANI et al. (1990). Estes mesmos autores afirmam que a ausência de vasculite leucocitária e linfonuclear no implante argumenta pela não ocorrência de rejeição do tipo humoral e celular, respectivamente. Condições semelhantes foram observadas no presente estudo, em ambas as regiões de implantação. Apesar de não serem realizados testes imunológicos específicos tal como descreve PIGOSSI (1967), estas observações permitem afirmar que a solução hipersaturada de sal na proporção estudada, assim como a glicerina a 98% (PIGOSSI, 1964; PIGOSSI, 1967; RAZANI et al., 1990), atua diminuindo a antigenicidade do tecido conservado.

Nas avaliações microscópicas, foi demonstrado que o centro frênico mantido em solução hipersaturada de sal foi substituído por tecido conjuntivo fibroso, em velocidade semelhante à observada para o material biológico conservado em glicerina, a partir do décimo quinto dia pós-operatório. Considerando que o sucesso da implantação pode estar diretamente relacionado ao tempo de incorporação do implante, ambas as soluções demonstram serem adequadas para a conservação de centro frênico canino. Em trabalho anterior, BRUN et al., (2002) constataram que o pericárdio mantido em solução salina semelhante havia sido totalmente substituído por tecido conjuntivo fibroso ao final de 30 dias. Já RANZANI et al. (1990) e MAZZANTI et al. (2000) observaram esta mesma condição 60 dias após a implantação pericárdio e segmento muscular conservados em glicerina. Estas variações de tempo entre os autores, incluindo a observada no presente estudo, podem estar relacionadas ao meio de conservação, a preparação prévia dos implantes e a estrutura morfológica dos mesmos (MAZZANTI et al., 2001).

 

CONCLUSÕES

Nas condições desse estudo, é possível concluir que a solução hipersaturada de sal, na proporção de 1,5g de sal comercial para 1ml de água tridestilada, apresenta resultados semelhantes à glicerina a 98% na conservação de centro frênico canino. Ambos os meios são adequados para esse fim, uma vez que apresentam características anti-sépticas e anti-imunogênicas, e permitem que o implante atue como arcabouço para o tecido de reparação do hospedeiro, quando utilizado na reparação de tecido muscular de ratos Wistar.

 

FONTES DE AQUISIÇÃO

aCisne churrasco, Cabo Frio, RJ.
bRompum, Bayer, Porto Alegre, RS
cKetamin-S, Cristália, Itapira, SP.
dAmpicilina, Ariston, São Paulo, SP.
eCloreto de sódio, Texon, Viamão, RS.
fNylonpoint 6-0, Point Suture do Brasil, Fortaleza, CE.
gThiopental, Cristália, Itapira, SP.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recebido para publicação 03.09.02
Aprovado em 12.03.03

 

 

1 Autor para correspondência.