Patogenicidade, DL50 e TL50 de isolados de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. para o percevejo castanho das raízes Scaptocoris carvalhoi BECKER (Hemiptera: Cydnidae)

Pathogenicity, LD50 and LT50 of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. isolates at the root brown stinkbug, Scaptocoris carvalhoi BECKER (Hemiptera: Cydnidae)

Resumos

Objetivou-se neste trabalho avaliar a patogenicidade de isolados do fungo Metarhizium anisopliae em Scaptocoris carvalhoi BECKER, 1967, bem como determinar a Dose Letal média (DL50) e o Tempo Letal médio (TL50), em laboratório. Os experimentos foram conduzidos na Embrapa Agropecuária Oeste em Dourados, MS, durante 2003. Suspensões de quatro isolados de M. anisopliae (Ma7, Ma69, Ma283 e Ma342) foram preparadas nas concentrações 10(4), 10(5), 10(6), 10(7) e 10(8) conídios mL-1 e inoculados topicamente 5mil dessas suspensoes sobre S. carvalhoi correspondendo, respectivamente, a 50, 500, 5.000, 50.000 e 500.000 conídios percevejo-1. Após a inoculação, os insetos (10 adultos e cinco ninfas) foram acondicionados em gerbox (parcela) e mantidos em câmaras climatizadas reguladas para 26±1ºC, UR 85%, sem fotofase. Na maior dose testada (500.000 conídios inseto-1), observou-se um incremento significativo de mortalidade do percevejo com o aumento da dose do fungo, para todos os isolados testados. Os menores valores da DL50 foram observados com os isolados Ma69 e Ma7 e o maior com Ma283. Os valores do TL50 variaram de 0,32 a 5,84 dias, sem diferirem significativamente, entre si. Os isolados Ma69 e Ma7 apresentam potencial para serem empregados no controle de S. carvalhoi a campo.

Insecta; fungo entomopatogênico; biocontrole

The objective of this research was to evaluate the pathogenicity of Metarhizium anisopliae isolates on Scaptocoris carvalhoi (BECKER 1967), and to determine the average Lethal Dose (LD50) and the average Lethal Time (LT50), under laboratory conditions. The bioassays were conducted at Embrapa Western Agriculture in Dourados, MS, Brazil, during the year 2003. Suspensions of four M. anisopliae isolates (Ma7, Ma69, Ma283, and Ma 342) were made at 10(4), 10(5), 10(6), 10(7) e 10(8) conidia mL-1 and 5mul of each concentration were inoculated topically on S. carvalhoi and corresponded to 50, 500 5,000, 50,000, and 500,000 conidia stinkbug-1, respectively. After inoculation, the insects (ten adults and five nymphs per plot) were placed into gerboxes and kept in growth chambers at 26±1ºC and 85% relative humidity, under darkness conditions. At the highest dose (500,000 conidia insect-1), a significant increase in stinkbug mortality was observed, regardless of the isolate. The lowest LD50 were observed with the Ma69 and the Ma7 isolates, and the highest with the Ma283 isolate. The LT50 ranged from 0.32 to 5.84 days, with no significant differences. The isolates Ma69 and Ma7 showed potential for S. carvalhoi control under field conditions.

Insecta; entomopathogenic fungus; biocontrol

ARTIGOS CIENTÍFICOS

DEFESA FITOSSANITÁRIA

Patogenicidade, DL₅₀ e TL₅₀ de isolados de Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. para o percevejo castanho das raízes Scaptocoris carvalhoi BECKER (Hemiptera: Cydnidae)¹

Pathogenicity, LD₅₀ and LT₅₀ of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. isolates at the root brown stinkbug, Scaptocoris carvalhoi BECKER (Hemiptera: Cydnidae)

Luciane Modenez Saldivar Xavier^I; Crébio José Ávila^II

^IUniversidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campus de Dourados, BR 463, km 12, CP 533, 79.804-970, Dourados, MS, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIEmbrapa Agropecuária do Oeste. BR 163, km 253,6, CP 661, 79.804-970, Dourados, MS, Brasil. E-mail: [e-mail]

RESUMO

Objetivou-se neste trabalho avaliar a patogenicidade de isolados do fungo Metarhizium anisopliae em Scaptocoris carvalhoi BECKER, 1967, bem como determinar a Dose Letal média (DL₅₀) e o Tempo Letal médio (TL₅₀), em laboratório. Os experimentos foram conduzidos na Embrapa Agropecuária Oeste em Dourados, MS, durante 2003. Suspensões de quatro isolados de M. anisopliae (Ma7, Ma69, Ma283 e Ma342) foram preparadas nas concentrações 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷ e 10⁸ conídios mL^-1 e inoculados topicamente 5ml dessas suspensoes sobre S. carvalhoi correspondendo, respectivamente, a 50, 500, 5.000, 50.000 e 500.000 conídios percevejo^-1. Após a inoculação, os insetos (10 adultos e cinco ninfas) foram acondicionados em gerbox (parcela) e mantidos em câmaras climatizadas reguladas para 26±1ºC, UR 85%, sem fotofase. Na maior dose testada (500.000 conídios inseto^-1), observou-se um incremento significativo de mortalidade do percevejo com o aumento da dose do fungo, para todos os isolados testados. Os menores valores da DL₅₀ foram observados com os isolados Ma69 e Ma7 e o maior com Ma283. Os valores do TL₅₀ variaram de 0,32 a 5,84 dias, sem diferirem significativamente, entre si. Os isolados Ma69 e Ma7 apresentam potencial para serem empregados no controle de S. carvalhoi a campo.

Palavras-chave: Insecta, fungo entomopatogênico, biocontrole.

ABSTRACT

The objective of this research was to evaluate the pathogenicity of Metarhizium anisopliae isolates on Scaptocoris carvalhoi (BECKER 1967), and to determine the average Lethal Dose (LD₅₀) and the average Lethal Time (LT₅₀), under laboratory conditions. The bioassays were conducted at Embrapa Western Agriculture in Dourados, MS, Brazil, during the year 2003. Suspensions of four M. anisopliae isolates (Ma7, Ma69, Ma283, and Ma 342) were made at 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷ e 10⁸ conidia mL^-1 and 5ml of each concentration were inoculated topically on S. carvalhoi and corresponded to 50, 500 5,000, 50,000, and 500,000 conidia stinkbug^-1, respectively. After inoculation, the insects (ten adults and five nymphs per plot) were placed into gerboxes and kept in growth chambers at 26±1ºC and 85% relative humidity, under darkness conditions. At the highest dose (500,000 conidia insect^-1), a significant increase in stinkbug mortality was observed, regardless of the isolate. The lowest LD50 were observed with the Ma69 and the Ma7 isolates, and the highest with the Ma283 isolate. The LT50 ranged from 0.32 to 5.84 days, with no significant differences. The isolates Ma69 and Ma7 showed potential for S. carvalhoi control under field conditions.

Key words: Insecta, entomopathogenic fungus, biocontrol.

INTRODUÇÃO

Os percevejos castanho Scaptocoris castanea (Perty, 1830) e Scaptocoris carvalhoi BECKER, 1967 (sinonímia Atarsocoris brachiariae, BECKER, 1996), pertencem à família Cydnidae e à subfamília Scaptocorinae e ocorrem na região Neotropical (BECKER, 1967). Nas décadas de 40 e 50, essas pragas foram registradas em várias regiões e culturas no Brasil (ANDRADE & PUZZI, 1953).Todavia, somente a partir da década de 80 é que a ocorrência desses insetos passou a ser mais intensa (BECKER, 1996), com maior importância econômica especialmente nas regiões dos Cerrados Brasileiros (OLIVEIRA & MALAGUIDO, 2004). Possuem hábitos subterrâneos, são polífagos e tanto as ninfas quanto os adultos sugam a seiva de raízes, causando amarelecimento, subdesenvolvimento e até a morte da planta (TECNOLOGIA..., 2003). Os danos também ocorrem devido à injeção de saliva tóxica que causa enfraquecimento e morte do hospedeiro (FERNANDES et al., 1999). NAKANO & TELLES (1997) também relataram sobre a possibilidade de introdução de fitopatógenos através das picadas produzidas durante a alimentação.

O ataque do percevejo castanho ocorre geralmente em reboleiras nas culturas, com incidência tanto em sistemas de semeadura direta como convencional (OLIVEIRA et al., 2000). O controle químico é a técnica mais utilizada visando ao controle dessa praga, embora tenha se mostrado ineficaz (NAKANO, 2004). Outras táticas de manejo como adubação mineral e orgânica também têm sido investigadas (MALAGUIDO et al., 1999; NAKANO, 2001; OLIVEIRA & SALES JÚNIOR, 2002).

O controle biológico tem demonstrado eficiência no controle de muitos insetos-praga (VAN DRIESCHE & BELLOWS, 1996), especialmente através do uso de patógenos (HAJEK & ST. LEGER, 1994). No Brasil, os fungos se destacam dentre os agentes microbianos utilizados em programas de controle biológico (ALVES, 1998). Os fungos dos gêneros Metarhizium, Beauveria e Paecilomyces são relatados como inimigos naturais do percevejo-castanho (MALAGUIDO et al., 2000). BATISTA-FILHO et al. (1996) avaliaram a patogenicidade de um isolado de M. anisopliae em S. castanea, em laboratório, constatando 50% de mortalidade do percevejo. Em outro trabalho, AMARAL et al. (1999) verificaram que M. anisopliae proporcionou eficiência entre 30 a 80% de controle de A. brachiariae, sendo observado maior eficiência quando o fungo foi utilizado em associação com a matéria orgânica. MALAGUIDO et al. (2000) também avaliaram a patogenicidade de um isolado de M. anisopliae em adultos de percevejo-castanho, enquanto AMARAL et al. (2002) demonstraram que alguns inseticidas químicos podem ser usados em associação com M. anisopliae para o controle dessa praga.

A presente pesquisa teve por objetivo avaliar a patogenicidade de isolados do fungo M. anisopliae em S. carvalhoi, bem como determinar a Dose Letal média (DL₅₀) e o Tempo Letal médio (TL₅₀) para os isolados testados.

MATERIAL E MÉTODOS

A pesquisa foi conduzida no Laboratório de Entomologia da Embrapa Agropecuária Oeste, em Dourados, MS, durante 2003.

Obtenção dos insetos

Ninfas e adultos de S. carvalhoi foram coletados em lavoura de soja do Município de São Gabriel do Oeste, MS (19º 23' 42'' S e 54º 33' 57'' W) e transportados até o laboratório em caixas de isopor contendo terra úmida.

Obtenção e multiplicação dos isolados

XAVIER (2004), ao avaliar, em laboratório, a patogenicidade de isolados dos fungos M. anisopliae e B. bassiana em S. carvalhoi constatou mortalidade variando de 73,3% a 94,7% e 10,7 a 78,7%, respectivamente. De modo geral, os níveis de mortalidade do percevejo foram maiores para os isolados de M. anisopliae. Destes, foram selecionados quatro isolados mais virulentos para serem avaliados na presente pesquisa. Os isolados testados (Tabela 1) pertencem à coleção de fungos entomopatogênicos da Embrapa Soja (SOSA-GÓMEZ & SILVA, 2002). Os fungos foram enviados em tubos de vidro contendo meio de cultura Batata–Dextrose-Ágar acrescido do antibiótico sulfato de estreptomicina (BDA+A), os quais foram armazenados em freezer (-12ºC). Para desenvolvimento germinativo e esporulação, os isolados foram repicados em placas de Petri contendo BDA+antibiótico tetraciclina e mantidas durante dez dias em estufa incubadora (BOD) a 26±1ºC e fotofase de 12h. Posteriormente, os patógenos foram individualmente condicionados em tubos de vidro, contendo sílica gel e leite desnatado (agente protetor), e armazenados em freezer (-12ºC) (SMITH & ONION, 1983).

Os isolados foram multiplicados em placas de Petri contendo meio de cultura BDA+antibiótico, mantidos em estufa incubadora nas mesmas condições abióticas descritas previamente. No preparo das suspensões, foram adicionados 4ml de espalhante adesivo (Tween 80 0,01%) às placas contendo os isolados multiplicados, sendo os conídios raspados do meio de cultura com uma espátula. O material fúngico foi filtrado com tecido não tramado de viscose e as suspensões agitadas em aparelho rotativo tipo vortex (Q-MED), para homogeneização.

Determinação da DL₅₀ e TL₅₀

Os experimentos foram conduzidos utilizando-se o delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições. Suspensões de quatro isolados de M. anisopliae (Ma7, Ma69, Ma283 e Ma342) foram preparadas nas concentrações 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷ e 10⁸ conídios mL^-1 e inoculadas sobre S. carvalhoi para determinação da DL₅₀ de cada isolado. A inoculação dos fungos sobre os insetos foi realizada utilizando-se uma micropipeta, inoculando-se na região ventral e entre as coxas do percevejo, 5µl de suspensão das diferentes concentrações preparadas de cada isolado, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷ e 10⁸ conídios mL^-1, correspondendo, respectivamente, em doses de 50, 500, 5.000, 50.000, 500.000 conídios inseto^-1. Após a inoculação, os insetos foram colocados em gerbox (11x11x3,5cm) e acondicionadas em câmaras climatizadas (BOD) reguladas para 26±1ºC, UR 85%, sem fotofase. Cada gerbox continha 180 gramas de terra esterilizada, umedecida com 30mL de água destilada e autoclavada, e raízes de algodoeiro tratadas com hipoclorito de sódio a 0,1%, fornecidas como alimento. Em cada gerbox, foram colocados quinze insetos (10 adultos e cinco ninfas), representando a unidade experimental (parcela) dos bioensaios.

A viabilidade dos conídios foi avaliada para cada isolado, utilizando-se lâminas contendo o meio BDA+antibiótico tetraciclina, mantidas em gerbox, sendo a suspensão pulverizada com aparelho nebulizador. Essas lâminas foram visualizadas, com auxílio do microscópio óptico com aumento de 40x, para verificar a quantidade de conídios. Havendo número suficiente de conídios, as lâminas foram mantidas em BOD a 26±1ºC, fotofase 12h e, posteriormente, realizadas as contagens de conídios viáveis.

Avaliou-se a mortalidade dos insetos aos 5, 8, 12, e 15 dias, após a inoculação dos fungos, efetuando-se a troca do alimento e repondo a umidade do solo no gerbox, quando necessário. Para a confirmação da causa mortis, os insetos foram colocados em placas de Petri contendo papel filtro esterilizado e algodão umedecido em água destilada e autoclavada, ambiente esse favorável ao desenvolvimento do patógeno. As placas foram vedadas com parafilme e mantidas em BOD a 26±1ºC, sem fotofase.

Os valores de mortalidade (%) do percevejo (x), obtidos para cada isolado nas cinco concentrações testadas, foram transformados para arcsen e submetidos à análise de variância, sendo as médias de mortalidade de cada concentração, comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Os valores de mortalidade dos diferentes isolados, aos 15 dias após a inoculação dos fungos sobre os insetos, foram submetidas à Análise de Probit, utilizando o programa MOBAE (HADDAD et al., 1995) para determinar a DL₅₀. O TL₅₀ foi realizado com base na infectividade de M. anisopliae para o percevejo, ao longo do tempo, empregando-se a dose de 500.000 conídios inseto^-1.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A infectividade dos isolados de M. anisopliae sobre ninfas e adultos de S. carvalhoi foi comprovada quando os insetos apresentavam corpo endurecido e a conidiogênese verificada pelo desenvolvimento da massa micelial (coloração branca) e produção de conídios (coloração verde). Esses conídios foram observados utilizando-se microscópio óptico com aumento de 40x e apresentaram estrutura cilíndrica e estreita no meio, com conidióforos contendo conídios dispostos em cadeia, característica típica do fungo M. anisopliae. Os isolados de M. anisopliae utilizados nos bioensaios apresentaram viabilidade média de 99%.

De um modo geral, para todos os isolados de M. anisopliae testados observou-se um incremento significativo na percentagem de mortalidade do percevejo com o aumento da dose do fungo (Tabela 2). O isolado Ma7, em todas as cinco doses testadas, ocasionou mortalidade de S. carvalhoi superiores à testemunha. As mortalidades de S. carvalhoi obtidas com os isolados Ma69 e Ma352 na dose de 50 conídios inseto^-1 não diferiram da mortalidade obtida na testemunha, enquanto que, no isolado Ma283, esse fato foi observado tanto com a dose de 50 quanto de 500 conídios inseto^-1. Os maiores valores de mortalidade foram observados com as doses de 50.000 e 500.000 conídios/inseto, nas quais as mortalidades diferiram significativamente entre si, dentro de um mesmo isolado, somente para Ma69. Na dose de 5.000 conídios inseto^-1, foram observados valores de mortalidade variando de 26,8 a 51,7%, enquanto que na dose de 500 conídios/inseto variou de 11,7 a 28,3% (Tabela 2).

Na dose de 500.000 conídios inseto^-1, foram observados níveis de mortalidade variando de 56,7 a 96,7%, sendo a maior percentagem apresentada pelo isolado Ma69, que superou estatisticamente os isolados Ma283 e Ma352, mas não diferiu do Ma7 (Tabela 3).

Os menores valores da DL₅₀ foram observados com os isolados Ma69 e o Ma7 e o maior valor com Ma283, enquanto o Ma352 apresentou valor intermediário (Tabela 2). Esses resultados evidenciam que os isolados Ma69 e Ma7 apresentam, significativamente, maior virulência para S. carvalhoi do que o isolado Ma283. Os valores de TL₅₀ variaram de 0,32 a 5,84 dias, sem diferirem estatisticamente, entre si, com base nos intervalos de confiança dos mesmos (Tabela 3). De acordo com os resultados obtidos, pode-se inferir que os isolados de M. anisopliae testados não diferiram estatisticamente quanto ao TL₅₀ para S. carvalhoi, embora o Ma7 e Ma69 apresentassem TL₅₀, respectivamente, cerca de 18 e 4 vezes inferior ao valor do TL₅₀ para Ma283, evidenciando alta virulência destes dois isolados para o percevejo.

Os resultados encontrados nessa pesquisa demonstraram relação diretamente proporcional entre a quantidade de conídios aplicada no percevejo e a mortalidade do mesmo. Esse fato também foi constatado por outros autores estudando isolados desse mesmo fungo em diferentes espécies de insetos (ALVES et al., 1985; SILVA et al., 2003). Segundo FERNANDES & ALVES (1992), quanto mais conídios penetram, mais toxinas ou enzimas são liberadas, aumentando a mortalidade do inseto. Todavia, a velocidade de ação do fungo depende, além da dosagem, das espécies hospedeiras envolvidas (SOSA-GÓMEZ & MOSCARDI, 1992). Segundo ST. LEGER (1991), a variação de virulência de isolados de fungos entomopatogênicos está relacionada com a composição química da cutícula e os processos bioquímicos envolvidos para a formação do tubo germinativo e colonização do hospedeiro. Além disso, OLIVEIRA et al. (2004) destacaram que a capacidade do fungo em causar mortalidade se deve à habilidade de seus conídios em reconhecer e produzir enzimas para degradar a cutícula do hospedeiro.

A patogenicidade de M. anisopliae sobre o percevejo castanho S. castanea também foi avaliada por BATISTA-FILHO et al. (1996), em laboratório, que realizaram pulverização na concentração de 0,4 x 109 conídios mL^-1, resultando em mortalidade de 50% do inseto. MALAGUIDO et al. (2000) também avaliaram, em laboratório, a infectividade de um isolado de M. anisopliae sobre o percevejo castanho, com aplicação tópica de 30.000 conídios inseto^-1, obtendo mortalidade de 31%. Esses autores também submeteram esse fungo a uma maior concentração, mediante mistura com caulim, obtendo maior eficiência de controle (63%).

Dentre os isolados testados, Ma69 e Ma7 foram os que apresentaram menores valores de DL₅₀ e TL₅₀. O valor da DL₅₀ é importante, pois revela qual isolado é mais patogênico para o inseto. Por outro lado, o valor do TL₅₀ também pode ser empregado como informação complementar para avaliação da virulência de um isolado (SILVA et al., 2003), uma vez que menores valores de TL₅₀ indicam maior capacidade do fungo em matar mais rápido a praga.

CONCLUSÃO

Os isolados de M. anisopliae Ma 69 e Ma 7 foram os mais patogênicos para S. carvalhoi, os quais também apresentaram os menores valores de DL₅₀ e de TL₅₀. Esses isolados apresentam potencial para serem empregados visando ao controle de S. carvalhoi em condições de campo.

AGRADECIMENTOS

À CAPES, pela concessão de bolsa para o primeiro autor. À FUNDECT, pelo financiamento do projeto. À EMBRAPA-CNPSo, pelo envio dos isolados de fungos entomopatogênicos testados, especialmente ao Dr. Daniel R. Sosa Gómez. À Jocélia Grazia da UFRGS/Porto Alegre, RS pela identificação do inseto estudado.

Recebido para publicação 08.11.04

Aprovado em 16.03.05

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1

Parte da Dissertação apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS) - Programa de Mestrado em Entomologia e Conservação da Biodiversidade, para obtenção do título de Mestre em Zoologia.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Jul 2005
• Data do Fascículo
  Ago 2005

Histórico

• Recebido
  08 Nov 2004
• Aceito
  16 Mar 2005