Agentes bacterianos enteropatogênicos em suínos de diferentes faixas etárias e perfil de resistência a antimicrobianos de cepas de Escherichia coli e Salmonella spp

Enteropathogenic bacterial agents in pigs of different age groups and profile of resistance in strains of Escherichia coli and Salmonella spp. to antimicrobial agents

ARTIGOS CIENTÍFICOS

MICROBIOLOGIA

Agentes bacterianos enteropatogênicos em suínos de diferentes faixas etárias e perfil de resistência a antimicrobianos de cepas de Escherichia coli e Salmonella spp

Enteropathogenic bacterial agents in pigs of different age groups and profile of resistance in strains of Escherichia coli and Salmonella spp. to antimicrobial agents

Álvaro Menin^I,1; Carolina Reck^II; Daiane de Souza^I; Catia Klein^III; Eliana Vaz^I

^ICentro de Ciências Agroveterinárias (CAV), Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC). Av Luis de Camões, 2090, 88520-000, Lages, SC, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIInstituto Catarinense de Sanidade Animal (ICASA), Concórdia, SC, Brasil

^IIIEmpresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA – Suínos e Aves), Concórdia, SC, Brasil

RESUMO

As enterites infecciosas bacterianas provocam severas perdas para a indústria suína em todo o mundo. Os objetivos deste trabalho foram determinar os agentes bacterianos, associados com a ocorrência de diarréia em suínos, em diferentes faixas etárias, no Estado de Santa Catarina, Brasil, e verificar o perfil de resistência das cepas de Escherichia coli e Salmonella spp, frente aos principais antimicrobianos utilizados em granjas de suínos. Os principais gêneros/espécies bacterianos diagnosticados foram Escherichia coli, Clostridium spp, Salmonella spp Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli e Lawsonia intracellularis. Os fatores de virulência de E. coli mais prevalentes na fase de maternidade foram F5 / (K99) 20%, F6 / (987P) 16,3%, F42 6,8% e F41 5,7%, já nas fases de creche e terminação, predominaram cepas com fimbrias F4 (K88) 11,2% e 5,4%, respectivamente. Para E. coli os maiores índices de resistência foram encontrados para oxitetraciclina (94%) e tetraciclina (89,5%) e os menores índices de resistência para neomicina (55%), ceftiofur (57,4%). Quanto às amostras de Salmonella spp, estas apresentaram maior resistência à oxitetraciclina (77%), e à tetraciclina (42,1%) e menor à gentamicina (3,5%) e amoxicilina (4,8%).

Palavras-chave: suínos, sistema digestório, resistência a antimicrobianos, diarréia.

ABSTRACT

Infectious bacterial enteritis causes severe losses to the swine industry worldwide. The objective of this study was to determine the epidemiology of bacterial agents that are associated with the occurrence of diarrhea in pigs at different age groups, and to verify the profile of resistance of strains of Escherichia coli and Salmonella spp to the main antimicrobial agents. The main bacterial species diagnosed were Escherichia coli, Clostridium spp, Salmonella spp, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli and Lawsonia intracellularis. The E. coli virulence factors of higher prevalence in preweaning piglets were F5 / (K99) 20%, F6 / (987P) 16.3%, F42 6.8% and F41 5.7%, whereas at the nursery and with finishing pigs, the prevalent strain was the fimbria F4 (K88) 11.2% e 5.4%, respectively. E. coli and Salmonella spp were highly resistant to oxytetracycline (94%) and tetracycline (90%), with the former having a low resistance to neomycin (55%) and ceftiofur (57%), and the latter to gentamicin (3.5%) and amoxicillin (4.8%).

Key words: swine, digestive system, resistance to antimicrobials, diarrhea, virulence factors.

INTRODUÇÃO

As infecções bacterianas entéricas em suínos têm importância crescente e são freqüentemente observadas em diferentes faixas etárias, provocando um grande impacto para indústria de suínos em todo o mundo (JACOBSON et al., 2005). Estas infecções são responsáveis por aproximadamente 30% das perdas econômicas na suinocultura moderna (BURCH, 2000). Além disso, algumas etiologias podem ser potencialmente patogênicas para os humanos, representando um risco para saúde pública.

As infecções entéricas podem levar a altas taxas de mortalidade e morbidade, entretanto, as maiores perdas estão relacionadas a seqüelas no trato gastrintestinal (MCORIST & GEBHART, 1999). Estas lesões podem ser permanentes ou transitórias, resultando em expressivo atraso no crescimento, na redução da eficiência alimentar e no custo com tratamentos e alimentação adicionais, respondendo por 60% dos gastos com antimicrobianos na suinocultura moderna (JACOBSON et al., 2005; PEARCE, 1999).

Geralmente, os estudos de ocorrência das doenças entéricas estão focados em um patógeno específico e restrito a uma faixa etária, pois facilita o estudo individualizado da etiologia. No entanto, este procedimento dificulta as estratégias de controle direcionadas ao sistema produtivo como um todo, já que algumas etiologias ocorrem em estágios consecutivos de produção.

As principais bactérias associadas à patogênese das enterites são Escherichia coli (BERTSCHINGER & FAIRBROTHER, 1999), Clostridium perfringens Tipo A, Tipo C e Clostridium difficile (SONGER & UZAL, 2005), Salmonella spp (SCHWARTZ, 1999), Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicoli (HAMPSON & TROTT, 1999), Lawsonia intracellularis (MCORIST & GEBHART, 1999), Yersinia spp e Campylobacter spp (LAWSON & MCORIST, 1993).

A patogenicidade da E. coli está relacionada à sua capacidade de colonizar o epitélio intestinal. A colonização é mediada por fatores denominados fímbrias, estruturas protéicas, consideradas antígenos de superfície e de grande atividade antigênica, sendo um importante fator de avaliação para diagnóstico e identificação de cepas patogênicas (NATARO & KAPER, 1998). Uma das estratégias mais adotadas para ajudar a prevenir e controlar as diversas infecções, entre elas as enterites, tem sido a terapia antimicrobiana. Entretanto, a falta de critérios para o uso adequado e seguro dos antimicrobianos associa-se à presença de resíduos de antimicrobianos em produtos de origem animal, à seleção de bactérias resistentes e a sérios riscos à saúde pública (BACCARO et al., 2002).

No Brasil, são escassos os dados de prevalência dos agentes bacterianos envolvidos nos diferentes quadros clínicos de diarréia em animais de produção. Os dados epidemiológicos são essenciais para identificar e solucionar problemas sanitários, sendo considerados uma ferramenta indispensável para a implantação dos programas de biosseguridade nas modernas unidades de produção de suínos.

O objetivo deste trabalho foi determinar os agentes bacterianos associados com a ocorrência de diarréia em suínos de diferentes faixas etárias no Estado de Santa Catarina-Brasil e verificar o perfil de resistência das cepas de E. coli e Salmonella spp frente aos principais antimicrobianos utilizados na suinocultura.

MATERIAL E MÉTODOS

Seleção e amostragem do rebanho: neste estudo foram necropsiados 1.107 animais que apresentavam sinais clínicos de diarréia, sendo 391 da fase de maternidade, 330 da fase de creche e 386 da fase de terminação. Foram amostradas 183 granjas localizadas em 12 microrregiões geográficas do Estado de Santa Catarina durante o período de dezembro de 2005 a março de 2007. A obtenção do material para análise laboratorial foi feita a partir da eutanásia, da necropsia e da coleta de material entérico de leitões das fases de maternidade, creche e terminação.

Coleta de amostras e processamento laboratorial: as amostras foram obtidas de segmentos intestinais, contemplando intestino delgado, grosso, linfonodos inguinais e mesentérios. O material coletado foi acondicionado sob refrigeração para exame bacteriológico. Por ocasião da necropsia, foi feito registro do material, descrevendo histórico, e identificando o animal, sua procedência, seus sinais clínicos, suspeita clínica e lesões macroscópicas.

Procedimentos laboratoriais para exame bacteriológico: o processamento bacteriológico foi baseado na semeadura do material coletado em meios de cultura enriquecido Ágar Sangue (com 5% de sangue ovino desfibrinado) (AS)^a, Ágar Sangue enriquecido (com 5% de sangue ovino desfibrinado, extrato de levedura, vitamina K e hemina (ASL) a e seletivos, Agar MacConkey (MC)^a, Agar Verde Brilhante (VB)^a, Agar Xilose-Lisina-Descarboxilato (XLD)^a, Caldo Tioglicolato (CT)^a, (CARTER, 1994). Após a semeadura, os meios de cultura foram incubados em estufa bacteriológica sob condições de temperatura de 37°C e 85% umidade relativa do ar. O cultivo foi feito em atmosfera de aerobiose (AS, MC, VB e XLD) destinada ao cultivo de bactérias aeróbicas e em atmosfera de anaerobiose (AS, ASL e CT), para cultivo de bactérias anaeróbicas (QUINN et al., 1994). O crescimento bacteriano era avaliado em 24 e 48 horas de cultivo. A identificação bacteriana foi baseada na análise de morfologia das colônias e/ou de crescimento bacteriano nos respectivos meios de cultivo, presença, ausência e padrão de hemólise, características morfotintoriais e caracterização fenotípica da bactéria por meio de testes bioquímicos, segundo CARTER (1994) e QUINN et al., (1994).

Os diagnósticos dos enteropatógenos Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodysenteriae e Brachyspira pilosicoli foram baseados na análise molecular, por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase - (PCR) e de amostras de conteúdo intestinal de leitões com sinais clínicos de diarréia segundo JONES (1993) e LA et al. ( 2003).

Testes de microhemaglutinação e Soroaglutinação: para diagnóstico e identificação do fenótipo fimbrial de cepas de Escherichia coli, foram submetidas aos testes 349 amostras de E. coli, sendo 219 da fase de maternidade, 94 da fase de creche e 36 da fase de terminação. Para a realização da técnica de microhemaglutinação, destinada à identificação de fenótipos fimbriais manose-resistentes (F4/K88, F5/K99, F6/987P, F41 e F42), foram utilizadas suspensões a 1% de eritrócitos de cobaio, galinha, ovino e eqüino em presença de D-manose 1%^b (JONES & RUTTER, 1974). O teste de soroaglutinação, utilizado para diagnosticar o fenótipo fimbrial F6, não-hemaglutinante, foi realizado segundo SOJKA (1965). Ambos os testes foram realizados no laboratório de bacteriologia da EMBRAPA – Suínos e Aves de Concórdia, SC.

Teste de resistência a antimicrobianos: 349 cepas de E. coli, com o fenótipo fimbrial previamente estudado e 64 isolados de Salmonella spp, foram submetidas ao teste de sensibilidade in vitro a antimicrobianos (antibiograma) usando o método de disco - difusão (NCCLS, 2003).

Detecção de atividade hemolítica: em 349 amostras de E. coli isoladas foi avaliada atividade hemolítica utilizando ágar sangue contendo 5% de sangue de ovino desfibrinado, seguida de incubação por 24 horas a 37°C e 24 horas para avaliação visual do halo de hemólise (LUDWIG, 1997).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Diferentes agentes bacterianos foram diagnosticados a partir das amostras intestinais examinadas (Tabela 1). Entre os animais examinados 91,1% (1008/1.107) foram positivos para um ou mais agentes e 8,9% (99/1.107) foram negativos, não sendo detectado qualquer agente bacteriano relacionado a infecções entéricas.

A variação na prevalência dos enteropatógenos nos rebanhos suínos provavelmente está relacionada a aspectos gerais de manejo, à dinâmica de infecciosidade dos agentes, à pressão de infecção, à capacitação gastrointestinal, ao status imunitário do rebanho, a nutrição, a programas de vacinação, ao uso de antimicrobianos e aos fatores estressantes.

De acordo com os dados do estudo, a E. coli destacou-se como o agente bacteriano mais freqüentemente isolado de quadros clínicos de diarréia nas fases de maternidade, creche e terminação. Dados semelhantes foram obtidos em estudos desenvolvidos na França e nos Estados Unidos (ROMERO et al., 2001). No entanto, mesmo em cultura pura, o isolamento bacteriológico não indica a participação do agente na patogênese do quadro clinico de diarréia, visto que o agente faz parte da microbióta entérica dos leitões e sua patogenicidade está relacionada à capacidade de expressar fatores de colonização intestinal como fímbrias e toxinas.

A partir da análise fenotípica das cepas isoladas de E. coli, observou-se que os sorotipos fimbriais mais prevalentes na fase de maternidade foram F5 / (K99) 20%, F6 / (987P) 16,3%, F42 6,8% e F41 5,7%, já nas fases de creche e terminação, houve uma maior ocorrência de cepas F4 / (K88) 11,2% e 5,4%, respectivamente. Dados semelhantes foram observados em outros estudos de prevalência de fatores de virulência desta bactéria (FRANCIS, 2002).

Levando em consideração a fase de criação, foram identificados 19 (5,4%) patotipos fimbriais de E. coli F4 / (K88), possivelmente associados a enterites em animais de terminação (Tabela 2). Estes dados descrevem um intervalo além do relatado por outros autores que julgam os animais suscetíveis somente até a fase de creche (até os 60-65 dias de idade) (MCORIST & GEBHART, 1999; POST, 2000).

Possivelmente, este aumento no período de suscetibilidade e a própria ocorrência do agente E. coli se deve à interação com outros fatores imunodepressores, sejam estes não-infecciosos (superlotação, manejos inadequados) ou infecciosos. Nesse cenário, vem ganhando projeção no atual modelo de criação de suínos, o circovírus suíno Tipo 2 (PCV-2). A SMDS (Síndrome multissistêmica do definhamento suíno) que pode ser observada em suínos entre oito e 12 semanas de idade, desenvolve em sua patogênese um quadro de imunodeficiência que predispõe às infecções entéricas secundárias por E. coli, Salmonella spp e L. intracellularis (COCHRAN, 2006).

Quanto à expressão de hemolisinas, das 349 amostras de E. coli estudadas 104 (29,7%) eram positivas para produção de hemólise. Outros autores associam a produção de hemolisinas com maior freqüência aos patotipos fimbrias, freqüentes após a terceira semana de vida, e não aos patotipos fimbrias que ocorrem mais na fase lactente do leitão, pois estas podem ser ou não hemolíticas (FRANCIS, 2002).

Os resultados obtidos (Tabela 1) indicam que os agentes Brachyspira pilosicoli, Brachyspira hyodysenteriae e Lawsonia intracelullaris podem ocorrer de forma isolada ou associada e são as principais causas de infecção entérica em suínos na fase de terminação. Estes dados estão de acordo com os demonstrados por outros estudos de levantamento realizados no Brasil e na Europa, que referenciam estes enteropatógenos como causa mais comum de enterites entre 65 e 150 dias de idade (BACCARO et al., 2003; ROMERO, 2001).

Neste estudo, em 17,8% (69/386) dos casos de diarréia diagnosticados na fase de terminação, observou-se a infecção concomitante com duas ou mais bactérias. Levando em conta a patogênese das diarréias, as infecções entéricas mistas devem ser consideradas um complexo enteropatogênico, exigindo cada vez mais ações de controle, tratamento e profilaxia inter-relacionadas.

Nesse panorama, se destacaram diferentes associações entre os agentes B. pilosicoli, L. intracellularis e as cepas de E. coli. Dados semelhantes foram demonstrados em estudos conduzidos na Suécia, que investigam infecções entéricas em animais na fase de crescimento e na terminação (JACOBSON et al., 2005).

Foi possível isolar Salmonella spp em 24 (7,3%) e 42 (10,9%) leitões da fase de creche e terminação, respectivamente. Dados semelhantes foram descritos em trabalhos de prevalência realizados na Europa e no EUA, que constataram a associação do agente Salmonella spp. com 9,2% e 5,3%, respectivamente, dos casos de diarréia na fase de creche e terminação (ROMERO et al., 2001). Apesar de o diagnóstico deste estudo ter levado em consideração os resultados de exames bacteriológicos, clínico-patológicos e histórico de granja, não foi realizado sorotipificação das cepas isoladas, no entanto, em suínos o sorovar Choleraesuis é o mais freqüentemente associado à doença clínica nos animais (SCHWARTZ, 1999). Apesar de o gênero Salmonella spp. fazer parte da microbiota entérica dos suínos, sorovares com potencial patogênico são considerados os organismos mais freqüentemente envolvidos em toxinfecções alimentares em humanos, representando um sério risco para saúde pública (CHIU et al., 2004).

Quanto ao isolamento do Clostridium spp. nas diferentes fases de produção, foi observada maior prevalência do agente nos primeiros dias de vida dos leitões (4,3%). O Clostridium spp. faz parte da microbiota entérica (QUINN et al., 1994), entretanto, neste estudo não foram consideradas espécies. Contudo, estudos epidemiológicos realizados em granjas de suínos dos EUA e da Suécia descrevem uma prevalência do C. perfringens tipo A, tipo C e C. difficile de 7,4%, 7,6% e 20%, respectivamente, como causa de diarréias nos primeiros dias de vida dos leitões. Contudo, esta etiologia vem adquirindo importância crescente em suínos de crescimento e terminação (SONGER & UZAL, 2005).

Diagnóstico de infecção entérica causada por representantes dos gêneros bacterianos Enterobacter spp., Pseudomonas spp., deve ser interpretados com cautela, pois possivelmente estas bactérias são constituintes da microbiota entérica normal dos suínos e nos casos em que são isolados de animais com diarréia a etiologia deve ser revista e melhor elucidada, levando em conta a possibilidade de interação de vários agentes na causa das diarréias. Além disso, não foram encontrados dados, na literatura consultada, relacionando estes agentes com a patogênese das enterites em suínos (GYLES, 2004). Qualquer afirmação de envolvimento de algum destes gêneros bacterianos na causa de infecções entéricas, precisa ser melhor esclarecida (JACOBSON et al., 2005). Além disso, o diagnóstico definitivo das doenças entéricas em suínos, à medida do possível, deve contemplar o estudo histórico da granja, os sinais clínicos, o estudo anatomopatológico, o fenotípico, o genotípico e a avaliação do potencial patogênico do agente (BERTSCHINGER, 1999). A diversidade da microbiota do sistema digestório e a utilização de um único parâmetro para diagnóstico pode confundir a caracterização do agente etiológico primário nos quadros de enterite em suínos (FRANCIS, 2002)

As cepas de E. coli fimbriadas e os isolados de Salmonella spp., submetidos ao teste de antibiograma, apresentaram alta taxa de resistência a todos os princípios ativos antimicrobianos testados (Tabela 3).

Para as amostras de E. coli isoladas de leitões com diarréia, as menores freqüências de resistência, apesar do uso intenso na suinocultura, foi encontrado para neomicina (55%), ceftiofur (57,4%) e gentamicina (62,7%) e maiores taxas de resistência para oxitetraciclina (94%), tetraciclina (89,5%) e norfloxacina (83,3 %), quando comparados com os demais princípios antimicrobianos testados. Resultados semelhantes de sensibilidade foram descritos por outros autores estudando amostras de E. coli isoladas de leitões com diarréia na região Sul do Brasil (COSTA et al., 2006).

Quanto às amostras de Salmonella spp., isoladas de casos clínicos de diarréia, elas apresentaram baixa freqüência de resistência à gentamicina (3,5%) amoxicilina (4,8%) e neomicina (6,2%) e maior resistência à oxitetraciclina (77%), tetraciclina (42,1%) e norfloxacina (39,3%). Resultados de sensibilidade semelhantes foram descritos para os antimicrobianos amoxicilina (3%), gentamicina (2%) e neomicina (4%), em estudo avaliando a resistência a antimicrobianos de diferentes sorovares de Salmonella spp. isoladas de suínos portadores, por ocasião do abate (CASTAGNA et al., 2001).

CONCLUSÃO

Nas diferentes fases de produção de suínos estudadas, os principais gêneros e/ou espécies de bactérias associados à patogênese das infecções entéricas foram Escherichia coli, Clostridium spp, Salmonella spp, Brachyspira hyodysenteriae, Brachyspira pilosicolis e Lawsonia intracellularis.

Entre as etiologias descritas, a Escherichia coli adquire projeção nas diferentes faixas etárias, seja de forma isolada ou associada a outras bactérias. As amostras de E. coli testadas apresentaram menores índices de resistência ao ceftiofur e a gentamicina, já as amostras de Salmonella spp. apresentaram menores índices de resistência à gentamicina e amoxicilina.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Centro de Ciências Agroveterinárias (CAV), da Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC) e Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA – Suínos e Aves), pela disponibilidade dos laboratórios e apoio à pesquisa e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo financiamento e concessão de bolsista.

FONTES DE AQUISIÇÃO

^aBiobrás - Brasil.

^bSigma - Aldrich – Brasil.

COMITÊ DE ÉTICA E EXPERIMENTAÇÃO ANIMAL

O trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal da Universidade do Estado de Santa Catarina (CETEA/UDESC), processo no: 1.03/05 .

Recebido para publicação 29.05.07

Aprovado em 20.02.08

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1

Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Nov 2008
• Data do Fascículo
  Set 2008

Histórico

• Recebido
  29 Maio 2007
• Aceito
  20 Fev 2008