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Ciência Rural

versión impresa ISSN 0103-8478

Cienc. Rural v.39 n.1 Santa Maria ene./feb. 2009

http://dx.doi.org/10.1590/S0103-84782009000100052 

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
TECNOLOGIA DE ALIMENTOS

 

Ocorrência, aspectos toxicológicos, métodos analíticos e controle da patulina em alimentos

 

Occurrence, toxicological aspects, analytical methods and control of patulin in food

 

 

Juliane Elisa WelkeI, 1; Michele HoeltzI; Horacio Alberto DottoriII; Isa Beatriz NollI

IInstituto de Ciência e Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), 91570-901, Porto Alegre, RS, Brasil. E-mail: juliwelke@yahoo.com.br
IIInstituto de Física, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil

 

 


RESUMO

A patulina é uma micotoxina produzida por várias espécies de Penicillium, Aspergillus e Byssochlamys. Em experimentos com animais, ela demonstrou ter atividade mutagênica, carcinogênica e teratogênica. Tem sido freqüentemente encontrada em maçãs e derivados. A patulina é facilmente transferida da maçã para o suco durante o processamento devido a sua alta solubilidade em água. Essa micotoxina é muito estável ao aquecimento em meio ácido, como no suco de maçã. Assim, a presença de patulina em suco de maçã é um indicador da qualidade das maçãs utilizadas no processamento. Muitos métodos têm sido desenvolvidos para a determinação da patulina, principalmente baseados na extração líquido-líquido com acetato de etila e determinação por CLAE. É importante evidenciar a necessidade de legislação que regulamente limites dessa micotoxina em alimentos no Brasil. Esta revisão bibliográfica tem como objetivos descrever as principais características da patulina, a ocorrência, os aspectos toxicológicose os métodos desenvolvidos para sua detecção e controle durante os estágios da produção da maçã e suco.

Palavras-chave: patulina, toxicidade, métodos analíticos, ocorrência, controle.


ABSTRACT

Patulin is a mycotoxin produced by several Penicillium, Aspergillus and Byssochlamys species. Patulin is a highly toxic compound which has shown to be mutagenic, carcinogenic and teratogenic in experiments with animals. It has often been found in apples and apple products. Patulin is easily transfered into apple juice during processing due to its high solubility in water. This mycotoxin is very stable to heat in acidic medium as in apple juice. Thus, patulin content of apple juice is an indicator of the quality of the apples used to juice production. Many methods have been developed for the patulin determination mainly based on liquid-liquid extraction with ethyl acetate and use of HPLC for detection. It is important to show the need of legislation that imposes patulin limits in foods in Brazil. The objectives of this review are to describe the main patulin characteristics, occurrence, toxicological aspects, methods developed for patulin detection and control during the stages of apple and juice production.

Key words: patulin, toxicity, analytical methods, occurrence, control.


 

 

INTRODUÇÃO

O suco e os demais derivados da maçã são elaborados, principalmente, a partir de frutas que não alcançam o padrão exigido para consumo, por defeitos diversos, como picadas de insetos, injúrias mecânicas, cicatrizes na epiderme, má formação do fruto e problemas fitossanitários (MELO, 2004). Essas frutas podem estar contaminadas com fungos, causadores de deterioração e produtores de metabólitos tóxicos, as micotoxinas e, dentre essas, a patulina (CIEGLER, 1976).

A patulina vem sendo empregada como indicador da qualidade nos frutos e produtos de maçã (MOSS, 1996). Essa micotoxina tem demonstrado potencial carcinogênico (BECCI et al., 1981), mutagênico (SCHUMACHER et al., 2005) e teratogênico (CIEGLER, 1976) em animais.

No Brasil, o comércio interno de sucos de frutas é pequeno, em torno de cinco a sete litros anuais por habitante (IBGE, 2003). A produção e comercialização de sucos no Brasil são insignificantes quando comparadas com a Europa e os Estados Unidos, onde o consumo de sucos de frutas alcança 30 litros anuais por habitante, destacando-se o suco de maçã, considerado como o mais popular e que, dentre os sucos de frutas, ocupa a segunda posição em consumo no mundo (IBRAF, 2005). Uma das principais preocupações em relação à contaminação do suco de maçã com a patulina é o fato de que o Brasil exporta esse produto a países que possuem limites estabelecidos por legislação para essa micotoxina em sucos.

A Organização Mundial da Saúde recomenda um nível máximo aceitável de 50µg L-1 de patulina em suco de maçã (FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS, 1997). A União Européia adotou recentemente este mesmo limite e também 25µg kg-1 em produtos sólidos incluindo compota e purê de maçã. Além disso, o limite máximo de 10µg kg-1 é proposto para produtos de maçã destinados às crianças (THE COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES, 2006). No Brasil ainda não existe legislação que estabelece o limite de patulina em alimentos.

O objetivo desta revisão bibliográfica é apresentar os principais aspectos relacionados à patulina, incluindo a ocorrência, os aspectos toxicológicos, métodos analíticos e as formas de controle.

Características gerais da patulina

Quimicamente, a patulina é uma lactona (4-hidroxi-4H-furo[3,2-c]piran-2(6H)-ona) e seu peso molecular é de 150,12 (Figura 1). Ela forma cristais incolores, tem ponto de fusão de 111°C, é solúvel em água, etanol, acetona, acetato de etila, éter e clorofórmio, mas é insolúvel em benzeno e éter de petróleo. Sua quantidade em suco de maçã é reduzida por estocagem prolongada, ação de sulfito e alta temperatura, adição de ácido ascórbico, fermentação alcoólica e tratamento com carvão ativo. A patulina perde sua atividade biológica em meio alcalino e em presença de moléculas contendo grupo sulfidrila, tais como cisteína e glutationa (CODEX COMMITEE ON FOOD ADDITIVES AND CONTAMINANTS, 1998).

 

 

Fungos produtores de patulina

A patulina é uma micotoxina produzida por algumas espécies de fungos dos gêneros Penicillium, Aspergillus e Byssochlamys. As espécies de Penicillium que já foram identificadas como produtoras de patulina são: P. carneum, P. clavigerum, P. concentricum, P. coprobium, P. dipodomyicola, P. expansum, P. glandicola, P. gladioli, P. griseofulvum, P. marinum, P. paneum, P. sclerotigenum e P. vulpinum (FRISVAD et al., 2004).

O P. expansum é um fungo psicotrófico e já foi encontrado em maçãs (VERO et al., 2002), cerejas (LARSEN et al., 1998), pêssego (KARABULUT & BAYKAL, 2002), nectarinas (KARABULUT et al., 2002) e pêras (MORTIMER et al., 1985). Esse fungo é o principal produtor de patulina (GÖKMEN & ACAR, 1998), sendo reportado como responsável por 70 a 80% da deterioração de frutas armazenadas e em especial de maçãs (LEGGOTT & SHEPHARD, 2001). Como conseqüência, maçãs e produtos derivados de maçã são a principal fonte de patulina na dieta humana. O armazenamento das frutas a baixas temperaturas não é suficiente para prevenir a formação de micotoxinas, pois o P. expansum é capaz de crescer e produzir patulina em temperaturas menores que 5°C (NORTHOLT & BULLERMAN, 1982).

O gênero Byssochlamys possui duas espécies economicamente importantes, B. nivea e B. fulva, sendo que ambas causam deterioração de frutas e produtos processados a partir delas. Esse gênero fúngico é o principal causador da deterioração pós-tratamento térmico em derivados de frutas (TOURNAS, 1994).

Ocorrência de patulina

A produção de patulina pelo fungo ocorre nas partes danificadas do fruto, sendo que a intensidade de difusão dessa micotoxina é de 1cm em direção ao tecido sadio (TANIWAKI et al., 1992). Entretanto, RYCHLIK & SCHIEBERLE (2001) encontraram patulina a 2cm além do tecido deteriorado de maçãs.

Nos últimos anos, várias pesquisas têm sido realizadas acerca da ocorrência de patulina em suco de maçã ,em diversos países (Tabela 1). Em todos os países onde foram realizados estudos foram encontradas amostras contaminadas com essa micotoxina. No entanto, os dados ainda são insuficientes para uma conclusão a respeito da incidência de patulina nestes países.

Aspectos toxicológicos da patulina

Desde 1941, a patulina tem sido objeto de estudo, primeiramente por sua ação como antibiótico e depois por suas propriedades fitotóxicas e carcinogênicas. Foi reportada como sendo tóxica para ratos (BROOM et al., 1944), teratogênica para embriões de galinha (CIEGLER, 1976) e imunossupressora em camundongos e coelhos (ESCOULA et al., 1988).

Em 1986, a Agência Internacional de Pesquisa para o Câncer (IARC, 1986), concluiu que não há evidências suficientes sobre a carcinogenicidade da patulina em animais e que não se pode fazer qualquer afirmação sobre a carcinogenicidade em humanos. Entretanto, nos últimos anos, inúmeros estudos têm sido realizados com o objetivo de evidenciar a toxicidade dessa micotoxina (FLIEGE & METZLER, 2000; MAHFOUD et al., 2002; WICHMANN et al., 2003; RYCHLIK et al., 2004; SCHUMACHER et al., 2005; WU et al., 2005; SCHUMACHER et al., 2006; LIU et al., 2006).

Ao nível celular, a patulina tem mostrado efeitos que incluem rompimento da membrana de células plasmáticas (MAHFOUD et al., 2002) e inibição da síntese de DNA (WICHMANN et al., 2003). Segundo ARAFAT & MUSA (1995), a toxina inibe o crescimento e a síntese de proteína em cultura de tecido hepático e isso se deve ao bloqueio da captação dos aminoácidos por meio da membrana e também à sua incorporação na proteína.

Em estudo in vitro, a patulina se mostrou capaz de inativar várias enzimas, incluindo as polimerases de ácido ribonucléico e de ácido desoxirribonucléico. Isso também afeta a transcrição e a tradução, tendo um efeito direto no DNA (RILEY & SHOWKER, 1991). Essa propriedade de inativar enzimas ocorre principalmente como uma conseqüência da formação de ligações covalentes com células essenciais contendo grupos sulfidril ou tiol (SH) (ARAFAT & MUSA, 1995; FLIEGE & METZLER, 1999). A afinidade pelos grupos SH também é responsável, em termos de mecanismos bioquímicos, pelos efeitos tóxicos da patulina em várias células (LIU et al., 2006; MAHFOUD et al., 2002). O conhecimento sobre a reatividade da micotoxina poderá ajudar a caracterizar os mecanismos de citoxicidade e efeitos genéticos dessa toxina na molécula base e, possivelmente, facilitar o desenvolvimento de biomonitoração da patulina, com base nas estruturas químicas formadas (FLIEGE & METZLER, 2000).

A patulina causou danos ao fígado e aos rins de ratos (IMAIDA et al., 1982; SPEIJERS et al., 1988), além de revelar toxicidade ao sistema imunológico (BONDY & PETSTKA, 2000). Em humanos, os efeitos tóxicos da patulina ainda não são conclusivos, mas já foram relatados casos de distúrbios gastrintestinais, náuseas e vômito em decorrência do consumo de derivados de maçã contaminados com essa micotoxina (LAI et al., 2000).

A patulina mostrou genotoxidade e possível atividade mutagência em células mamárias de ratos em estudo in vitro (SCHUMACHER et al., 2006). SCHUMACHER et al. (2005) mostraram que a patulina é uma genotoxina ao estudar sua mutagenicidade em células V79 de pulmão de hamster chinês. Após vários estudos em ratos, determinou-se que a dose letal (DL 50) da patulina para esses animais é variável de 15 a 35mg kg-1, dependendo do modo de administração (CODEX COMMITTEE ON FOOD ADDITIVES AND CONTAMINATS, 1998).

Essa toxina tem mostrado efeitos sobre a tireóide, os testículos e os níveis hormonais de ratos machos em fase de crescimento, mas não afeta o crescimento desses animais (SELMANOGLU & KOÇKAYA, 2004). Além disso, ela afeta a morfologia do esperma de ratos machos, diminui a quantidade de esperma e causa mudanças histopatológicas no epidídimo e na próstata (SELMANOGLU, 2006).

Células humanas têm sido usadas para avaliar a toxicidade dessa micotoxina, e os danos no DNA têm sido observados ao se expor culturas de células embrionárias de rim a diferentes concentrações de patulina (WU et al., 2005). A indução do dano oxidativo do DNA é discutido a partir da observação de que essa micotoxina reage com o antioxidante celular glutationa (FLIEGE & METZLER, 2000) e poderia diminuir sua capacidade antioxidante (LIU et al., 2003).

Estudos indicam que a patulina está associada a danos no trato gastrointestinal, incluindo úlceras e inflamação do estômago e intestino. Para caracterizar o mecanismo envolvido nos danos intestinais, MAHFOUD et al. (2002) expuseram dois tipos de células epiteliais humanas à patulina. O resultado do estudo sugeriu que a micotoxina reage com a cadeia lateral do resíduo de cisteína na proteína fosfatase de células epiteliais intestinais, resultando na perda da atividade da fosfatase, que é responsável pelo decréscimo da resistência transepitelial. Em 1995, o Joint Expert Commitee on Food Additives (JECFA) estabeleceu como ingestão diária tolerável máxima provisória (PMTDI) a dose de 0,4µg kg-1 de peso corpóreo (FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2001). Embora as avaliações revelem que a exposição da população européia está bem abaixo da PMTDI, grupos específicos de consumidores, especialmente os recém-nascidos, estão mais expostos, pois eles tendem a consumir mais produtos derivados de maçã (DRUSCH et al., 2007).

Métodos analíticos para determinação de patulina em alimentos

Muitos métodos têm sido desenvolvidos para a detecção de patulina (Tabela 2), incluindo cromatografia em camada delgada (CCD), cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia gasosa (CG) e eletroforese capilar (EC). A maioria dos métodos utiliza, na etapa de preparação de amostras, a extração líquido-líquido (ELL) (VERO et al., 1999; SEWRAM et al., 2000; AKTAS et al., 2004; IHA & SABINO, 2006; LI et al., 2007). A ELL se baseia na partição da amostra entre duas fases imiscíveis, orgânica e aquosa, sendo que a eficiência da separação está relacionada à afinidade do soluto pelo solvente de extração, da razão das fases e do número de extrações (SHEPHARD & LEGGOTT, 2000). No entanto, a extração em fase sólida (EFS) também tem sido usada para extração dessa micotoxina (EISELE & GIBSON, 2003, ITO et al., 2004; GÖKMEN et al., 2005). O problema da utilização desses métodos é o custo alto das colunas de extração em relação à ELL. Metodologias de baixo custo e menor tempo de análise, com o emprego de quantidades reduzidas de solventes orgânicos e conseqüentemente menor geração de resíduos tóxicos, têm sido desenvolvidas (TSAO & ZHOU, 2000; IHA & SABINO, 2006).

A CCD foi um dos primeiros métodos desenvolvidos para determinação de patulina, caracterizado por ser simples, de baixo custo e não exigir equipamentos sofisticados. A detecção e quantificação de patulina nas placas de sílica-gel são feitas pela formação de derivados fluorescentes, por meio do borrifamento de 3-metilbenzotiazolinona hidrazona (MBTH), em que se obtém um limite de detecção (LD) de 20µg L-1 (AOAC, 2000), ou por meio da exposição das placas de CCD a vapores de amônia e quantificação por fluorodensitometria com LD de 100µg L-1 (DURAKOVIC et al., 1993).

A diálise bifásica foi utilizada para extração de patulina, e a determinação da concentração da micotoxina foi feita por CCD (PRIETA et al., 1992) e CLAE (PRIETA et al., 1993). Nessa técnica, a membrana contendo o solvente orgânico é agitada na matriz aquosa até que os analitos de interesse, que possuem baixo peso molecular, passem através da membrana, enquanto que as demais substâncias de maior peso molecular ficam retidas na fase aquosa. A diálise bifásica caracteriza-se como um processo simples de preparação da amostra, com economia de mão-de-obra e solventes (SHEU & SHYU, 1999).

RYCHLIK & SCHIEBERLE (1999) desenvolveram dois métodos usando patulina com carbono marcado (C13). A quantificação ocorreu no primeiro método por cromatografia líquida acoplada a detector por espectrometria de massa (CL-EM) sem derivatização e no segundo método por cromatografia gasosa acoplada a detector por espectrometria de massa (CG-EM). O método CG-EM mostrou melhor reprodutibilidade, cujo coeficiente de variação foi de 9%, obteve-se recuperação de 96% e LD de 12ng L-1, que foi 100 vezes mais baixo que o LD do procedimento padrão (CLAE-UV).

A EC foi uma técnica desenvolvida para rápida análise de patulina com simples preparação da amostra e baixo custo. Com o uso da cromatografia capilar micelar eletrocinética com detector de fotodiodo a 273nm, TSAO & ZHOU (2000) obtiveram recuperação de 98%, e o LD foi de 3,8µg L-1.

A CLAE-UV é um método comumente usado para determinação e quantificação de patulina, visto que essa toxina é relativamente polar e exibe amplo espectro de absorção (GÖKMEN & ACAR, 1999; YURDUM et al., 2001; GÖKMEN et al., 2005). A extração é feita com acetato de etila, e a limpeza é realizada com solução de carbonato de sódio 1,5%. O extrato de acetato de etila é seco com sulfato de sódio anidro, evaporado, e o resíduo seco é dissolvido em água/ácido acético (pH 4) (AOAC, 2000).

O 5-hidroximetilfurfural (HMF) é o interferente mais encontrado durante a análise de patulina por cromatografia líquida, pois apresenta propriedades cromatográficas similares devido a sua estrutura química ser semelhante a da patulina (SEWRAM et al., 2000). GÖKMEN & ACAR (1999), com a utilização de fase móvel de água/acetonitrila (99:1, v/v), coluna de C18 e determinação por CLAE com detector de fotodiodo, separaram completamente o HMF da patulina. A recuperação do HMF variou de 86 a 100%, e a recuperação da patulina variou de 94 a 125%. O LD do HMF e a patulina foram de <0,01mg L-1 e <5µg L-1, respectivamente. Estratégias e controle dos níveis de patulina em maçã e suco de maçã Uma das formas de evitar a contaminação por patulina é a eliminação do fungo produtor da patulina. O hipoclorito de sódio, ao ser usado na lavagem de frutas, não permite a colonização de fungos e a conseqüente produção de patulina (HASAN, 2000). Da mesma maneira, o peróxido de hidrogênio também tem se mostrado como inibidor do crescimento de P. expansum (VENTURINI et al., 2002). A diminuição da contaminação de maçãs pelo P. expansum pode ser feita utilizando-se a oxidação eletrolisada da água. Porém, esse processo apresenta o inconveniente do custo alto do equipamento e o consumo de energia elétrica (OKULL & LABORDE, 2004).

No suco de maçã, a adição de ácido ascórbico (500mg kg-1) reduziu em 50% os níveis de patulina (AYTAÇ & ACAR, 1994). Segundo DRUSCH et al. (2007), para uma rápida degradação da patulina pelo ácido ascórbico, é necessária a presença de oxigênio e radicais livres. A oxidação do ácido ascórbico na presença de oxigênio e íons metálicos é possível fonte desses radicais. Devido ao baixo conteúdo de oxigênio no headspace das embalagens de sucos, a adição de ácido ascórbico antes do enchimento das embalagens não é uma estratégia eficiente de descontaminação.

O carvão ativado, devido às suas propriedades adsorventes, foi usado para reduzir os níveis de patulina em suco de maçã. No entanto, sabe-se que a aparência e o sabor do suco podem ser afetados pelo tratamento com esse composto (LEGGOTT et al., 2001). O uso de três gramas de carvão ativado por litro de suco de maçã, com tempo de contato de cinco minutos, resultou em redução de 62,3 para 30,8µg kg-1 nos níveis de patulina (KADAKAL & NAS, 2002).

A redução da quantidade de patulina durante o processo de clarificação do suco foi relatada por vários autores. BISSESSUR et al. (2001) estudaram alguns tipos de clarificação e constataram ser a centrifugação o método mais efetivo, com redução de 20,5% do total da toxina. Ao comparar a clarificação utilizando filtro rotatório a vácuo e ultrafiltração, ACAR et al. (1998) concluíram que o filtro rotatório foi mais eficaz na redução da patulina, com redução de 39% nos níveis da micotoxina, sendo que a ultrafiltração possibilitou 25% de redução dos níveis de patulina. WELKE et al. (2009) estudaram a redução dos níveis de patulina nas fases do processamento do suco de maçã. Os autores concluíram que, após a pasteurização, o tratamento enzimático, a microfiltração e a evaporação, a redução do conteúdo de patulina foi de 40, 28, 20 e 28%, respectivamente.

O uso de leveduras com o objetivo de degradar a patulina foi demonstrado por MOSS & LONG (2002). Os níveis da toxina foram reduzidos na presença de Saccharomyces cerevisiae, sob condições fermentativas, o que não ocorreu quando a levedura foi cultivada em condições aeróbias. Os autores confirmaram que a degradação da micotoxina tem como produtos (Z)-ascladiol e (E)-ascladiol, sendo esse último o metabólito de maior incidência.

 

CONCLUSÕES

Os estudos em animais têm demonstrado que a patulina é uma micotoxina com potencial carcinogênico, mutagênico e teratogênico. Por isso, alertas para os possíveis riscos à saúde vinculados à ingestão diária dessa micotoxina por meio do consumo de maçãs e seus produtos derivados têm sido feitos. A presença da patulina em alimentos também reflete em perdas econômicas, principalmente às indústrias que exportam seus produtos a países que controlam os níveis dessa micotoxina. Muitos métodos têm sido desenvolvidos para a determinação da patulina, empregando metodologias de baixo custo e tempo de análise, com quantidades reduzidas de solventes orgânicos e menor geração de resíduos tóxicos. A seleção das maçãs usadas para a produção de suco é uma prática positiva no sentido de diminuir os níveis dessa micotoxina no suco. Por outro lado, as frutas que são destinadas ao processamento industrial são aquelas que não atingem o padrão exigido para o consumo in natura, e o processamento caracteriza-se como uma forma de aproveitar essas frutas que seriam descartadas.

A melhor alternativa seria prevenir os danos que ocorrem na superfície das maçãs e a conseqüente colonização de fungos, que, por sua vez, podem produzir micotoxinas. Boas práticas durante a colheita e o transporte dessa fruta são importantes no que diz respeito à prevenção da infecção fúngica, bem como o armazenamento sob condições adequadas. Pesquisas sobre a ocorrência da patulina em alimentos nos diversos países do mundo, inclusive no Brasil, fazem-se necessárias devido a divergências nos resultados obtidos até então.

 

REFERÊNCIAS

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Recebido para publicação 27.12.07
Aprovado em 20.08.08

 

 

1 Autor para correspondência.