Detecção de peptídeos importantes para o diagnóstico da cisticercose bovina no immunoblot

Detection of important peptides for bovine cysticercosis diagnosis in immunoblot

ARTIGOS CIENTÍFICOS

PARASITOLOGIA

Detecção de peptídeos importantes para o diagnóstico da cisticercose bovina no immunoblot

Detection of important peptides for bovine cysticercosis diagnosis in immunoblot

Aline Girotto^I; Paulo Sérgio de Arruda Pinto^I,1; Júlio César de Oliveira Dias^I; Leandro Siqueira Chaves^I; Hanna Carolina Campos Ferreira^I

^IDepartamento de Veterinaria, Universidade Federal de Viçosa (UFV), 36570-000, Viçosa, MG, Brasil. E-mail: [e-mail]

RESUMO

A dificuldade de se localizar cisticercos em bovinos com infecção discreta torna o diagnóstico tradicional da cisticercose bovina em matadouros um recurso de baixa sensibilidade, o que gera uma demanda de diagnóstico por métodos alternativos como o immunoblot. Para tanto, neste trabalho, foram realizados ensaios de immunoblot a fim de analisar os peptídeos responsáveis pela reação do antígeno vesicular de Taenia crassiceps. Foram utilizadas 28 amostras de soro de bovinos comprovadamente negativos e 28 amostras coletadas de bovinos infectados experimentalmente com ovos de Taenia saginata. Os resultados dos ensaios de immunoblot com as amostras de soros-controle mencionadas indicaram que os peptídeos de 4-6, 14 e 18kDa destacaram-se entre os demais, mostrando altas taxas de desempenho no diagnóstico da cisticercose bovina e uma aparência diferenciada, com área e largura maiores, ao contrário dos peptídeos de média e alta massa molecular, que se apresentaram sob a forma de linha e com reações inespecíficas. O immunoblot mostrou ter um potencial como uma alternativa de diagnóstico da cisticercose bovina, incluindo sua aplicação em animais vivos, como método auxiliar de diagnóstico em estudos epidemiológicos da doença.

Palavras-chave: cisticercose bovina, Taenia saginata, Taenia crassiceps, immunoblot, peptídeos.

ABSTRACT

The diagnosis of cysticercosis in bovines that presents discreet infection is committed by the conventional methodology of detection employed in slaughterhouses. This deficiency leads to the development of alternative methods, such as immunoblot, in order to improve the detection of this disease. An immunoblot assay was developed to detect peptides from Taenia crassiceps antigenand it was used to test 56 samples of bovine serum (28 confirmed as negative and 28 from experimentally infected animals with Taenia saginata eggs). The peptides 4-6, 14 and 18 kDa showed better performance in bovine cysticercosis diagnosis due to an enhanced appearance, once they showed higher area and wide, contrasting with medium and high molecular weight peptides, that showed unspecific reactions and discreet appearance. The obtained results indicated that immunoblot can represent a potential alternative in bovine cysticercosis diagnosis, including its use in live animals, improving the detection of this disease even in epidemiological studies.

Key words: bovine cysticercosis, Taenia saginata, Taenia crassiceps, immunoblotting, peptides.

INTRODUÇÃO

A cisticercose bovina é a zoonose parasitária causada pela larva da Taenia saginata mais freqüentemente diagnosticada em matadouros, representando a principal causa de condenação de bovinos e acarretando prejuízos à pecuária (UNGAR et al., 2008). Assim, medidas eficientes de diagnóstico e controle dessa doença devem ser disponibilizadas. Considerando que o diagnóstico rotineiro da cisticercose bovina é baseado no exame anátomo-patológico realizado durante a inspeção post mortem de carcaças e vísceras em matadouros, observa-se que esse recurso diagnóstico é de baixa sensibilidade, dada a dificuldade de se localizarem cisticercos nos tecidos bovinos com infecção discreta, os quais representam a maioria dos casos encontrados.

Nesse contexto, faz-se necessária a associação de métodos imunológicos como o ELISA e o immunoblot, que apresentam alta sensibilidade e especificidade para o diagnóstico da doença (MINOZZO et al., 2004; MONTEIRO et al., 2007). Tais métodos apresentam ainda a vantagem de poderem ser utilizados no diagnóstico de animais vivos em estudos epidemiológicos (PERALTA et al., 2001).

Embora o emprego do immunoblot no diagnóstico da cisticercose bovina ainda seja pouco conhecido, esse método já vem sendo utilizado com sucesso no diagnóstico da cisticercose suína e humana (TSANG et. al., 1989; GEKELER et al., 2002; SATO et al., 2003), realizado com extratos antigênicos de larvas de Taenia saginata, Taenia solium e Taenia crassiceps. A existência de peptídeos comuns entre as larvas dos referidos parasitas facilitou os ensaios laboratoriais, permitindo para essa finalidade a escolha de antígenos de Taenia crassiceps, um cestódeo parasita de raposas, cuja forma larvária é encontrada naturalmente em pequenos roedores e se reproduz por brotamento em laboratório (VAZ et al., 1997; BUENO et al., 2000). A homogeneidade dos lotes antigênicos preparados com larvas de Taenia crassiceps e a possibilidade de sua manutenção em laboratório são vantagens da utilização destes sobre os outros dois tipos de extratos antigênicos.

Considerando que o immunoblot tem mostrado um bom desempenho no diagnóstico da cisticercose suína e humana e que ainda não vem sendo utilizado para o diagnóstico da cisticercose bovina, pretende-se avaliar o emprego desse método na detecção de peptídeos importantes para o diagnóstico da cisticercose bovina, utilizando o antígeno de Taenia crassiceps.

MATERIAL E MÉTODOS

Nos ensaios de immunoblot, foram utilizados o antígeno vesicular de Taenia crassiceps e 28 amostras referentes aos soros-controle de 28 animais negativos para cisticercose e 28 amostras de soros-controle coletadas em quatro bovinos experimentalmente infectados com ovos de Taenia saginata, em diferentes fases de evolução da doença (intervalos de 15 dias), a partir dos 90 dias da inoculação dos ovos. Para comprovar se as amostras de soro foram obtidas de animais seguramente positivos e negativos, foi realizado o exame anátomo-patológico minucioso das carcaças desses animais após abate, por meio de incisões delgadas, para localização dos cisticercos.

Obtenção dos parasitas

Os bovinos foram inoculados com auxílio de sonda gástrica, por via oral, com cerca de 120.000 ovos de Taenia saginata. Vencido o período de desenvolvimento da cisticercose, os bovinos inoculados foram abatidos após sua insensibilização e sangria, sendo realizado o exame anátomo-patológico minucioso dos tecidos para a coleta dos cisticercos de T. saginata.

Os metacestódeos de Taenia crassiceps foram mantidos em camundongos BALB/c com idade entre oito e 12 semanas por inoculação intraperitoneal de 10 parasitas de pequeno tamanho. Após 90 dias, os animais que apresentavam aumento de volume abdominal foram sacrificados sob insensibilização em éter etílico, seguida de sangria; os parasitas foram retirados da cavidade abdominal em seguida.

Na preparação do antígeno de líquido vesicular (LVcra), os parasitas íntegros foram centrifugados a 35.000g por 30 minutos a 4°C, desprezando-se o sedimento. Ao sobrenadante foi adicionado inibidor de protease Sigma P7626 (PMSF - Fluoreto de fenilmetilsulfonil, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) na concentração de 2,5mM de extrato antigênico, constituindo-se assim o antígeno LVcra, que foi conservado a -20°C.

Immunoblot

A separação dos peptídeos do antígeno vesicular de Taenia crassiceps foi conduzida pela eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), realizada em sistema descontínuo segundo Laemmli (1970), no aparelho Mini Protean II (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). A amostra de antígeno (30µg) foi diluída em solução tampão de amostra (Trizma 60mM, pH6,8, SDS 2%, glicerol 25%, 2-mercaptoetanol, 14,4mM e azul de bromofenol 0,1%), submetida a aquecimento em banho-maria a 100°C por cinco minutos imediatamente antes da sua aplicação no gel de empilhamento a 5% (Tris-HCl 0,5M, pH6,8, contendo 0,025% de SDS) e separada em gel em gradiente entre 5 e 20% (solução tamponada Tris-HCl 1,5 pH 8,8, contendo 0,025% de SDS). Foram aplicados 6µg de antígeno por mm de orifícios medindo 3 cm cada. Paralelamente à eletroforese das amostras, utilizou-se o marcador de massa molecular Sigma M 4038 (Sigma Chemical Co., Louis, MO, USA). A eletroforese foi conduzida em solução tampão de corrida (Trizma 25mM, glicina 192mM, SDS 0,1%, pH 8,3) a uma voltagem de 50V no empilhamento e 100V na separação.

Os peptídeos separados por SDS-PAGE foram transferidos do gel para membranas de nitrocelulose de 0,2µ(Millipore, USA), segundo a metodologia descrita por TOWBIN et al. (1979), utilizando solução tamponada de transferência (Tris-hidroximetilaminoetano 25mM, glicina 192mM, metanol 20%, pH 8,3). A transferência foi realizada durante um período de meia hora, à temperatura ambiente, voltagem constante de 100V e outro período de duas horas com voltagem de 150V. Após a transferência, as membranas de nitrocelulose foram coradas em solução aquosa contendo Ponceau-S a 0,5%.

A partir das membranas, foram obtidas tiras de 3 a 4mm de largura que, em seguida, foram descoradas e lavadas em solução salina (NaCl 0,15M) contendo 0,05% de Tween-20, sendo armazenadas em papel filtro até o momento de sua utilização nas etapas seguintes do teste. As tiras foram tratadas com solução bloqueadora [leite desnatado, Molico - Nestlé, dissolvido a 5% em Tris-salina (Tris-hidroximetilaminoetano 10mM, NaCl 0,15M, pH 7,4)] por uma hora sob agitação lenta à temperatura ambiente. As amostras de soro adicionadas à solução diluidora (Solução bloqueadora diluída a 1:5 em Tris-salina) foram adicionadas às tiras, que foram incubadas por 14-18 horas, a 4°C, sob agitação lenta. Após seis lavagens, cinco minutos cada, as tiras foram novamente incubadas por uma hora com o conjugado anti-IgG de bovino marcado com peroxidase, devidamente diluído (A 5295, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). As proteínas reativas foram evidenciadas com a solução cromógena (Diaminobenzidina 5mg, H₂O₂ 1,5% em PBS pH 7,2) por cerca de dois minutos. Em seguida, as tiras foram lavadas com água destilada e secas em papel filtro.

Após ensaios preliminares de padronização, foram analisadas em cada ensaio (placa) do immunoblot: duas amostras positivas, duas negativas e um controle branco.

Análise de dados

Foi determinada a freqüência média de reação dos diferentes peptídeos com os soros-controle dos dois grupos de bovinos, conforme sua condição anátomo-patológica pré-determinada.

Foram selecionados os peptídeos que reagiram somente com as amostras de soros positivas. Esses peptídeos foram provisoriamente identificados como importantes, observando os critérios de localização (massa molecular) e aparência, recomendados por Larralde et al. (1989) e analisados pelo Programa Quantity One, versão 4,6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Em função da sua freqüência de reatividade, foram determinados os seguintes parâmetros para cada peptídeo: as taxas de sensibilidade e especificidade, os valores preditivos positivos e negativos e a concordância, visando estabelecer os critérios para diferenciação das amostras de soros como positivas ou negativas ao immunoblot, bem como definir os peptídeos importantes para o diagnóstico da cisticercose bovina.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nas etapas de padronização da eletroforese e do immunoblot, optou-se por utilizar as concentrações de 1:25 para os soros e 1:2000 de conjugados em função dos melhores resultados obtidos na diferenciação preliminar entre soros-controle positivos e negativos.

Diversos peptídeos foram freqüentemente reconhecidos nas reações com as amostras de soros testadas (4-6, 14, 18, 23, 24-26, 34-36, 43-45, 51-56, 60-63, 92-93, 100-106kDa); entretanto, apenas os peptídeos de 4-6, 14 e 18kDa apresentaram valor diagnóstico. As bandas de 4-6, 14 e 18kDa destacaram-se entre as demais, mostrando uma aparência diferenciada, com área e largura maiores (Figura 1). Com menor destaque, os peptídeos de média e alta massa molecular apresentaram-se sob a forma de linha, aparência também observada por PINTO et al. (2001) no diagnóstico da cisticercose suína.

As melhores taxas de desempenho foram observadas para os peptídeos de baixa massa molecular, principalmente do peptídeo identificado como 14kDa (Tabela 1). Utilizando antígenos recombinantes de Taenia solium, Greene et al. (2000) mostraram que o peptídeo de 14kDa é importante no diagnóstico da cisticercose humana pelo teste ELISA, não obtendo mesmo êxito com o peptídeo de18kDa.

Em virtude da falta de dados referentes à utilização do immunoblot na pesquisa de anticorpos em bovinos, foram comparados os resultados desta pesquisa com os reportados em testes com amostras humanas e suínas. O desempenho do immunoblot verificado em outras pesquisas é semelhante ao mostrado nesta pesquisa, reportando altas taxas. GEKELER et al. (2002) encontraram taxas de especificidade variando entre 80 e 82%. Examinando suínos, GONZÁLEZ et al. (1990), PATHAK et al. (1994) e PINTO et al. (2001) encontraram taxas de sensibilidade e especificidade entre 97 e 100%.

Levando em consideração o risco para saúde pública e os prejuízos econômicos da cisticercose, tanto para os matadouros, quanto para os pecuaristas, medidas de controle sanitário dessa zoonose devem ser tomadas não só no momento do abate, mas também na fase de produção. Nesse sentido, o desenvolvimento de um método de diagnóstico confiável como o immunoblot poderia servir como alternativa para o aperfeiçoamento das ações de inspeção nos matadouros e das investigações epidemiológicas na rastreabilidade dos focos de cisticercose. Entretanto, pesquisas com variações no protocolo devem ser realizadas visando ampliar a avaliação do desempenho diagnóstico dos peptídeos relatados, bem como do potencial diagnóstico de diferentes antígenos, como o total e de membrana de Taenia crassiceps, empregando o immunoblot

CONCLUSÃO

Os ensaios de immunoblot realizados na avaliação da reatividade de soros-controle de bovinos sadios e acometidos de cisticercose com o antígeno do líquido vesicular de cisticercos de Taenia crassiceps evidenciaram a importância de três peptídeos de baixa massa molecular no diagnóstico da cisticercose nessa espécie. Os referidos peptídeos apresentaram altas taxas de desempenho no immunoblot e foram identificados com as massas moleculares de 4-6, 14 e 18kda. O immunoblot mostrou ser um teste útil no diagnóstico da cisticercose bovina, como já havia sido comprovado no diagnóstico dessa doença em suínos e humanos.

AGRADECIMENTO

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG), pelo financiamento da respectiva pesquisa.

COMITÊ DE ÉTICA E BIOSSEGURANÇA

O projeto de pesquisa que deu origem ao trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética do Departamento de Veterinária da Universidade Federal de Viçosa.

Recebido para publicação 11.07.08

Aprovado em 05.12.08

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1

Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Abr 2009
• Data do Fascículo
  Jul 2009

Histórico

• Aceito
  05 Dez 2008
• Recebido
  11 Jul 2008