Organogênese direta de Orthophytum mucugense

Direct organogenesis of Orthophytum mucugense

ARTIGOS CIENTÍFICOS

FITOTECNIA

Organogênese direta de Orthophytum mucugense

Direct organogenesis of Orthophytum mucugense

Carolina Oliveira de Cerqueira Lima^I,1; Maria Nazaré Guimarães Marchi^II; Alone Lima-Brito^III; Claudia Elena Carneiro^III; Moema Cortizo Bellintani^IV; José Raniere Ferreira de Santana^III

^IPrograma de Pós-graduação em Biotecnologia, Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS), 44036-336, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIPrograma de Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais, UEFS, Feira de Santana, BA, Brasil

^IIIDepartamento de Biologia, UEFS, Feira de Santana, BA, Brasil

^IVInstituto de Biologia, Universidade Federal da Bahia (UFBA), Salvador, BA, Brasil

RESUMO

Orthophytum mucugense é uma bromélia ornamental endêmica do município de Mucugê-BA que está passível de extinção. O objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo de regeneração via organogênese direta para a espécie. Os explantes raiz, caule e folha, oriundos de plantas com diferentes idades, foram inoculados em meio de cultura MS½ suplementado com BAP e ANA. Os brotos foram inoculados em meio contendo AIB e carvão ativo. As plantas foram transferidas para substrato composto de vermiculita e terra. A maior taxa de brotação foi obtida com o explante caule com 20 e 40 dias de idade em meio com 0,65mM de ANA. Na fase de enraizamento, a presença de carvão ativo interferiu positivamente no comprimento da parte aérea e do sistema radicular das plantas. As plantas foram aclimatizadas com 100% de sobrevivência.

Palavras-chave: Bromeliaceae, cultura de tecidos, micropropagação, plantas ornamentais.

ABSTRACT

Orthophytum mucugense is an ornamental bromeliad endemic to the municipality of Mucugê-BA which is vulnerable to extinction. The aim of this study was to establish a regeneration protocol via direct organogenesis for the species. The explants root, stem and leaf from plants of different ages were inoculated in the MS½ culture medium supplemented with BAP and NAA. The shoots were inoculated on medium supplemented with IBA and activated charcoal. The plants were transferred to a substrate composed of vermiculite and soil. The highest rate of sprouting was obtained with stem explants of 20 and 40 days old in medium supplemented with 0.65mM of NAA. For rooting the presence of activated charcoal had a positive influence on the length of shoot and root plants system. The plants were acclimatized with 100% survival.

Key words: Bromeliaceae, tissue culture, micropropagation, ornamental plants.

INTRODUÇÃO

Orthophytum mucugense WAND e CONCEIÇÃO é uma bromélia restrita à Chapada Diamantina - BA. As suas folhas são verdes e, na época de floração, tornam-se parcial ou completamente vermelhas, conferindo notável valor ornamental à espécie (WANDERLEY & CONCEIÇÃO, 2006). O endemismo associado ao extrativismo a torna vulnerável e desperta a necessidade de estudos relacionados à sua propagação.

Métodos de cultura de tecidos têm sido aplicados na conservação e multiplicação de genótipos específicos de bromélias. Uma das vias mais utilizadas para a regeneração dos brotos in vitro é a organogênese direta que é benéfica em termos da estabilidade genética e vem sendo utilizada em diversas espécies da família Bromeliaceae para a produção comercial de mudas, regeneração de plantas geneticamente modificadas e multiplicação de plantas conservadas in vitro.

A regeneração de plantas in vitro é um processo complexo que envolve diversos fatores, como o genótipo, a fonte e as condições fisiológicas do explante, a combinação de reguladores vegetais exógenos, o meio de cultura utilizado e as condições ambientais (LUCIANI et al., 2006).

O objetivo deste trabalho foi estabelecer um protocolo de regeneração via organogênese direta para Orthophytum mucugense.

MATERIAL E MÉTODOS

Condições de cultivo - As culturas foram mantidas em sala de crescimento sob temperatura de 25±2°C, fotoperíodo de 16h e densidade de fluxo de fótons fotossinteticamente ativos de 60µmol µm^-2 s^-1.

Micropropagação - Plantas germinadas in vitro com 20, 40 e 60 dias de idade foram seccionadas transversalmente em raiz, caule e folha. Essas plantas foram colocadas no escuro 15 dias antes da utilização, para indução do estiolamento. Os explantes foram inoculados em tubo de ensaio (25x150mm) com 15mL de meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) com metade da concentração salina (MS½) suplementado com 2,22µM de BAP (BELLINTANI et al., 2008) e duas concentrações de ANA, 0,65 e 1,30µM. O delineamento amostral foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 3x3x2 (idade do explante x tipo de explante x concentração de ANA), com 12 repetições de cinco amostras. Aos 60 dias, as variáveis analisadas foram número de brotos por explante, porcentagem de explantes com brotos e comprimento dos brotos.

Análise histológica - Para identificar a via de regeneração dos brotos, durante a micropropagação, cinco amostras de tecido foliar e caulinar de cada tratamento foram periodicamente retiradas e fixadas em álcool 70%. As amostras foram cortadas longitudinalmente e transversalmente à mão livre, com auxílio de lâmina de barbear. Os cortes foram clarificados com hipoclorito de sódio a 3% por 15 minutos, lavados em água destilada, corados com safrablau, analisados em microscópio óptico e fotografados (BUKATSCH, 1972).

Enraizamento - Brotos micropropagados com aproximadamente 5mm de comprimento foram inoculados em meio MS½ suplementado com AIB (0,00; 1,11 e 2,22µM) e carvão ativo (0 e 1g L^-1). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 3x2 (concentração de AIB x concentração de carvão ativo), com 12 repetições de cinco amostras. Aos 60 dias, as variáveis analisadas foram comprimento e peso seco da parte aérea e sistema radicular. Brotos enraizados foram transferidos para substrato composto de vermiculita e terra na proporção volumétrica de 1:1 e mantidos em viveiro com 70% de luminosidade durante 30 dias.

Análise estatística - Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste Tukey (0,05), utilizando o programa estatístico SISVAR (v. 4.4, UFLA).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O caule foi o primeiro explante a emitir resposta morfogenética in vitro, após uma semana de inoculação, seguido do explante folha, cuja resposta iniciou-se duas semanas depois. O caule apresentou as maiores médias para as variáveis porcentagem de explantes com brotos (46,11 e 43,33) e número de brotos por explante (1,21 e 0,87) independente da concentração de regulador aplicada, diferindo significativamente dos explantes folha e raiz (Tabela 1). Esses resultados corroboram os obtidos para Syngonanthus mucugensis por LIMA-BRITO et al. (2011) e pode ser atribuído à maior presença de tecidos meristemáticos no caule, quando comparados às folhas e raízes. Apesar de as folhas possuírem o meristema axilar, localizado na junção entre a sua base e o caule (LONG & BARTON, 2000), a retirada da planta mãe pode ter ocasionado perda de parte deste tecido, o que justificaria a sua baixa taxa de regeneração em relação ao explante caule.

O explante raiz não apresentou competência morfogenética nas condições as quais foi submetido, o que pode ser atribuída à extrema diferenciação deste órgão em algumas espécies, como em Syngonanthus mucugensis (LIMA-BRITO et al., 2011). Entretanto, na espécie Solanum paludosum o explante raiz demonstrou competência para a formação de brotos (BELTRÃO et al. 2008). Uma possível causa para a manutenção do potencial organogenético das raízes está na retenção da atividade meristemática em algumas células do periciclo (MAUGHAN et al. 2006).

Quanto à concentração de ANA, observa-se que, para o explante caule, o aumento da concentração desse regulador reduziu significativamente o número de brotos/explante e o comprimento médio de brotos (Tabela 1). Para Vriesea gigantea, Nidularium fulgens e Vriesea reitzzi o aumento da concentração de ANA reduziu a habilidade de regeneração de brotos in vitro (BENCKE & DROSTE, 2008, PAIVA et al. 2009, DAL VESCO & GUERRA, 2010), o que corrobora os resultados encontrados neste trabalho.

Segundo SILVA et al. (2007), muitos protocolos de multiplicação para espécies de bromélias consideram o uso do BAP associado a baixas concentrações de ANA. No entanto, os resultados obtidos neste trabalho discordam dos encontrados para Billbergia rosae e Neoglaziovia variegata, em que maiores concentrações de ANA aumentaram significativamente a quantidade de brotos (PARDO et al., 2008; SILVEIRA et al., 2009). Para o abacaxizeiro ornamental Ananas comosus var. erectifolius, o aumento na concentração de ANA favoreceu o crescimento da parte aérea de brotos micropropagados (PASQUAL et al., 2008), o que também contraria os resultados encontrados para O. mucugense.

O explante caule com 20 e 40 dias de idade apresentou uma maior porcentagem de formação de brotos, 48,33 e 56,67, respectivamente (Tabela 2). Essas taxas foram semelhantes às observadas em Vriesea gigantea, mas inferiores à encontrada em V. philippocoburgi, (DROSTE et al., 2005). O número médio de brotos obtidos para Neoreglia cruenta também foi inversamente proporcional à idade do explante, pois explantes mais jovens (49 dias) apresentaram um percentual de brotação superior a explantes mais velhos (154 dias), 64,28% e 22 a 33%, respectivamente (CARNEIRO et al. 1999). Entretanto, para a bromélia Tillandsia eizii, a idade do explante, 21 e 84 dias, não afetou significativamente as variáveis % de explantes com brotos e número de brotos/explante (PICKENS et al. 2006). O sucesso na propagação de explantes mais jovens pode ser atribuído à existência de muitas células meristemáticas e indiferenciadas que apresentam crescimento rápido, o que é essencial para iniciar as culturas (SHIN et al., 2000; BISPO et al., 2007). Quanto à variável comprimento médio de brotos, explantes com 40 dias de idade, independente da concentração de regulador aplicada, produziram brotos maiores, 7,80 e 5,99mm, não diferindo significativamente apenas do caule com 20 dias na concentração de 1,30µM de ANA. O aumento da concentração de ANA reduziu o número de brotos/explante em segmentos caulinares com 60 dias de idade (Tabela 2).

A partir da análise histológica, foi possível constatar que a exposição dos explantes em meio com regulador de crescimento proporcionou regiões de intensa divisão celular (Figura 1). No explante caule, a origem da região com atividade mitótica ocorreu no câmbio vascular com a formação de células com características meristemáticas, sendo essas pequenas, com núcleo proeminente e divisões celulares periclinais e anticlinais (Figura 1A-C). A formação dos brotos ocorreu por organogênese direta nas duas fontes de explante utilizadas, devido à formação de um tecido apenas com o eixo caulinar (monopolar) e a junção observada entre os feixes vasculares dos brotos com o explante (Figura 1C-E). A organogênese direta também foi evidenciada pela presença da ligação entre os vasos condutores do explante e dos brotos (Figura 1C-E), e a ausência da desdiferenciação do tecido com a passagem pela fase de calo antes da formação do broto. Nas folhas, a diferenciação ocorreu no parênquima clorofiliano onde foi possível observar células em divisões periclinais e anticlinais (Figura 1 e).

O AIB, nas concentrações testadas, não favoreceu a rizogênese in vitro de O. mucugensis, e o aumento da sua concentração associado à presença de carvão ativo teve um efeito negativo sobre o comprimento das raízes, reduzindo-as significativamente de tamanho (33,16mm) (Tabela 3). Esses resultados estão de acordo com os encontrados para a bromélia Vriesea scalaris e para o híbrido PExSC-52 do abacaxizeiro, demostrando que outros fatores como o tamanho da parte aérea e a produção endógena de auxina pela planta, interferem na rizogênese (BARBOZA et al., 2004; SILVA et al., 2009).

Assim, o fato do AIB nas condições testadas não ter favorecido o enraizamento de O. mucugensis não garante que outras concentrações desta ou de outras auxinas não sejam benéficas. Afinal, para outras espécies de bromélias como Vriesea cacuminis, Ananas comosus e Aechmea blanchetiana, a presença de auxinas, como ANA e AIB, favoreceu o enraizamento (MENDES et al., 2007; CHU et al., 2010; MORAES et al., 2010).

Por outro lado, a presença de carvão ativo interferiu positivamente no comprimento da parte aérea e do sistema radicular de brotos. Na sua ausência e em meio suplementado com 1,11µM de regulador, o tamanho da parte aérea (27,80mm) e do sistema radicular (21,22 e 22, 76mm) foram significativamente menores que os observados nos demais tratamentos (Tabela 3). O carvão ativo favorece o enraizamento in vitro, dentre outros fatores, por simular condições de escuro que interfere na atividade e/ou na estabilidade de reguladores vegetais (PAN & STADEN, 1998). Entretanto, para algumas espécies como Pyrus communis e Bauhinia cheilantha, a presença do carvão ativo não favoreceu a rizogênese (DAMIANI & SHUCH, 2009; GUTIÉRREZ et al. 2011). As únicas variáveis que não sofreram influência do carvão ativo foram a massa seca da parte aérea e do sistema radicular, sendo que para esta última houve um decréscimo quando associado com 2,22µM de AIB (Tabela 3).

As plantas aclimatizadas apresentaram 100% de sobrevivência aos 30 dias da transferência.

CONCLUSÃO

A micropropagação do O. mucugense via organogênese direta pode ser feita utilizando-se o explante caule entre 20 e 40 dias de idade em meio MS½ suplementado com 0,65mM de ANA e 2,22mM de BAP. A presença de carvão ativo (1g L^-1) interferiu positivamente no comprimento da parte aérea e do sistema radicular dos brotos.

Recebido para publicação 25.03.11

Aprovado em 07.10.11

Devolvido pelo autor 27.12.11

CR-5006

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1

Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Mar 2012
• Data do Fascículo
  Fev 2012

Histórico

• Recebido
  25 Mar 2011
• Aceito
  07 Out 2011