Aplicação de análogo de brassinosteroide (Biobras 16®) sobre a germinação e crescimento in vitro de embriões zigóticos e aclimatização de plântulas de bocaiuva

Application of analogue brassinosteróide (Biobras 16®) germination and growth in vitro culture of zygotic embryos and acclimatization of bocaiuva

ARTIGOS CIENTÍFICOS

FITOTECNIA

Aplicação de análogo de brassinosteroide (Biobras 16^®) sobre a germinação e crescimento in vitro de embriões zigóticos e aclimatização de plântulas de bocaiuva

Application of analogue brassinosteróide (Biobras 16^®) germination and growth in vitro culture of zygotic embryos and acclimatization of bocaiuva

Elis Borcioni^I,; ¹; Raquel Rejane Bonato Negrelle^II

^IPrograma de Pós-graduação em Agronomia, Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo, Universidade Federal do Paraná (UFPR), 80035-050, Curitiba, PR, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIDepartamento de Botânica, UFPR, Curitiba, PR, Brasil

RESUMO

Apresentam-se resultados de pesquisa experimental que avaliou o crescimento in vitro de embriões zigóticos e aclimatização de plântulas de bocaiuva (Acrocomia aculeata) cultivadas em diferentes concentrações (0,0; 0,001; 0,005; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 e 1mg L^-1) de análogo de brassinosteroide (Biobras 16^®). O trabalho buscou verificar se a aplicação de Biobras 16^® influencia positivamente na taxa de germinação dos embriões zigóticos de Acrocomia aculeata e se promove o crescimento e desenvolvimento das plântulas e, consequentemente, afeta o número de plântulas normais. A aplicação de Biobras 16^® não promoveu acréscimo no percentual de germinação, porém, estimulou a formação de plântulas normais. |O efeito positivo de Biobras 16^® foi observado apenas na primeira fase, não sendo observado nas demais fases de crescimento avaliadas.

Palavras-chave:Acrocomia aculeata, arecaceae, cultivo de embriões zigóticos, germinação, regulador vegetal.

ABSTRACT

The results of an experimental research evaluating the in vitro growth of zygotic embryos and acclimatization of bocaiuva (Acrocomia aculeata) grown under different concentrations (0.00, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 and 1mg. L^-1) of a brassinosteroid analogue (Biobras 16^®) are presented. The objective was to determine whether the application of 16 Biobras ^® positively affects the germination of zygotic embryos of Acrocomia aculeata and promotes the growth and development of seedlings and thereby affects the number of normal seedlings. The application of Biobras 16^® did not promote an increase in the percentage of germination but stimulated the formation of normal seedlings. The positive effect of Biobras 16^® was observed only in the first phase, not observed in other growth stages evaluated.

Key words:Acrocomia aculeata, arecaceae, zygotic embryos cultivation, germination, growth regulator.

INTRODUÇÃO

A palmeira bocaiuva [Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd. ex. Martius] tem despertado interesse devido às suas potencialidades como oleaginosa, podendo ultrapassar quatro mil litros de óleo por hectare (NUCCI, 2007), além de ser resistente à seca (HIANE et al., 2005; TEIXEIRA, 2005). Porém, a propagação via sementes é limitada devido à ocorrência de dormência física, causada pela impermeabilidade dos tecidos da semente ou do fruto (TEIXEIRA, 2005; BANDEIRA, 2008) que, pelo elevado teor de óleo (HIANE et al., 2005), são também susceptíveis a deterioração (MARCOS FILHO, 2005), retardando, dessa forma, a germinação e produção de mudas.

Em vista disso, uma das potenciais soluções seria o cultivo de embriões zigóticos in vitro. Essa técnica consiste no isolamento e cultivo asséptico de embriões em meio de cultura visando a superar a dormência de sementes e ou viabilizar para que os embriões sejam utilizados como fonte de explantes (HU & FERREIRA, 1998). Resultados satisfatórios utilizando essa técnica têm sido reportados em trabalhos com palmeiras (PEREIRA et al., 2006; STEINMACHER et al., 2007; LEDO et al., 2007; BANDEIRA, 2008; SOARES et al., 2011).

Com relação à bocaiuva, diversas pesquisas já demonstraram a viabilidade do cultivo in vitro. SITTOLIN & CUNHA (1987) utilizaram esta técnica para produção de mudas de bocaiuva visando à implantação de um banco de germoplasma, com o propósito de possibilitar o acompanhamento e avaliação do potencial da cultura para produção do óleo. TABAI et al. (1990) utilizaram a cultura de embriões zigóticos para reduzir o tempo de germinação das sementes dessa mesma espécie. BANDEIRA (2008) observou que os embriões de bocaiuva germinaram com facilidade quando isolados da semente e cultivados in vitro, existindo a possibilidade de a dormência estar associada à presença de substâncias inibidoras na semente ou a outros fatores. Porém, RIBEIRO et al. (2010) observaram que essas substâncias inibidoras das estruturas adjacentes ao embrião não influenciam na germinação in vitro de bocaiuva. Em relação à composição do meio de cultura, SOARES et al. (2011) obtiveram a maior porcentagem de germinação de embriões, aos 60 dias, em meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), na composição e concentração original, sem utilização de regulador vegetal.

Adicionalmente, a produção de mudas por esta via pode ser otimizada a partir da utilização de reguladores vegetais LEDO et al. (2007), entretanto, pouco se sabe sobre o uso dessas substâncias no desenvolvimento de plantas de bocaiuva cultivadas in vitro. Nesse contexto, salienta-se o uso de brassinosteroides que produzem efeitos morfológicos e fisiológicos no desenvolvimento vegetal, sendo conhecidos como uma nova classe de hormônios vegetais TAIZ & ZEIGER, (2008). São ativos em pequenas concentrações, apresentam baixa toxicidade, quando utilizados nas concentrações recomendadas, estimulam e ou inibem o crescimento radicular (MÜSSIG et al. (2003); BAO et al. (2004) e MAZORRA & NUÑEZ (2008)), promovem a divisão e alongamento celular (GROVE et al. (1979) e CLOUSE & SASSE (1998)), podendo interagir com outros hormônios ou agir de forma similar a estes. Além disso, proporcionam o aumento no rendimento e produção de biomassa, aceleram o processo de maturação das plantas (MAZORRA & NUÑEZ (2008)), aumentam o percentual de germinação de sementes, florescimento, retardamento da abscisão de folhas (RAO et al., 2002), aumentam a resistência ao ataque de pragas e doenças, bem como aumentam a tolerância das plantas ao estresses abióticos (KRISHNA, 2003; NÚÑEZ et al., 2006). A presença de brassinosteroides é ampla no reino vegetal e, desde sua identificação, estudos têm verificado a possibilidade de uso em cultivos agrícolas (MANDAVA et al., 1988) e compostos análogos têm sido sintetizados para uso comercial (CORTES et al., 2003).

Dentre os vários análogos de brassinosteroides que vem sendo avaliados quanto à sua eficácia na promoção do crescimento vegetal, inclui-se o Biobras 16^®, uma formulação comercial cuja substância ativa é um análogo de brassinosteroide espirostano polihidroxilado de fórmula C₂₇H₄₂O₅. Esse produto pode ser aplicado via aspersão ou adicionado ao meio de cultura (COLL et al., 1995).

Como os resultados com a aplicação de brassinosteroides e seus respectivos análogos, especificamente Biobras 16^®, não são homogêneos para todas as espécies testadas, são utilizados de maneira diferenciada tanto em estudos de germinação, enraizamento de estacas, embriogênese somática. Especificamente, visou-se avaliar diferentes concentrações de Biobras 16^® na germinação dos embriões zigóticos de bocaiuva e na promoção do crescimento e desenvolvimento de plântulas normais.

MATERIAL E MÉTODOS

A pesquisa foi conduzida no Laboratório de Micropropagação de Plantas do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo, Setor de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Paraná (UFPR), Curitiba, Paraná, Brasil.

Embriões zigóticos obtidos de frutos maduros de bocaiuva foram utilizados como fonte de explantes. Os frutos foram coletados em uma população natural, existente na Fazenda Campanário, no município de Bodoquena, Mato Grosso do Sul, Brasil, com as seguintes coordenadas: 20°22'30" S, 56°32'31" W e 180m de altitude.

Os frutos foram processados, removendo-se manualmente o epicarpo. Mecanicamente, por meio de martelo, procedeu-se à quebra do endocarpo para obtenção da amêndoa e, posterior, retirada do embrião. As amêndoas foram desinfestadas em solução de hipoclorito de sódio laboratorial (10 a 12%) na concentração de 1% por 15 minutos, dentro da câmara de fluxo laminar, em constante agitação. Após, foram realizadas três lavagens com água deionizada e autoclavada e, em seguida, com o auxílio de pinças e bisturis, foram retirados os embriões zigóticos.

Antes de serem transferidos para o meio de cultivo, os embriões permaneceram embebidos em água deionizada e autoclavada até que os embriões fossem extraídos de todas as amêndoas. Posteriormente, foram imersos em hipoclorito de sódio laboratorial na concentração de 0,5% acrescido de 0,1ml do surfactante Tween 20^® durante 10 minutos e, a seguir, foram lavados em água deionizada e autoclavada.

Em câmara de fluxo laminar, os embriões zigóticos foram inoculados individualmente em tubos de ensaio (25x150mm) contendo 20ml de meio de cultura. Estes foram acondicionados em sala de crescimento, em ausência de luz e em temperatura de 25±2°C, nos primeiros 30 dias. Posteriormente, as plântulas foram cultivadas com fotoperíodo de 16 horas a 25±2°C, permanecendo nessas condições até o término do experimento.

O meio de cultivo utilizado foi WPM - Wood Plant Medium (LLOYD & MCCOWN, 1980), suplementado com 30g L^-1 de sacarose, 1g L^-1 de carvão ativado, 6g L^-1 de ágar e diferentes combinações de Biobras 16^®, produto gentilmente fornecido pelo Instituto Nacional de Ciências Agrícolas (INCA), localizado em San Jose de la Lajas, La Habana, Cuba. O pH do meio foi ajustado para 5,8, sendo posteriormente autoclavado (120°C, a 1,2atm de pressão, por 20 minutos).

Os tratamentos consistiram da adição de Biobras 16^® em diferentes concentrações (0; 0,001; 0,005; 0,01; 0,05;0,1; 0,5 e 1mg L^-1) adicionados ao meio de cultivo. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com quatro repetições de 20 tubos cada tratamento.

Após 90 dias de cultivo, as plantas que apresentaram crescimento de parte aérea e raiz passaram para a fase de pré-aclimatização. As plantas foram retiradas do tubo de ensaio, lavadas em água e transplantadas para sacos plásticos (5cmx10cm) contendo substrato na proporção 1:1 (solo + areia), acondicionadas em bandejas transparentes sendo cobertas com outra idêntica selada com fita, para evitar a desidratação excessiva das plantas. A irrigação foi realizada uma vez por semana, adicionando-se 10ml de água em cada planta. Estas permaneceram em sala de crescimento, nestas condições, durante seis semanas, quando então foram transferidas para casa de vegetação.

Na fase de aclimatização em casa de vegetação, a abertura das bandejas foi sendo realizada gradativamente, sendo retirada após duas semanas. Passadas mais duas semanas, as plantas foram transferidas para sacos plásticos (18cmx30cm), contendo solo + areia+ húmus na proporção de (2:1:1), sendo a irrigação realizada uma vez por semana.

As observações foram feitas semanalmente e as variáveis analisadas durante o período experimental foram: porcentagem de germinação, sendo considerados germinados os embriões que emitiram parte aérea e ou raiz e porcentagem de plântulas normais, ou seja, aquelas que apresentaram expansão foliar e, esporadicamente, desenvolvimento de raízes secundárias durante o período em que as plântulas estavam in vitro. Avaliou-se também o comprimento médio das folhas e raízes, altura, número de folhas e de raízes na fase de pré-aclimatização em caixas plásticas (90 dias após a inoculação) e aclimatização em casa de vegetação (150 dias após a inoculação). A análise estatística foi feita por meio do programa ASSISTAT, versão 7.6 beta (SILVA, 2011). Os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey quando significativas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nos primeiros sete dias após a inoculação, observou-se o intumescimento dos embriões, indicando o início do processo germinativo. Aos 21 dias após o início do cultivo, aproximadamente 70% dos embriões, em todos os tratamentos, estavam germinados, sendo que, aos 35 dias, final do processo germinativo de embriões zigóticos de bocaiuva obteve-se uma taxa de germinação de 80%. Foram observados altos índices de germinação dos embriões zigóticos (70-87%), conforme a tabela 1.

Entretanto, no que se refere à melhora na eficácia da germinação, para a espécie estudada, não foi possível detectar efeito significativo da aplicação de diferentes concentrações de Biobras 16 . Esses resultados podem ser um indicativo de resposta padrão para a família Arecaceae, dado que outras pesquisas também relatam a ineficiência do uso de reguladores vegetais sobre o processo germinativo (COSTA & ALOUFA, 2007; BANDEIRA, 2008). Esta resposta na qual a não aplicação do brassinosteroide apresenta resultado mais satisfatório poderia ser devido à utilização de embriões zigóticos em estágio maduro ou próximo a este, que, neste caso, podem germinar e crescer num meio orgânico, sendo dispensável a aplicação de reguladores de vegetais (HU & FERREIRA, 1998). Nesse sentido, é interessante destacar que o estádio fisiológico dos frutos (imaturos ou maduros) pode influenciar na germinação de palmeiras, como relatado em trabalho com Astrocaryum spp. (PEREIRA et al., 2006). Além disso, embriões de muitas espécies utilizam as reservas do próprio embrião para promover a germinação in vitro (GARCÍA et al., 2002).

Para a variável porcentagem de plântulas normais, observou-se influencia das distintas concentrações do análogo de brassinosteroide, sendo que os valores de todos os tratamentos oscilaram entre 18 e 53%. O tratamento em que se aplicou 0,5mg L^-1 de Biobras 16^® apresentou o melhor resultado (Tabela 1).

No que concerne à fase de pré-aclimatização, observaram-se diferenças significativas para algumas das variáveis analisadas de forma isolada. Dentre estas, em relação ao comprimento médio das folhas, pode-se inferir que a adição de brassinosteroide nas concentrações de 0,001 e 0,005mg L^-1 inibiu o crescimento das folhas, pois os valores nessas concentrações são estatisticamente inferiores ao controle (Tabela 2). O tratamento sem adição do brassinosteroide (controle) obteve resultado estatisticamente igual ao obtido nas concentrações 1,0 e 0,05mg L^-1. Ressalta-se, neste caso, o fato de os embriões zigóticos serem provenientes de uma população natural de bocaiuva que normalmente apresentam alta diversidade genética entre os indivíduos.

As variáveis número de folhas e raízes e altura das plântulas não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos aplicados (Tabela 2). No que se refere ao comprimento radicial, verifica-se que, nas concentrações 0,001 e 0,005mg L^-1, foram obtidos os valores mais baixos, podendo inferir que o Biobrás 16^® não estimulou o crescimento radicular das plântulas de bocaiuva. Os brassinosteroides, de maneira geral, podem estimular e ou inibir o crescimento radicular, fato reportado por MÜSSIG et al., 2003; BAO et al., 2004; MAZORRA & NÚÑEZ, 2008. De modo geral, a concentração de 1,0mg L^-1 de Biobras 16^® apresentou efeito positivo sobre maior número de variáveis associadas a fase de pré-aclimatização.

Na fase de aclimatização em casa de vegetação, detectou-se diferença significativa apenas para o comprimento médio das folhas, sendo que a concentração de 0,1mg L^-1 foi superior aos demais tratamentos avaliados, porém não diferiu do controle (Tabela 3).

Vários mecanismos de ação têm sido sugeridos para explicar a promoção do crescimento de plantas mediado por análogos de brassinosteroides. No entanto, mesmo diante de todas essas possibilidades, o estudo dessas substâncias, especialmente em palmeiras, ainda são escassos, ou seja, há um longo caminho a percorrer antes de entender o real impacto destes compostos sobre a dinâmica de crescimento e desenvolvimento dessas espécies. Entretanto, os resultados obtidos reforçam a possibilidade do emprego de brassinosteroides no início do processo germinativo, tendo em vista que a influencia positiva da aplicação do análogo de brassinosteroide não foi observada nas fases posteriores. Nessa perspectiva, sugere-se testar outras concentrações do análogo brassinosteroide e realizar outras aplicações ao longo do cultivo para verificar a influencia desse regulador no crescimento das plantas de bocaiuva, uma palmeira com expressiva importância ecológica, econômica e social.

CONCLUSÃO

A aplicação de análogo de brassinosteroide em meio de cultivo WPM não promoveu aumento na porcentagem de germinação dos embriões zigóticos de bocaiuva. O Biobras 16^® estimulou a formação de plântulas normais, embora esse efeito não tenha sido observado nas demais fases de crescimento.

Recebido para publicação 18.05.11

Aprovado em 26.11.11

Devolvido pelo autor 26.01.12

CR-5373

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Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Mar 2012
• Data do Fascículo
  Fev 2012

Histórico

• Recebido
  18 Maio 2011
• Aceito
  26 Nov 2011