Identificação bioquímica e molecular de Lactobacillus spp. isolados do íleo de frangos de corte tratados ou não com antimicrobianos

Biochemical and molecular characterization of Lactobacillus spp. isolated from the ileum of broilers treated with or without antimicrobials

Resumos

Objetivou-se caracterizar bioquimicamente e molecularmente as espécies de Lactobacillus spp. isoladas do íleo de frangos de corte tratados ou não com antimicrobianos. Utilizou-se 400 pintos de corte alojados em 25 boxes de 2m² (16 aves/boxe), distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado, em grupos de cinco tratamentos e cinco repetições: dieta sem promotor de crescimento; dieta com promotor de crescimento; dieta com 0,4% de óleo de aroeira-vermelha (OAV); dieta com 200mg de vitamina E kg-1; dieta com 0,4% OAV e 200mg de vitamina E kg-1. Após a caracterização fenotípica do gênero Lactobacillus, foram identificadas, em ambas as metodologias, 100 amostras de Lactobacillus spp. sendo 20 amostras por tratamento. Os resultados bioquímicos identificaram L. acidophilus, L. fermentum, L. plantarum, L. delbrueckii subsp. delbrueckii além de Lactococcus lactis subp. lactis. Para as amostras padrão ATCC, a identificação bioquímica suscitou algumas dúvidas em relação aos seus resultados. Os resultados da identificação molecular mostraram que os Lactobacillus que amplificaram ambos os iniciadores (LU-1'/ Lac-2) e (Laci-1 / 23-10C) são os da espécie L. acidophilus. As amostras que amplificaram apenas com o iniciador (LU-1'/ Lac-2) tratam-se das demais espécies que compõe o grupo L. acidophilus. Já as amostras com o iniciador L. fermentum (Fer 3/Fer 4) amplificaram um fragmento de 192pb padrão para essa espécie. Conclui-se que a identificação das espécies de Lactobacillus spp. isoladas do íleo a partir da PCR apresentou-se mais sensível que o método bioquímico.

frangos de corte; antibióticos; Schinus terebinthifolius Raddi; óleo essencial; PCR

ARTIGOS CIENTÍFICOS

PRODUÇÃO ANIMAL

Identificação bioquímica e molecular de Lactobacillus spp. isolados do íleo de frangos de corte tratados ou não com antimicrobianos

Biochemical and molecular characterization of Lactobacillus spp. isolated from the ileum of broilers treated with or without antimicrobials

Surama Freitas Zanini^I,1; Jamili Maria Suhet Mussi^II; Marcos Santos Zanini^I; Dyeime Ribeiro Sousa^III; Bruna Mirelly de Souza Pessotti^IV; João Damasceno Lopes Martins Damasceno^IV; Maria Aparecida da Silva^V

^IDepartamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES), CP 16, 29500-000, Alegre, ES, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIPrograma de Pós-graduação em Ciência Animal, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, MG, Brasil

^IIIPrograma de Pós-gradução em Ciências Veterinárias, UFES, Alegre, ES, Brasil

^IVPrograma de Pós-gradução em Biotecnologia, UFES, Vitória, ES, Brasil

^VPrograma de Pós-gradução em Ciência Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF), Campos, RJ, Brasil

RESUMO

Objetivou-se caracterizar bioquimicamente e molecularmente as espécies de Lactobacillus spp. isoladas do íleo de frangos de corte tratados ou não com antimicrobianos. Utilizou-se 400 pintos de corte alojados em 25 boxes de 2m² (16 aves/boxe), distribuídos em um delineamento inteiramente casualizado, em grupos de cinco tratamentos e cinco repetições: dieta sem promotor de crescimento; dieta com promotor de crescimento; dieta com 0,4% de óleo de aroeira-vermelha (OAV); dieta com 200mg de vitamina E kg^-1; dieta com 0,4% OAV e 200mg de vitamina E kg^-1. Após a caracterização fenotípica do gênero Lactobacillus, foram identificadas, em ambas as metodologias, 100 amostras de Lactobacillus spp. sendo 20 amostras por tratamento. Os resultados bioquímicos identificaram L. acidophilus, L. fermentum, L. plantarum, L. delbrueckii subsp. delbrueckii além de Lactococcus lactis subp. lactis. Para as amostras padrão ATCC, a identificação bioquímica suscitou algumas dúvidas em relação aos seus resultados. Os resultados da identificação molecular mostraram que os Lactobacillus que amplificaram ambos os iniciadores (LU-1'/ Lac-2) e (Laci-1 / 23-10C) são os da espécie L. acidophilus. As amostras que amplificaram apenas com o iniciador (LU-1'/ Lac-2) tratam-se das demais espécies que compõe o grupo L. acidophilus. Já as amostras com o iniciador L. fermentum (Fer 3/Fer 4) amplificaram um fragmento de 192pb padrão para essa espécie. Conclui-se que a identificação das espécies de Lactobacillus spp. isoladas do íleo a partir da PCR apresentou-se mais sensível que o método bioquímico.

Palavras- chave: frangos de corte, antibióticos, Schinus terebinthifolius Raddi, óleo essencial, PCR.

ABSTRACT

This study aimed to characterize biochemically and molecular species of Lactobacillus spp. isolated from the ileum of broiler chickens treated with or without antimicrobial. A total of 400 day-old male chicks, Cobb, distributed in a randomized design in groups of five treatments and five replicates: diet without antimicrobials; diet with antimicrobials; diet with 0.4% Brazilian red pepper oil (BRP); diet with 200mg vitamin E kg^-1; diet with 0.4% BRP and 200mg vitamin E kg^-1. The biochemical results have identified L. acidophilus, L. fermentum, L. plantarum, L. delbrueckii subsp. delbrueckii besides Lactococcus lactis subp. Lactis. For samples ATCC, the biochemical identification raised some doubts about their results. The molecular identification showed that Lactobacillus that amplified both primers (LU-1 '/ Lac-2) and (Laci-1 / 23-10C) are the species L. acidophilus. However, samples that amplified only with primer (LU-1 '/ Lac-2) are other species that constitute the group L. acidophilus. However, the samples with the primer L. fermentum (Fer 3/Fer 4) amplified a 192pb fragment pattern for this species. We conclude that the identification of species of Lactobacillus isolated from the ileum of PCR was more sensitive than the biochemical method.

Key words: broilers, antibiotics, Schinus terebinthifolius Raddi, essential oil, PCR.

INTRODUÇÃO

A avicultura brasileira ocupa posição de destaque devido a grande eficiência para produzir carnes de excelente qualidade, com intervalo de tempo e custos reduzidos (UBA, 2011). Um dos fatores para a obtenção da alta produtividade é utilização de antimicrobianos nas dietas, no entanto, isso causou restrições da indústria avícola brasileira, por parte de países importadores, pois esses produtos podem favorecer a resistência a antimicrobianos e acumular resíduos na carne (GODOI et al., 2008). Por isso, novos aditivos alternativos com atividades antibacterianas vêm sendo estudados, como os extratos vegetais, óleos essenciais, prebióticos e probióticos (GABRIEL et al., 2009; SILVA et al., 2010; SILVA et al., 2011; TRAEZEL et al., 2011.

Foi demonstrado que o uso da planta Schinus terebinthifolius apresenta atividade antimicrobiana (MARTINEZ et al., 1996) e que óleo essencial não mostrou nenhuma toxicidade em animais e humanos (BARBOSA et al., 2007).

As bactérias do gênero Lactobacillus são ácido-láticas, do tipo bastonetes, Gram-positivos e não-esporulados com cerca de 80 espécies reconhecidas (AXELSSON, 2004), apresentam propriedades antimicrobianas, pois produz metabólitos que competem por sítios de adesão, demonstrando assim atividade antagonista contra micro-organismos patogênicos (VANDEPLAS, 2010).

A identificação das espécies de acordo com critérios fisiológicos e métodos bioquímicos são notoriamente difíceis e ambíguos, pois são requeridos diferentes testes de fermentação (HAMMES & VOGEL, 1995; DE MARTINIS, 2002). Por outro lado, a identificação utilizando PCR comparada à identificação da fermentação de carboidratos, é mais precisa e rápida, pois a fermentação de carboidratos demonstra ser subjetiva devido às variações, principalmente na diferenciação das amostras de Lactobacillus spp. (BARROS et al., 2009).

Objetivou-se identificar bioquimicamente e molecularmente espécies de Lactobacillus spp. isoladas do íleo de frangos de corte tratados ou não com antimicrobianos.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados 400 pintos de corte, machos, da linhagem Cobb, em um período de 1 a 41 dias de idade, alojados em 25 boxes de 2m² e distribuídos em delineamento inteiramente casualizado, em grupos de cinco tratamentos e cinco repetições com 16 aves cada. Esses tratamentos corresponderam a dieta sem antibiótico e sem anticoccidiano (controle negativo); dieta com antibiótico e anticoccidiano (controle positivo); dieta com 0,4% de óleo de aroeira-vermelha; dieta com 200mg de vitamina E kg^-1; dieta com 0,4% de óleo de aroeira-vermelha e 200mg de vitamina E kg^-1. Bacitracina de zinco 15% (45mg kg^-1) e salinomicina 12% (66mg kg^-1) foram o antibiótico e o anticoccidiano utilizados no grupo controle positivo.

O óleo essencial de frutos maduros de aroeira-vermelha (S. terebinthifolius Raddi) foi obtido pela técnica de destilação por arraste a vapor (BERTOLDI, 2006). Entre os compostos presentes no óleo essencial de aroeira-vermelha, obtido de frutos maduros, o α-pineno foi o constituinte majoritário (29,39%) seguido pelo δ-careno (19,69%), limoneno (18,15%) e α-felandreno (9,39%).

Ao final do período experimental cinco aves por tratamento foram submetidas a jejum de seis horas, para posterior isolamento de um fragmento do íleo (Divertículo de Meckel até a junção ileocecal), de aproximadamente 15cm de comprimento, separada por ligaduras, removida, acondicionada em sacos de plástico, colocada em caixa térmica contendo gelo e encaminhados ao setor de Microbiologia.

Para cada amostra de íleo foi injetado 10mL de caldo Tioglicolato de Sódio Reduzido seguido de homogeneização e sucção de 1mL do caldo introduzido. Em seguida, foram realizadas diluições decimais das amostras em tubos de ensaio contendo 9mL de Tioglicolato de Sódio. Em seguida, foi coletada uma amostra de 0,1mL dos tubos de ensaio contendo diluições de 10^-6 das amostras e transferida para placas de Petri contendo o meio Agar de Man, Rogosa e Sharp (MRS). Em seguida foram colocadas em jarras de anaerobiose com sistema Anaerobac e incubados em estufa a 37°C por 72horas.

As amostras isoladas do íleo de frangos de corte e selecionadas como do gênero Lactobacillus apresentaram-se Gram-positivas, catalase negativa, com produção de gás a partir da glicose e H₂S negativo (TSI), totalizaram 20 amostras por tratamento. Foram utilizadas como controle positivo amostras de referência de Lactobacillus acidophilus ATCC 314, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, L. fermentum ATCC 9338, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ATCC 7830.

A seguir, as colônias previamente selecionadas e identificadas como Lactobacillus spp. foram submetidas a testes de fermentação de diferentes carboidratos, individualmente, com a identificação da espécie pelo sistema API^®50CH. O API^®50CH é um sistema padronizado que associa 50 testes bioquímicos (controle mais 49 carboidratos) para o estudo da fermentação de açúcares da galeria API^®50CH, que é utilizado em conjunto com meio de cultura API^®50CHL Usando uma pipeta estéril, a suspensão bacteriana presente no meio de cultura API^®50CHL foi homogeneizada e distribuída em cada um dos 50 microtubos da galeria API50CH (numerados de 0 a 49), que contêm os respectivos substratos para o estudo do perfil fermentativo da cultura. Todos os microtubos foram recobertos com óleo de parafina estéril para fins de anaerobiose e incubados a 37ºC. Todas as cepas de referência e as amostras isoladas de aves foram semeadas no meio API50^®CHL (API^®systems, bioMérieux) .Durante o período de incubação, a fermentação, traduz-se por uma alteração de cor no tubo, devido a uma produção de ácido em anaerobiose revelada pelo indicador de pH do meio. De acordo com os dados referentes à fermentação de cada carboidrato, foi realizada a interpretação através de um software API-WEB, bioMérieux^®Analytical products, no qual foi obtido o percentual de identificação.

Considerando-se a análise morfológica e bioquímica dos isolados comparou-se com a caracterização molecular utilizando-se iniciadores específicos descrito por SONG et al. (2000) para a técnica da reação em cadeia da polimerase - PCR. A identificação da espécie foi realizada por PCR multiplex em duas etapas, de acordo com o método descrito por SONG et al. (2000).

Foram também utilizados controles positivos (DNA extraído das amostras de referência) e negativos (reação contendo todos os componentes da PCR, exceto DNA bacteriano) para controle de amplicons.

Os produtos da PCR (12µL) foram acrescidos com solução tampão de corrida e submetidos à eletroforese (50V/ 80minutos) em gel de agarose a 1,7% corado com 5µL de brometo de etídio (100ngµL^-1) juntamente com o marcador de pesos moleculares padrão (50pb DNA Ladder. Invitrogen Corporation). Posteriormente visualizados em transiluminador com ultravioleta (UV) e fotografados através do sistema de fotodocumentação.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com base em resultados da contagem de unidades formadores de colônia (UFC) verificou-se que o grupo controle negativo teve a menor contagem de bactérias do gênero Lactobacillus, em um total de 2,7Log₁₀ de UFC mL^-1 em contraste com os demais grupos que apresentaram maior contagem (P<0,05) variando entre 5,5 a 6,7Log₁₀ de UFC mL^-1 para os tratados com óleo de aroeira-vermelha e de 7,5Log₁₀ de UFC mL^-1 para o grupo com promotor de crescimento, que não diferiram significativamente entre si. Esses resultados poderiam ter sido influenciados pela pressão seletiva que o promotor de crescimento e o óleo de aroeira exerceram sobre a microbiota normal, especialmente para os extratos de aroeira que indicaram inibição sobre Gram negativos (MARTINEZ et al., 1996).

Para a identificação das espécies de Lactobacillus spp. foram utilizadas somente as amostras consideradas compatíveis com esse gênero que tiveram resultados positivos no teste de coloração de Gram e na produção de gás em glicose e resultados negativos no teste de catalase e na produção de H2S em TSI. Portanto, após a caracterização fenotípica do gênero Lactobacillus, foram identificadas, em ambas as metodologias, 100 amostras de Lactobacillus spp. sendo 20 amostras por tratamento.

Por meio dos testes bioquímicos identificaram-se quatro diferentes espécies isoladas do íleo que foram classificadas como L. acidophilus, L. fermentum, L. plantarum, L. delbrueckii ssp. delbrueckii além de Lactococcus lactis spp. lactis (Tabela 1). As aves alimentadas sem promotor de crescimento ou com óleo de aroeira-vermelha tiveram maior ocorrência de Lactobacillus do grupo L. acidophilus (Tabela 2), que indica uma diversidade de espécies, sendo importante ressaltar que os tratados com óleo de aroeira também tiveram maior contagem de bactérias do gênero Lactobacillus comparado com o controle negativo (P<0,05). LU et al. (2003) isolaram as espécies L. acidophilus, L. crispatus, L. reuteri, L. delbrueckii, L. salivarius e L. gasseri em frangos de corte alimentados com dieta isenta de promotor de crescimento. Entretanto, de acordo com KNARREBORG et al. (2002) os promotores de crescimento podem selecionar a microbiota do íleo de frangos de corte. No presente estudo, a espécie L. acidophilus foi predominante no grupo tratado com promotor de crescimento que sugere a influencia dos tratamentos sobre a microbiota intestinal.

Para as amostras padrão ATCC, também foi utilizado o API^® 50CHL, que suscitou dúvidas em relação aos resultados, uma vez que houve discordância entre as amostras de referência L. acidophilus ATCC 314 e L. fermentum ATCC 9338 que foram identificadas como L. paracasei spp. paracasei com 99,7 e 98,9% de confiabilidade, respectivamente e a de L. delbrueckii ATCC 7830 que foi identificado como Lactococcus lactis spp. lactis com 94,8% de confiabilidade. Apenas a amostra de L. acidophillus ATCC 4356 foi identificada como L. acidophillus como 80,7% de confiabilidade pelo API^®50CHL.

A utilização do padrão de fermentação de carboidratos como único critério para identificação de bactérias ácido-láticas é insatisfatória, pois ocorrem frequentemente variações nas fermentações e interpretação subjetiva (DE MARTINIS, 2002).

Por outro lado as metodologias moleculares baseadas na PCR (Polimerase Chain Reaction) constituem uma ferramenta de identificação bacteriana principalmente devido à rapidez na obtenção de resposta e elevada sensibilidade e especificidade (SANDHU et al., 1997; GOLDANI & SUGAR, 1998; MOTOYAMA et al., 2000; BIALEK et al., 2000). Nestes procedimentos são amplificados fragmentos de DNA das bactérias utilizando oligonucleótidos específicos, como primers, os quais são separados electroforeticamente em função do tamanho, permitindo identificar as diferentes espécies (MORACE et al., 1997).

Nesta pesquisa, os primers (iniciadores) utilizados para identificação foram espécie-específicos, com base nas sequências do gene 16S e 23S, além da sequência contida no espaço intragênico 16S-23S, descritos por SONG et al. (2000). Os resultados da identificação molecular das amostras de bactérias ácido-láticas isoladas do íleo de frangos de corte (AIA) e das amostras ATCC encontram-se na tabela 2 e ilustrados na figura 1. Os resultados apresentados mostraram que as amostras de Lactobacillus spp. isoladas de aves e as amostras padrão ATCC que amplificaram ambos os iniciadores (LU-1'/ Lac-2) e (Laci-1 / 23-10C) correspondem à L. acidophilus. Contudo, aquelas que amplificaram apenas com o iniciador (LU-1'/ Lac-2) tratam-se das demais espécies que compõe o grupo L. acidophilus. Já as amostras que amplificaram um fragmento de 192pb com o iniciador (Fer 3/Fer 4), correspondem ao padrão para L. fermentum, visualizado na figura 1. Como o método de identificação taxonômica por PCR multiplex foi desenvolvido para amostras intestinais, o conjunto de iniciadores utilizados mostrou-se suficiente para a identificação das espécies de Lactobacillus spp.

As amostras que foram identificadas bioquimicamente pelo API^® 50CHL como L. plantarum, L. delbrueckii subsp. delbrueckii (ATCC) e Lactococcus lactis spp. lactis não apresentaram fragmentos amplificados que denota ausência das sequencias de DNA, alvo ilustrando que a identificação das amostras de Lactobacillus spp. foram espécie-específicos.

A concordância entre a identificação taxonômica realizada pela técnica do PCR multiplex e o perfil bioquímico pelo API foi baixa, num total de 30 amostras, incluindo as espécies de Lactobacillus isoladas do íleo e as estirpes de referência ATCC. Em geral, as bactérias que tinham sido identificadas como Lactococcus lactis subsp lactis pelo teste fermentativo foram caracterizadas pela PCR como Lactobacillus do grupo L. acidophilus, com fragmentos amplificados em 300pb. Pelo método bioquímico, as amostras isoladas de aves identificadas como L. acidophilus e L. fermentum, quando testadas na PCR para identificação, as mesmas apresentaram resultado positivo. As amostras que tinham sido identificadas bioquimicamente pelo API^®50CHL como L. plantarum, L. delbrueckii subsp. delbrueckii e Lactococcus lactis spp. lactis não apresentaram fragmentos amplificados.

CONCLUSÃO

Para as espécies de Lactobacillus spp. isoladas do íleo de frangos de corte, a identificação a partir da PCR multiplex apresentou-se mais sensível que o método bioquímico. Entretanto, a caracterização bioquímica é útil como ferramenta de triagem de bactérias àcido-laticas, As aves tratadas sem promotor de crescimento ou com óleo de aroeira-vermelha tiveram maior ocorrência de Lactobacillus do grupo L. acidophilus. Por outro lado, a espécie L. acidophilus foi isolada predominante no grupo tratado com promotor de crescimento.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro concedido para execução desta pesquisa.

COMITÊ DE ÉTICA E BIOSSEGURANÇA

O protocolo de experimentação animal está de acordo com CONEA e foi aprovado pelo comitê de ética no uso de animais da Universidade Federal do Espírito Santo pelo protocolo n° 01/08.

Recebido para publicação 18.03.11

Aprovado em 13.05.12

Devolvido pelo autor 02.07.12

CR-4967

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1

Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Set 2012
• Data do Fascículo
  Set 2012

Histórico

• Recebido
  18 Mar 2011
• Aceito
  13 Maio 2012