Perspectivas da aplicação das conotoxinas bloqueadoras de canais para cálcio dependentes de voltagem no trauma medular

Perspectives for the application of voltage-dependent calcium channels blockers conotoxin in spinal cord injury

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

CLÍNICA E CIRURGIA

Perspectivas da aplicação das conotoxinas bloqueadoras de canais para cálcio dependentes de voltagem no trauma medular

Perspectives for the application of voltage-dependent calcium channels blockers conotoxin in spinal cord injury

Karen Maciel de Oliveira^I,1; Mário Sérgio Lima Lavor^I; Fabíola Bono Fukushima^II; Fátima Caetano Caldeira^III; Eliane Gonçalves Melo^I

^IDepartamento de Medicina e Cirurgia Veterinárias, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Campus Pampulha, Av. Antônio Carlos, 6627, 30123-970, Belo Horizonte, MG, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIUniversidade Federal do Paraná (UFPR), Palotina, PR, Brasil

^IIIUniversidade Estadual do Oeste do Paraná (UNIOESTE), Guarapuava, PR, Brasil

RESUMO

O bloqueio dos canais para cálcio dependentes de voltagem é uma estratégia importante no tratamento do trauma medular, pois previne o influxo exacerbado do cálcio que participa ativamente em processos neurodegenerativos agudos, resultando em neuroproteção com melhora das funções neurológica. Dentre esses bloqueadores, as toxinas de caramujos marinhos são peptídeos com adequada estabilidade estrutural, estudadas pelas ações específicas em canais iônicos e receptores que interferem diretamente na liberação de neurotransmissores e na neuromodulação dos neurônios motores e sensitivos da medula espinal. Elas já são utilizadas no tratamento de desordens neurológicas e mostram-se promissoras no desenvolvimento de novas terapias para o trauma medular. Portanto, objetivou-se discorrer sobre a fisiopatologia do trauma medular e a possível utilização terapêutica das toxinas de caramujo marinho, atuantes nos principais canais para cálcio dependentes de voltagem.

Palavras-chave: conotoxinas, canais para cálcio, Conus magus, Conus geographus, trauma medular.

ABSTRACT

Blocking voltage dependent calcium channels is an important strategy in acute spinal trauma treatment, because it prevents the exacerbated calcium influx which participates actively in acute neurodegenerative processes, resulting in neuroprotection with improvement of neurological and electrophysiological functions. The cone snail toxins are peptides with adequate structural stability, which have been studied by specific actions on ion channels and receptors that directly interfering in the release of neurotransmitters and neuromodulation of sensory and motor neurons of the spinal cord. They are already used in the treatment of neurological disorders and appear to be promising in the development of new therapies for spinal trauma. Therefore, it was aimed to discuss the pathophysiology of spinal cord trauma, and possible therapeutic use of marine snail toxins that acts in voltage-dependent calcium channels.

Key words: conotoxin, calcium channels, Conus magus, Conus geographus, spinal cord injury.

INTRODUÇÃO

O trauma medular espinal (TME) tem se tornado cada vez mais frequente devido ao aumento da violência urbana, sendo os acidentes automobilísticos, quedas e ferimentos por armas de fogo as causas mais comuns (EDDLESTON et al., 2000; LEE et al., 2013). As lesões medulares, devido a sua gravidade e irreversibilidade, geram transtorno emocional pela baixa qualidade de vida e transtorno socioeconômico pelos custos médicos, programas de reabilitação prolongada ou invalidez (ROSSIGNOL et al., 2007).

Na medicina veterinária, a incidência do trauma medular em cães ainda é desconhecida, mas foi estimado que cerca de 2% dos casos resultam da hérnia de disco, sendo mais frequente em raças como Dachshund (20-25%) (BUBENIK & HOSGOOD, 2008) e, mais comumente localizada na região toracolombar (52%), devido ao estreitamento do canal vertebral nesta região (ZARDO et al., 2010; MENDES & ARIAS, 2012). As principais causas incluem fatores extrínsecos, como atropelamentos (66%), quedas (7%) e brigas (9%) (FIGHERA et al., 2008; MENDES & ARIAS, 2012) e lesões intrínsecas, decorrentes de extrusão e protrusão do disco intervertebral, fraturas patológicas, anormalidades congênitas e instabilidade de vértebras (SEVERO et al., 2007; MENDES & ARIAS, 2012).

Independente da causa do TME os déficits neurológicos, decorrentes da interrupção direta das vias neuronais (SEVERO et al., 2007), comprometem as funções motoras, sensitivas e autonômicas, implicando em perda parcial ou total dos movimentos voluntários e/ou da sensibilidade em membros torácicos e/ou pélvicos (OLBY et al., 2003; BUBENIK & HOSGOOD, 2008; MENDES & ARIAS, 2012). Entre outras complicações, destacam-se também alterações no funcionamento dos sistemas urinário, intestinal, respiratório, circulatório e reprodutivo (ROSSIGNOL et al., 2007; FAILLI et al., 2012). A recuperação neurológica dependerá da gravidade, localização da lesão e tempo decorrido até o início do tratamento (CARLSON & GORDEN, 2002).

Apesar de recentes avanços no estudo da fisiopatologia do TME (CAO & DONG, 2013), ainda não foi estabelecido um tratamento efetivo que detenha a expansão da lesão secundária e diminua as sequelas permanentes (KWON et al., 2004). Clinicamente, há um grande interesse na utilização de novas terapias, como células tronco (DASARI et al., 2007), ou os bloqueadores de canais iônicos (OLIVEIRA, 2012; LAVOR, 2013), capazes de prevenir ou retardar as complicações neurológicas e, com isso, ampliar a janela terapêutica para outros potenciais agentes neuroprotetores. Dentre os diferentes tratamentos propostos, estão os antiinflamatórios esteroidais (BARTHOLDI & SCHWAB, 1995; ROSADO, 2011) e não esteroidais (GUTH et al., 2006), bloqueadores de canais para sódio (SCHWARTZ & FEHLINGS, 2001; WU et al., 2013), bloqueadores de canais para cálcio (BCC) (OLIVEIRA, 2012) e anestésicos gerais (FUKUSHIMA, 2012; LAVOR, 2013). Agentes BCC mostram-se especialmente promissores na redução de lesões cerebrais e medulares, por impedir o influxo exacerbado desse íon e, assim, prevenir a progressão da lesão secundária (VERWEIJ et al., 1997).

Na natureza, há uma extensa variedade de BCC a ser investigada, dentre eles, destacam-se as toxinas de caramujos marinhos do gênero Conus, também denominadas conotoxinas. Sua estabilidade estrutural, facilidade de síntese, elevada especificidade de alvo e pequeno tamanho de seus peptídeos, proporcionam-lhes um importante potencial terapêutico (SHEN et al., 2000; LEWIS & GARCIA, 2003; OLIVERA & TEICHERT, 2007).

Assim, esta revisão objetiva discorrer sobre a fisiopatologia do TME, com ênfase na importância do cálcio (Ca²⁺) no mecanismo de morte neuronal, abordando a possível utilização terapêutica das toxinas de caramujo marinho bloqueadoras de canais para Ca²⁺ dependentes de voltagem (CCDV).

Fisiopatologia do trauma medular

A lesão

A fisiopatologia do TME é caracterizada por um processo contínuo de destruição tecidual, reparação e cicatrização ao redor e no local da lesão. O impacto inicial no momento do trauma acarreta dano mecânico imediato da medula espinal (ME) e tecido adjacente, com ruptura de vasos sanguíneos, corpos neuronais, axônios e células da glia, resultando na interrupção fisiológica e/ou morfológica dos impulsos nervosos e na ativação de uma cascata de eventos destrutivos (SEVERO et al., 2007; OYINBO, 2011; JIA et al., 2013).

As lesões secundárias iniciam-se minutos após o trauma mecânico. A quebra da barreira hematoespinal desencadeia aumento da permeabilidade vascular, com formação de edema, início da resposta inflamatória, perda de cargas aniônicas e extravasamento de proteínas plasmáticas (ROWLAND et al., 2008). Concomitantemente, a ruptura da microvasculatura gera hemorragia que, associada ao edema, leva à isquemia medular, estendendo-se rostral e caudalmente (HULSEBOSCH, 2002; ROWLAND et al., 2008). Além disso, células gliais e endoteliais liberam substâncias vasoativas que se concentram próximo à lesão, contribuindo para a isquemia neuronal (GRILL, 2005). Ressalta-se que astrócitos localizados na periferia da lesão tornam-se reativos, proliferam e hipertrofiam, na tentativa de conter uma resposta inflamatória exacerbada, todavia pode dificultar a neuroplasticidade pela formação dessa cicatriz local (HERMANN et al., 2008).

O papel do cálcio no trauma medular

Paralelamente a esses eventos, ocorrem outros processos que intensificam a lesão neuronal, tendo destaque a excitotoxicidade. Ela causa desequilíbrio eletrolítico significativo (KWON et al., 2004; SEVERO et al., 2007), resultante da liberação excessiva e recaptação inadequada do glutamato (LEPORE et al., 2011), com consequente transmissão sináptica excitatória prolongada (HULSEBOSCH, 2002; ROWLAND et al., 2008). Isso acarreta o influxo acentuado de sódio e Ca²⁺ pela ativação de receptores ionotrópicos e metabotrópicos, além da entrada do Ca²⁺ pelos CCDV, abertos com a despolarização da membrana (BERRIDGE, 2002).

A ativação de CCDV constitui uma das vias mais importantes de entrada de Ca²⁺ e representa um passo chave na regulação dos processos celulares (UCHITEL, 1997) e da excitabilidade celular, que participam ativamente em processos neurodegenerativos agudos (AGRAWAL et al., 2000). Os CCDV são divididos em duas grandes classes fisiológicas, baseadas nas voltagens de ativação (voltagem de baixo limiar – tipo T ou alto limiar – tipo L, N, P/Q e R) e três subfamílias, designadas como tipo Cav.1 (L), Cav. 2 (N, P/Q e R) e a Cav.3 (T), com base na similaridade de suas características farmacológicas. Na ME, foi evidenciada a participação dos CCDV tipo N, P/Q e R na corrente de Ca²⁺ dos motoneurônios (CARLIN et al., 2000).

Com o influxo exagerado de cálcio, a mitocôndria torna-se um alvo importante, pois, na tentativa de interromper os potenciais eventos letais, ela sequestra esse íon (SANTO-DOMINGO E DEMAUREX, 2010). Contudo, o excesso de cálcio mitocondrial contribui para ativar a cascata de apoptose com geração de espécies reativas de oxigênio, edema mitocondrial e liberação de fatores apoptogênicos, como citocromo c, fator indutor de apoptose, entre outros, que ativam caspases executoras, como caspase-3 e caspase-7 (Figura 1) (BERRIDGE, 2002; SULLIVAN et al., 2004; DECUYPERE et al., 2011). A apoptose é um mecanismo essencial durante o desenvolvimento do sistema nervoso central para eliminação de células excessivas. Entretanto, após o TME, tem-se mostrado como fator importante na perda celular, sendo detectada de horas a semanas após a lesão, em diversos tipos celulares, como oligodendrócitos, neurônios, neutrófilos, microglia e macrófagos (LIU et al., 1996; HALL & SPRINGER, 2004).

Gravidade e recuperação neurológica

A lesão inicial, portanto, se expande progressivamente dentro de poucas horas, causando perdas de segmentos funcionais ainda maiores, com características de desmielinização parcial ou total, responsável pelos déficits de condução (GRILL, 2005; SEVERO et al., 2007). Se a substância branca remanescente possuir mais porções intactas dos tratos ascendentes sensitivos e descendentes motores, maiores serão as chances da recuperação funcional (HALL & SPRINGER, 2004). Pesquisas mostraram que BCC são agentes farmacológicos promissores na redução de lesões cerebrais (VERWEIJ et al., 1997; BERMAN et al., 2000; ASLAN et al., 2009) e medulares (OLIVEIRA, 2012; LAVOR, 2013), ao impedir o influxo exacerbado desse íon e, dessa forma, prevenir a progressão da lesão secundária.

Os bloqueadores de canais para cálcio dependentes de voltagem

O bloqueio de CCDV é uma estratégia neuroprotetora importante, por estar envolvido na cascata de eventos deletérios pós-trauma (IMAIZUMI et al., 1999; LAVOR, 2013). No TME, alguns estudos evidenciaram que o bloqueio de CCDV tipo N e L tem papel fundamental em reduzir lesões secundárias, resultando em neuroproteção com melhora das funções neurológica e eletrofisiológica (IMAIZUMI et al., 1999; AGRAWAL et al., 2000). Pesquisas realizadas por nosso grupo corroboram tais resultados. Ao utilizar modelo de isquemia medular espinal in vitro, demonstrou-se que os bloqueadores de CCDV tipo N e P/Q reduziram a morte neuronal e a liberação de glutamato e de lactato desidrogenase (LDH) no corno ventral da medula (LAVOR, 2013). Especula-se, dessa forma, que o bloqueio dos CCDV proteja a integridade estrutural dos oligodendrócitos e astrócitos, devido à presença de canais do tipo N em suas membranas, envolvidos no controle de diversos neurotransmissores e polipeptídeos que medeiam à resposta nociceptiva, propiciando uma melhor preservação na condução axonal após o TME (AGRAWAL et al., 2000).

Nos canais para Ca²⁺, a subunidade α-1 é o principal alvo dos bloqueadores. Os bloqueadores inorgânicos incluem íons divalentes e trivalentes, como níquel e cádmio, utilizados como ferramentas de pesquisas, mas pouco práticos para uso clínico. Os bloqueadores orgânicos como diidropiridina, fenilalquilaminas e benzodiazepinas, bloqueadores dos canais do tipo L, prescritos para doenças cardiovasculares e enxaquecas, participam pouco na liberação de neurotransmissores (DIAZ & DICKENSON, 1997). A subfamília de canais para Ca²⁺, condutores de correntes do tipo N e P/Q, é insensível aos clássicos antagonistas, mas são bloqueados seletivamente por peptídeos de toxinas isolados de aranhas e caramujos marinhos (CAMERINO et al., 2007). Desde a descoberta da interação de toxinas com os CCDV, seu uso nas afecções neurológicas tem sido investigado (OLIVERA et al., 1987).

Toxinas de caramujos marinhos

Pesquisadores, frente às características terapêuticas já observadas, persistem na investigação das conotoxinas à procura de moléculas biologicamente ativas, como peptídeos neuroativos e neuroprotetores, derivados de diferentes espécies venenosas que possam ser aplicados clinicamente (SHEN et al., 2000).

Há quase 30 anos, o primeiro componente ativo do veneno de caramujo marinho do gênero Conus foi caracterizado bioquimicamente, instigado pelo modo como esses animais paralisavam as presas. Eles são predadores de águas tropicais e subtropicais, com aproximadamente 500 espécies, classificadas em três grupos, de acordo com o hábito alimentar: vermívoros, moluscívoros e piscívoros (SHEN et al., 2000). As espécies de caramujos marinhos com alvos já estabelecidos incluem C. magus, C. aulicus, C. regius, C. purpurascens, C. imperialis e C. geographus (OLIVERA & TEICHERT, 2007). O veneno do caramujo marinho do gênero Conus causa acidente grave, com quadros de dor intensa, seguida de parestesia generalizada, além da paralisia neuromuscular e óbito por insuficiência respiratória relatados em humanos (WATTERS & STOMMEL, 2004).

Essas toxinas têm sido estudadas por ter ações específicas em canais iônicos e em receptores para neurotransmissores (KAPOOR, 2010). Para sua obtenção, ela é extraída dos ductos de veneno desses animais e purificada por fracionamento, pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa, baseada em superfície de óxidos inorgânicos (AGUILAR et al., 2009). A toxina purificada é composta por pequenos peptídeos, denominados conopeptídeos, variando o tamanho de oito a 31 aminoácidos, enriquecida com pontos de dissulfeto (SHEN et al., 2000), os quais mostraram resultados promissores em estudos experimentais de desordens neurológicas, como epilepsia (MALMBERG et al., 2003), Parkinson, Alzheimer, isquemia medular (LAVOR, 2013) e já são utilizados em síndromes neuropáticas de dores crônicas (LIVETT et al., 2004; MEHDIRATTA & SABERWAL, 2007).

Atualmente, conhece-se cerca de 10 superfamílias de conotoxinas com alta seletividade para um alvo molecular específico como canais iônicos ou receptores (OLIVERA & CRUZ, 2001). Elas são subdivididas em diversas famílias ou classes. As ômega-conotoxinas (ω -conotoxinas) são específicas para CCDV, inibindo a liberação de neurotransmissores. Outras famílias bloqueiam receptores nicotínicos (alfa- e psi-conotoxina), canais para potássio voltagem dependentes (mu- e delta-conotoxina), receptores de serotonina (sigma-conotoxina) e inibição de canais iônicos inespecificamente (gama-conotoxina) (LIVETT et al., 2004; MEHDIRATTA & SABERWAL, 2007; OLIVERA & TEICHERT, 2007).

No TME, como visto anteriormente, ocorre morte neuronal, devido ao aumento do Ca²⁺ intracelular, que pode ser prevenido com BCC. As ω -conotoxinas, provenientes de C. magus e C. geographus, mostraram-se valiosas na pesquisa para identificação dos subtipos de CCDV envolvidos em determinados processos celulares (HILLYARD et al., 1992; LAVOR, 2013). Com essas descobertas, tornaram-se alvos de terapias direcionadas contra dores crônicas, danos isquêmicos cerebrais e medulares, algumas formas de epilepsia e ataxia. Ao antagonizar CCDV, mostraram também efeito neuroprotetor em modelos de isquemia cerebral em coelhos e ratos (MINAMI et al., 2001; PINHEIRO et al., 2009), isquemia (LAVOR, 2013) e trauma medular em ratos (OLIVEIRA, 2012). Com o bloqueio desses canais, previne-se a liberação excessiva de neurotransmissores, incluindo aminoácidos excitatórios, como glutamato e dopamina (ROBICHAUD et al., 1994), atuando como protetores da hiperexcitabilidade e supressores da atividade epileptiforme (YAMADA et al., 1994) e mostrando potencial neuroprotetor no trauma medular (OLIVEIRA, 2012).

Dentro dessa classe, a MVIIA, proveniente do caramujo marinho Conus magus, conhecida como SNX-111 ou Ziconotide, é potente BCC tipo N e foi aprovada pela Food and Drug Administration como droga terapêutica pelas suas propriedades analgésicas, sendo utilizada para tratamento da dor crônica intensa e neuropática do câncer em humanos (OLIVERA et al., 1994; BOWERSOX & LUTHER, 1998; BINGHAM et al., 2010). Além disso, possui propriedades neuroprotetoras, devido à inibição de neurotransmissores excitatórios secundário à isquemia (VALENTINO et al., 1993; GONÇAVES et al., 2011) e ao trauma cerebral em ratos (HOVDA et al., 1994; BOWERSOX & LUTHER, 1998; BERMAN et al., 2000). Ainda não há relatos da aplicação dessa toxina no trauma medular, projeto em andamento por este grupo de pesquisa.

Nessa mesma família de conotoxinas, a MVIIC, também proveniente do Conus magus, é estudada por ser um bloqueador de amplo espectro para canais para Ca²⁺ do tipo N e P/Q (HILLYARD et al., 1992; LIU et al., 1996; MCDONOUGH et al., 2002). Estudos em isquemia cerebral (LIU et al., 1996; MCDONOUGH et al., 2002; PINHEIRO et al., 2009) e medular (IMAIZUMI et al., 1999; LAVOR, 2013) in vitro demonstraram que a MVIIC reduziu significativamente o influxo do Ca²⁺ através dos CCDV do tipo N e P/Q, diminuindo a liberação do glutamato. Por algum tempo, a MVIIC foi utilizada apenas como ferramenta de pesquisa, alegando-se alta letalidade aos mamíferos (BOWERSOX et al., 1994). Entretanto, baseado nos efeitos promissores dessa toxina no tratamento de diferentes patologias (LIU et al., 1996; IMAIZUMI et al., 1999; PINHEIRO et al., 2009), este grupo de pesquisa, em um trabalho inédito no trauma medular in vivo¸ verificou que a toxina não provocou efeitos colaterais, como também demonstrou maior preservação de corpos neuronais e melhor recuperação da capacidade motora (OLIVEIRA, 2012).

Já a ω-conotoxina GVIA, proveniente do caramujo marinho Conus geographus (OLIVERA et al., 1984), é a mais utilizada como ferramenta na neurociência, por inibir irreversivelmente a transmissão sináptica ao bloquear os canais para Ca²⁺ do tipo N (FELDMAN et al., 1987; OLIVERA et al., 1994). Ela tem sido investigada quanto aos efeitos analgésicos e neuroprotetores na ME (NEBE et al., 1998), inibindo marcadamente a liberação excitotóxica de dopamina, com aplicação tópica sobre a ME, durante isquemia medular (ROBICHAUD et al., 1994).

Devido à importância do fluxo de Ca²⁺ para a homeostasia celular, o bloqueio de seus diferentes canais pode causar efeitos colaterais. A MVIIA, em altas concentrações, gera hipotensão e alterações cardiovasculares no momento da administração, além de tremor generalizado e déficit locomotor reversível, 60 minutos após aplicação intratecal, com retorno à normalidade em 24 horas em ratos (MALMBERG & YAKSH, 1994; SCOTT et al., 2002; SOUZA et al., 2008). Já a MVIIC, em altas doses, superiores a 300pmol, pode causar fraqueza muscular, problemas de coordenação e andar em círculos em poucos minutos após a injeção intracerebroventricular. Doses inferiores a 100pmol da MVIIC são mais seguras e, eventualmente, ocorre paralisia flácida (DALMOLIN et al., 2011) e arqueamento dorsal (HILLYARD et al., 1992). Apesar de a dose ser um fator limitante para o uso das toxinas, são necessárias quantidades picomolares para que se obtenha o efeito de inibição dos CCDV (Souza et al., 2011).

Perspectivas

O trauma medular é uma emergência médica que desencadeia danos irreversíveis ao tecido neuronal, sendo o grande desafio da neurologia em todos os tempos. As estratégias neuroprotetoras, como prevenção de descargas repetitivas nas fibras nervosas pelo bloqueio dos canais para sódio, prevenção da liberação excessiva de neurotransmissores pelo bloqueio dos CCDV, prevenção do influxo massivo de glutamato ou qualquer combinação desses três mecanismos, têm sido propostas. Contudo, ainda não foi estabelecido um tratamento efetivo que detenha a expansão secundária e diminua as sequelas. Nesse contexto, as conotoxinas BCC apresentam um grande potencial no tratamento do trauma medular, uma vez que estudos demonstraram resultados positivos em diversos experimentos in vitro e, isoladamente, in vivo. Frente às propriedades promissoras dessas toxinas, verifica-se a necessidade de mais estudos experimentais que investiguem a aplicação desses peptídeos em modelos in vivo no trauma medular.

Recebido 16.07.12

Aprovado 18.09.13

Devolvido pelo autor 10.12.13

CR-2012-0538.R1

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Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  18 Mar 2014
• Data do Fascículo
  Mar 2014

Histórico

• Aceito
  18 Set 2013
• Recebido
  16 Jul 2012