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Scientia Agricola

Print version ISSN 0103-9016

Sci. agric. vol. 54 n. 1-2 Piracicaba Jan./Aug. 1997

http://dx.doi.org/10.1590/S0103-90161997000100013 

TRATAMENTO DE SEMENTES DE ARROZ, TRIGO, FEIJÃO E SOJA COM UM PRODUTO FORMULADO À BASE DE CÉLULAS E DE METABÓLITOS DE Bacillus subtilis

 

E. LAZZARETTI1; W. BETTIOL2,3
1Doutorando em Microbiologia Aplicada da UNESP/Rio Claro, SP.
2EMBRAPA/CNPMA - CP. 69, CEP: 13820-000 - Jaguariúna, SP.
3Bolsista do CNPq.

 

 

RESUMO: Um produto constituido de pó-molhável (PBBS) formulado à base de células (60g) e de metabólitos (60g) de Bacillus subtilis, argila (480g), espalhante (7,92g) e água (2400ml), moído e seco, mostrou-se semelhante aos tratamentos com fungicidas recomendados para o controle de Rhizoctonia solani, Aspergillus sp. e Sclerotinia sclerotiorum em sementes de feijão; Pyricularia oryzae e Rhinchosporium sativum em sementes de arroz; e Cercospora kikuchii, Phomopsis phaseoli e Fusarium spp. em sementes de soja. Para Dreschlera oryzae em arroz e Bipolaris sorokiniana, P. oryzae e Alternaria tenuis em sementes de trigo, o tratamento com o PBBS, embora não tenha se igualado ao tratamento com o fungicida padrão, diferiu estatisticamente do tratamento testemunha. A nodulação das raízes de feijão e soja por bactérias simbióticas, fixadoras de nitrogênio, não foi influenciada quando o PBBS foi aplicado simultaneamente ao inoculante contendo Rhyzobium sp. e Bradyrhizobium japonicum, respectivamente. O PBBS também não afetou a emergência das plântulas das culturas testadas.
Descritores:
controle biológico, microbiolização de sementes, patologia de sementes, arroz, feijão, soja e trigo

 

TREATMENT OF RICE, BEAN, WHEAT AND SOYBEAN SEEDS WITH A PRODUCT CONSISTING OF CELLS AND METABOLITES OF BACILLUS SUBTILIS

ABSTRACT: A biological fungicide product containing B. subtilis cells (60 g) and metabolites (60g) was transformed into a wettable powder formulated with, clay (480 g), surfactant (7,92 g) and water (2400 ml).The product showed to be similar to the conventional fungicides used in the control of Rhizoctonia solani, Aspergillus sp. and Sclerotinia sclerotiorum in bean seeds. The control of Pyricularia oryzae and Rhinchosporium sativum in rice seeds and Cercospora kikuchii, Phomopsis phaseoli and Fusarium spp. in soybean seeds was also as efficient as the comercial fungicides. For Dreschlera oryzae in rice seeds and Bipolaris sorokiniana, P. oryzae and Alternaria tenuis in wheat seeds, the treatment with the product, althought not as efficient as the chemical treatment, was statistically distinct from the control. The root nodulation of bean and soybean by nitrogen fixing bacteria, was not affected when the product was simultaneously applied with bacteria ( Rhyzobium and Bradyrhizobium japonicum). The product did not affect seedling emergence in any of the tested crops.
Key Words:
biological control, seed microbiolization, seed pathology, rice, bean, soybean, wheat

 

 

INTRODUÇÃO

O emprego de microrganismos para o controle de fitopatógenos pode ser direto, quando esses são utilizados vivos; ou indireto, através da aplicação de seus metabólitos. Em ambos os casos necessita-se obter produtos que mantenham as características dos microrganismos ou de seus metabólitos. Dessa forma, esses produtos precisam ser adequadamente formulados para facilitar a comercialização, o transporte, a aplicação e o armazenamento, sem que ocorram grandes alterações em suas características.

Produtos formulados a partir de Bacillus subtilis vêm sendo utilizados, desde 1983, nos EUA para o tratamento de sementes de amendoim, entre outras culturas, contra vários fitopatógenos (Weller, 1988). A eficácia de B. subtilis no controle de patógenos associados às sementes foi demonstrada por Merriman et al. (1974), Venkatasubbaiah (1985), Reedy & Rahe (1989), Jindal & Thind (1990), Turner & Backman (1991), Lazzaretti (1993) e Luz (1993). Segundo Backman (1995), o isolado GB03 de B. subtilis foi utilizado para inoculação de mais de 2 milhões de hectares de diversas culturas em 1994. O produto é comercializado tanto para proteção das raízes quanto para estimular o desenvolvimento das plantas. Por suas características, esse isolado de B. subtilis coloniza tanto monocotiledôneas como dicotiledôneas. Backman (1995) apresenta estimativa de que em 1995, mais de 80% do algodão plantado nos USA seriam tratados com esse isolado.

A resistência dos metabólitos produzidos por B. subtilis ao calor, os quais permanecem ativos após autoclavagem do meio a 121oC/20 min. (Baker et al., 1983; Bettiol & Kimati, 1990; Lazzaretti, 1993), e a formação de endosporos altamente resistentes ao calor (Buchanan & Gibbons, 1975; Norris et al., 1981) são características excelentes para o desenvolvimento comercial de formulações desta bactéria.

Assim no presente trabalho foi estudado o uso de uma formulação pó-molhável, à base de metabólitos e de células de B. subtilis (PBBS), para o tratamento de sementes de arroz, feijão, soja e trigo, visando a redução dos patógenos associados às sementes. Também foram estudados os efeitos desse tratamento no desenvolvimento e na nodulação das raízes de feijão e de soja, por bactérias fixadoras de nitrogênio; e na emergência das sementes.

 

MATERIAL E MÉTODOS

1. Formulação de B. subtilis (PBBS): Para formular um produto pó-molhável à base de B. subtilis (PBBS), isolado AP-3 (Bettiol & Kimati, 1989), foram misturados 480 g de argila A-50 (Sintermor Mineração Ltda), 60 g de células e 60 g de metabólitos de B. subtilis obtidos através da centrifugação e precipitação ácida com HCl 1N, respectivamente, do meio de cultura onde foi fermentado por 7 dias (Bettiol et al., 1992). A essa mistura foi adicionado 7,92 g de espalhante Surfon 950PM (nonil fenol etoxilado - 9,5 moles absorvido, ULTRAQUÍMICA) e 2400 ml de água. A mistura foi colocada em moinho de esferas (ERWEKA AR400) onde permaneceu por 30 minutos, para reduzir o diâmetro das partículas. Após a moagem, a mistura foi passada por peneira de 0,210 mm, duas vezes. O material peneirado foi seco em "mini Spray-Dryer" (BÜCHI 190)(a temperatura de entrada foi de 101oC ± 1 e a de saída foi de 62 oC, com vazão de 9 ml/minuto); com rendimento de 47%. O produto (PBBS) obtido possuía 2,57 x 108 UFC/g. Após 8 meses de armazenamento em condições ambiente o PBBS manteve a mesma concentração de células. Tanto para a determinação do número de células no produto recém preparado, como com 8 meses de armazenamento, foi utilizada a técnica de diluição em série e plaqueamento em nutriente ágar.

2. Tratamento e patologia de sementes: Obtido o produto (PBBS), procedeu-se ao tratamento das sementes para avaliação da sanidade e da emergência de plântulas de arroz (IAC-4440), feijão (Carioquinha IT-185), soja (BR 4) e trigo (Anahuac). Nas culturas de feijão e de soja também foi avaliado o efeito do produto sobre a nodulação das raízes por bactérias fixadoras de nitrogênio (Rhyzobium sp. e Bradyrhizobium japonicum, respectivamente).

A quantidade de PBBS para o tratamento de sementes foi baseada na dose de ingrediente ativo por 100 kg de sementes de um fungicida utilizado para cada cultura (feijão - 50 g de benomyl; arroz e soja - 225 g de quintozene; e trigo - 50 g de iprodione + 150 g de thiram). Além da dose igual ao produto químico, foram utilizadas metade e o dobro da dosagem. Para as sementes de feijão, além do PBBS, foram utilizados separadamente células e metabólitos de B. subtilis. Como testemunha foram utilizadas sementes sem tratamento. O tratamento consistiu em misturar as sementes com os produtos através de uma molhagem rápida, isto é, com acréscimo de pequenas quantidades de água.

Os testes de sanidade de sementes foram feitos em placas de Petri plásticas, contendo discos de papel de filtro, previamente umedecidos em água destilada. As sementes foram incubadas a 21oC ± 0,5 por 7 dias sob regime luminoso de 12 horas de luz/ 12 horas de escuro. As sementes de feijão e trigo, após 24 horas de incubação, foram transferi-das para "freezer" a -18oC por 24 horas, retornando em seguida às condições iniciais. As sementes de feijão foram incubadas por 15 dias, a 25ºC, para observar o crescimento de Sclerotinia sclerotiorum.

Após a incubação as sementes foram avaliadas com auxílio de um microscópio estereoscópico, examinando-se todas as sementes individualmente, para detectar a presença de fungos fitopatogênicos. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com 4 repetições de 100 sementes cada tratamento. Para análise estatística os dados foram transformados em arc sen da raiz quadrada de x/100+0,5 e as médias comparadas pelo teste Duncan ao nível de 5% de probabilidade.

3. Testes em casa de vegetação e campo: Para observar o efeito do PBBS sobre a emergência das plântulas e sobre a nodulação de raízes de feijoeiro e de soja por Rhyzobium sp. e Bradyrhizobium japonicum, respectivamente, foram realizados teste em casa de vegetação e campo.

Sementes de trigo tratadas com o PBBS (100 g i.a./100kg de sementes) e fungicida (iprodione + thiram 50+150 g/100kg sem.), foram semeadas em caixas plásticas contendo solo (Podzólico vermelho amarelo, fase terraço) peneirado e mantidas em casa de vegetação por 15 dias, quando procedeu-se a avaliação do número de plântulas emergidas.

Sementes de arroz, após tratamento com fungicida (quintozene 225 g/100kg sem.) e com o PBBS (450 g ia/100 kg sementes) foram semeadas em solo Podzólico vermelho amarelo, fase terraço, no campo experimental do CNPMA, e após 15 dias avaliado o número de plântulas emergidas.

As sementes de feijão e de soja foram, previamente inoculadas com bactérias fixadoras de nitrogênio dos gêneros Rhizobium sp. e B. japonicum, respectivamente, (inoculantes fornecidos pela TURFAL Ltda, Curitiba, PR) e, posteriormente tratadas com o PBBS (450 g i.a/100 kg de sementes para soja e 100 g ia/100 kg de sementes para feijão) e com fungicida (benomyl 50 g/100 kg de sementes para feijão e quintozene 225 g/100 kg de sementes para soja). As sementes foram inoculadas conforme recomendação do produtor do inoculante (200 g de inoculante/60 kg de sementes). Após os tratamentos, as sementes foram semeadas no campo experimental do CNPMA/EMBRAPA de Jaguariúna/SP, em solo Podzólico vermelho amarelo. Aos 15 dias da semeadura foi avaliado o número de plântulas emergidas e aos 50 dias as plantas foram cuidadosamente arrancadas e as raízes lavadas em água corrente para proceder a contagem do número de nódulos presentes. Além do número de nódulos, foram avaliados os pesos secos da parte aérea e das raízes. Para comparação, sementes sem tratamento, sementes inoculadas com as bactérias fixadoras de nitrogênio e sementes tratadas somente com o PBBS nas mesmas dosagens, anteriormente citadas, foram utilizadas.

O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado com 4 repetições de 100 sementes para as culturas de feijão, soja e trigo e 4 repetições de 50 sementes para a cultura do arroz.

 

RESULTADOS

A aplicação isolada de células ou de extrato de B. subtilis em sementes de feijão não diferiu estatisticamente dos resultados obtidos no tratamento testemunha sendo por isso eliminado nos ensaios subseqüentes. O PBBS quando aplicado na concentração de 100g i.a./100kg de sementes de feijão comportou-se estatisticamente semelhante ao fungicida benomyl (50g i.a./100kg sementes) no controle de S. sclerotiorum, Aspergillus sp. e Rhizoctonia solani. Para R. solani todos os tratamentos (benomyl-50g; PBBS-50g e 100g; células - 50g e metabólitos de B. subtilis 50g por 100 kg de sementes) foram eficientes em reduzir a sua incidência nas sementes. Dos produtos acima citados apenas o benomyl reduziu a incidência de Fusarium e nenhum apresentou efeito significativo em Alternaria (TABELA 1). Em relação ao Penicillium spp. apenas o benomyl reduziu significativamente a sua presença.

 

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Para as sementes de arroz, com exceção do PBBS aplicado em meia dosagem (110 g i.a./100 kg de sementes) para Dreschlera oryzae e Pyricularia oryzae, todos os tratamentos (quintozene 225g ia.; PBBS 225 e 450 g ia. por 100 kg de sementes) reduziram significativamente as populações de D. oryza, P. oryzae e Rhinchosporium sativum das sementes, quando comparado com a testemunha. Em relação à incidência de P. oryzae e R. sativum, o PBBS (225 e 450g ia.) apresentou comportamento estatisticamente semelhante ao fungicida quintozene (225g/100 kg de sementes) (TABELA 2).

 

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Para sementes de soja, o PBBS (110, 225 e 450 g ia./100 kg de sementes) mostrou-se estatisticamente semelhante ao fungicida quintozene (225g/100 kg de sementes) no controle de Cercospora kikuchii, Phomopsis phaseoli e Fusarium spp. (TABELA 2).

O tratamento das sementes de trigo com o PBBS (25, 50 e 100 g/100 kg de sementes) foi estatisticamente inferior ao tratamento com iprodione + thiram em relação ao controle de B. sorokiniana, P. oryzae e A. tenuis. Entretanto, ocorreu acentuada redução na incidência desses três patógenos, quando o PBBS foi comparado ao tratamento testemunha. Foi observado ainda que o PBBS, nas concentrações de 50 e 100 g ia/100kg de sementes, diferiu estatisticamente da testemunha quanto à incidência de B. sorokiniana, P. oryzae e A. tenuis (TABELA 3).

 

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Quanto ao efeito sobre a emergência das plântulas, foi verificado que o PBBS não afetou a qualidade fisiológica das sementes, mesmo quando utilizado em grandes quantidades (Figura 1). Para feijão, soja e trigo, a porcentagem de emergência não diferiu estatisticamente das testemunhas, quando realizado tratamento de sementes com o PBBS e fungicidas. Para arroz, verificou-se que o tratamento com quintozene foi superior à testemunha, mas não diferiu do PBBS (Figura 1).

 

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Figura 1 - Efeito do produto à base de células e de metabólitos de Bacillus subtilis sobre a emergência de plântulas de arroz, trigo, feijão e soja avaliada aos 15 dias da semeadura. PBBS - produto à base de B. subtilis (10% de células e 10% de metabólitos, do isolado AP3), sendo 450 g ia/100 kg de sementes de arroz e soja; e 100 kg ia/100 kg de sementes de trigo e feijão. BFN - bactérias fixadoras de nitrogênio (Bradyrhizobium japonicum e Rhizobium sp. para soja e feijão, respectivamente). Fungicida - 50 g de iprodione + 150 g de thiram/100 kg de sementes de trigo; 225 g de quiantozene/100 kg de sementes de soja e de arroz,; 50 g de benomyl/100 kg de sementes. de feijão. Os tratamentos dentro das culturas de soja, feijão e trigo não diferem entre si (Duncan 5%). Para a cultura de arroz, os tratamentos contendo as mesmas letras sobre as barras não diferem entre si (Duncan 5%).

 

Quanto ao efeito do PBBS sobre a nodulação, pesos secos da parte aérea e das raízes de soja e de feijão, não foram observadas diferenças estatísticas entre os tratamentos, com exceção do tratamento com fungicida quintozene para a soja que diferiu da testemunha quando avaliado o número de nódulos e a relação número de nódulos por grama de raiz (TABELAS 4 e 5).

 

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1 Média de 4 repetições com 100 sementes.
2 Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si (Duncan 5%).
3 PBBS - produto à base de B. subtilis (10% de células e 10% de metabólitos, do isolado AP3).

 

DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

O número de unidades formadoras de colônia obtido no PBBS (2,57x108) foi próximo ao número de esporos do produto Quantum-4000 a base de B. subtilis comercializado nos E.U.A que foi determinado por Turner & Backman (1991) em 1,13x108. Este resultado indica que o PBBS está dentro de um padrão aceitável. A quantidade de ufc, 8 meses após o armazenamento à temperatura ambiente, demonstrou que o PBBS mantém a viabilidade das células por longos períodos o que é desejável em formulações comerciais.

No tratamento de sementes, os melhores resultados foram obtidos quando o PBBS foi aplicado nas maiores concentrações como observa-se, principalmente, para as sementes de arroz e soja, onde os tratamentos na maior dosagem foram estatisticamente semelhantes ao tratamento fungicida. Este efeito também foi observado por Lazzaretti (1993) em tratamentos de sementes de trigo, o qual observou que o aumento na concentração de bactéria no meio ao qual as sementes foram mergulhadas, resultava em um maior controle de patógenos.

A alta sensibilidade de R. solani frente a B. subtilis pode ser observada nos resultados obtidos em sementes de feijão. Mesmo na menor dosagem do PBBS o patógeno mostrou-se sensível, estando de acordo com relatos de Dunleavy (1955), Liu & Sinclair (1987), Turner & Backman (1991) e Lazzaretti et al. (1992).

Os resultados obtidos mostraram que o produto não afetou negativamente a emergência das plântulas das culturas testadas, como relatado por Scortichini et al. (1989) para soja, mas também não estimulou a emergência de plântulas como observado por Merriman et al. (1974) e Zaspel (1992) para sementes de trigo e Turner & Backman (1991) para sementes de amendoim. Os dados mostraram que apenas para arroz os tratamentos com fungicida e PBBS foram melhores que a testemunha (Figura 1).

O efeito benéfico de B. subtilis sobre a nodulação de leguminosas observado por Li & Alexander (1988), Gaind & Gaur (1991), Turner & Backman (1991) e Rossal & McKnight (1991) não foi verificado no presente trabalho, embora o experimento tenha mostrado que o produto não prejudica a associação. Entretanto, como o PBBS, para o controle dos patógenos associados às sementes de soja, foi estatisticamente semelhante ao fungicida quintozene e não reduziu a nodulação, seu potencial para o tratamento dessas sementes pode ser considerado e deve ser avaliado sob diversas condições. Associado a esses fatos, o B. subtilis, apesar de não ter sido verificado nesse trabalho, mas largamente demonstrado pela literatura (Backman, 1995; Luz, 1996), também estimula o desenvolvimento das plantas. Fato esse importante para um agente microbiano de controle de patógenos.

Outro aspecto a ser considerado no tratamento de sementes é a introdução do antagonista na área, podendo existir um efeito a longo prazo com o aumento de sua concentração, na direção de tornar o solo supressivo a diversos patógenos. Para soja, tem sido demonstrado o efeito de B. subtilis sobre o nematóide do cisto, causado por Heterodera glycines (Araujo & Silva, 1996), podendo a introdução via sementes colaborar no seu controle.

 

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Recebido para publicação em 07.11.96
Aceito para publicação em 25.04.97