ATIVIDADE DE PEROXIDASES (EC 1.11.1.7) E TEOR DE PROLINA EM FEIJOEIRO Phaseolus vulgaris L. CULTIVADO EM CONDIÇÕES DE SALINIDADE

ATIVIDADE DE PEROXIDASES (EC 1.11.1.7) E TEOR DE PROLINA EM FEIJOEIRO Phaseolus vulgaris L. CULTIVADO EM CONDIÇÕES DE SALINIDADE¹

C. ROSSI²; G.P.P. LIMA²; D.M.R. HAKVOORT^2,3

²Depto. de Química-IB/UNESP, CEP: 18618-000 - Botucatu, SP.

³Bolsista do CNPq.

RESUMO: Alterações nos níveis de prolina e na atividade da peroxidase foram estudadas em folhas e raízes de feijoeiro em função da resposta à salinidade do meio. A atividade da peroxidase (E.C. 1.11.1.7) e o teor de prolina das folhas foi maior do que nas raízes. Os resultados mostraram que a atividade da peroxidase diminuiu, enquanto os teores de prolina aumentaram gradualmente nas plantas cultivadas em meio salino. Ocorreu diminuição do teor de potássio e aumento de sódio nos órgãos analisados, com o aumento da concentração salina.

Descritores: feijoeiro, peroxidases, prolina, salinidade

PEROXIDASE ACTIVITY (EC 1.11.1.7) AND PROLINE LEVELS IN BEAN (Phaseolus vulgaris L.) GROWN IN SALINE CONDITIONS

ABSTRACT: Changes in proline level and peroxidase activity in bean (Phaseolus vulgaris L. cv. carioca) leaves and roots were studied in response to salinity conditions. Peroxidase activity of (EC 1.11.1.7) and proline concentration in bean leaves were higher than in roots. The results showed that peroxidase activity decreased while proline levels increased in bean grown in saline conditions. Increasing salinity levels in the nutrient solution were followed by a significant accumulation of sodium in the roots, with a concomitant decline of potassium.

Key Words: index: bean, peroxidases, proline, salinity

INTRODUÇÃO

O grupo das peroxidases (POD) inclui enzimas (EC 1.11.1.7) capazes de catalisar a transferência do hidrogênio de um doador para o H₂0₂. Em plantas, a ação desse grupo de enzimas constitui uma proteção antioxidativa. A atividade da peroxidase pode aumentar em plantas submetidas a diversos tipos de estresse (Siegel, 1993). Em variedades de arroz tolerantes a condições de salinidade, Mittal & Dubey (1991) verificaram decréscimos na atividade da enzima presente no endosperma e aumentos em variedades sensíveis.

Aspectos fisiológicos e metabólicos apresentados pelas plantas cultivadas em condições de salinidade tem sido fartamente documentados. Os mais conhecidos, estariam relacionados com a desestabilização das membranas e com os níveis de proteínas (Sahu & Mishra, 1987; Lüttge, 1993). A salinidade devida a altos níveis de Na⁺ ou Cl^- pode provocar a inibição da absorção dos íons K⁺ e Ca⁺⁺ pelas raízes, provocando sintomas de deficiências, como a redução no crescimento, afetando também o teor de aminas, bem como o de proteínas (Cramer et al., 1991). Segundo Melander & Horvath (1977), a diminuição dos níveis de proteínas, poderia ser resultado da hidrólise proteica ou da diminuição da síntese, ou ainda, de ambos os processos. Tem sido discutido na literatura, que ocorre um acúmulo de prolina devido à hidrólise de proteínas, em situações de estresse salino (Torello & Rice, 1986; Huber et al., 1977). Plantas de feijão, mantidas em meio com NaCl apresentaram aumento de prolina, (Huber et al., 1977; Broetto et al., 1995). Enzimas, tais como: peroxidases, fenilalanina amônia liase, fosfatase ácida e desidrogenase glutâmica, teriam também sua atividade alterada em plantas tratadas com NaCl (Levitt, 1980; gaspar et al., 1982).

Assim, sabendo-se que a salinidade pode alterar o metabolismo proteico de plantas, o objetivo do presente trabalho foi o de estudar os efeitos da salinidade sobre a atividade da peroxidase e nos níveis de prolina em plântulas de feijoeiro.

MATERIAL E MÉTODOS

Germinação e coleta de amostras: Sementes selecionadas de feijoeiro Phaseolus vulgaris L. cv. carioca, previamente tratadas com hipoclorito de sódio comercial a 1% durante 3 minutos e lavadas em seguida com água destilada, foram germinadas em areia lavada (sílica moída), recebendo diariamente solução nutritiva de Hoagland & Arnon (1950) a 10%. Plântulas com dez dias de idade foram transferidas para recipientes contendo solução nutritiva completa Hoagland & Arnon, (1950), com os tratamentos de NaCl (15, 50 e 100 mM). O experimento foi conduzido em casa-de-vegetação, com as plântulas recebendo aeração constante. Após quarenta e oito horas, amostras de folhas e raízes foram colhidas, lavadas, congeladas em nitrogênio líquido e acondicionadas em freezer, até o momento de serem submetidas às análises, as quais foram feitas em triplicata.

Determinação do teor de prolina: Foi utilizado o método descrito por Torello & Rice (1986), com pequenas modificações. Amostras com 0,5 g de material fresco foram primeiramente homogenizadas manualmente, em gral de porcelana, com 10 ml de ácido sulfosalicílico a 3% e, em seguida, submetidas à centrifugação a 5000 rpm durante 20 minutos. Reação: em tubo de ensaio contendo 2 ml do sobrenadante, foi adicionado 2 ml de ninhidrina ácida (Bates et al., 1973) e 2 ml de ácido acético glacial. Em seguidas as amostras foram mantidas 1 hora em banho-maria fervente. Após o resfriamento, por imersão em banho de gelo, a intensidade da cor foi medida a 520 nm. As absorbâncias obtidas foram comparadas com a curva-padrão de prolina e, os resultados obtidos expressos em microgramas de prolina por g de material fresco.

Atividade de peroxidase: Extração da enzima: 0,5 g de tecido vegetal (folhas e raízes) foi triturado, em gral de porcelana contendo 5 ml de tampão-fosfato pH 6,7, 0,2 M, sendo o homogenado resultante, centrifugado 10 minutos a 10.000 rpm. O sobrenadante obtido foi utilizado como fonte de enzima. Todas essas operações foram realizadas entre 0-4ºC. Sistema de reação: Foi utilizado o método descrito por Pütter (1965) com pequenas modificações: 100 micromoles de tampão-fosfato pH 6,7 foram adicionados a 10 micromoles de H₂O₂, 35 micromoles de fenol, 2 micromoles de 4-aminoantipirina e 1 ml de sobrenadante contendo a enzima, com um volume final de 2 ml. Após a permanência durante 5 minutos em banho-maria a 30ºC, a reação foi interrompida com 2 ml de etanol absoluto e, a absorbância medida a 505 nm. A velocidade da reação foi expressa em unidades (U). Uma U corresponde a 1 micromol de H₂O₂ consumido por minuto x mg de proteína. O teor de proteína solúvel foi determinado através do método de Bradford (1976).

Sódio e potássio: Amostras previamente secas e finamente trituradas, foram digeridas em balões de Kjeldahl com 6 ml de mistura digestora constituída da mistura HNO₃ e HClO₄ (3:1, v/v). Após a diluição das amostras com água destilada, os níveis de sódio e potássio foram determinados por espectrofotometria de absorção atômica.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados apresentados na Figura 1 demonstram que nas folhas de feijoeiro cultivado em solução contendo NaCl, ocorreu um aumento nos níveis de prolina, o qual pode ser acrescido de até duas vezes (solução contendo NaCl 100 mM). Plantas de feijão (Phaseolus vulgaris) apresentam um limite de tolerância à salinidade para um bom crescimento e desenvolvimento, entre 6 a 12 mg/L de NaCl (Levitt, 1980). Nas raízes esse fato também foi constatado, apesar de verificar-se uma tendência menor de aumento dos níveis desse aminoácido, com o aumento da concentração salina. Esses resultados estão de acordo com os obtidos por diversos autores (Torello & Rice, 1986; Huber et al., 1977), os quais afirmaram que o aumento da prolina em situação de estresse teria efeito osmoregulador. Flowers et al. (1977) verificaram que plantas halófilas ou glicófitas adaptam-se a altas concentrações salinas pela redução do potencial osmótico de suas células e tecidos, com o aumento da absorção de solutos, tais como Na e/ou Cl. De acordo com Levitt, 1980, em espécies menos tolerantes o crescimento pode ser inibido devido ao efeito tóxico provocado pelo acúmulo de solutos. Vários autores (Torello & Rice, 1986; Huber et al., 1977) argumentaram que o acúmulo de prolina ocorre em função do aumento da hidrólise de proteínas em situações de estresse salino ou como resultado da conversão de açúcares na via do glutamato. Em nossa pesquisa, verificou-se acúmulo de prolina em função do aumento de salinidade e estes resultados demonstram que estas plantas podem estar mais adaptadas ao estresse provocado por NaCl.

Figura 1
- Teor de prolina em folhas e raízes de feijoeiro Phaseolus vulgaris L., expresso em microgramas por g de material fresco.

Quanto aos resultados da atividade de peroxidase, apresentados na Figura 2, tanto em folhas como em raízes, foi observada uma redução sensível na atividade da enzima, como foi verificado também por Mittal & Dubey (1991), em variedades tolerantes de arroz. Siegel et al. (1982) observaram uma redução na atividade da peroxidase em Brassica cultivada em solução salina. Em folhas, a atividade enzimática ficou reduzida a 40% e em raízes a 33%, quando comparadas com a atividade da enzima, em plantas cultivadas em solução nutritiva completa sem NaCl.

Figura 2
- Atividade de peroxidases em folhas e raízes de feijoeiro Phaseolus vulgaris L., expressa em micromoles de H₂O₂ consumido por minuto x mg de proteína.

As necessidades de Na para os vegetais apresentarem metabolismo normal são mínimas, sendo que os sintomas de toxidez são rapidamente desenvolvidos quando se eleva a disponibilidade de Na. Danos severos podem ser causados com 0,1% de NaCl em plantas como tomates, ervilhas e feijões (Castillo, 1992).

Os resultados apresentados na Figura 3 mostram, que o sódio acumulou-se mais no sistema radicular e menos nas folhas. Pode-se notar, que nas partes analisadas (raiz, caule e folha), houve aumento do teor de Na em resposta ao aumento da concentração de NaCl, como também foi observado por Cramer et al. (1991), em cevada e, pode ser devido também à adaptação necessária das células ao ajuste osmótico (Watad et al., 1991).

Figura 3
- Teor de sódio em folhas, caule e raizes de feijoeiro Phaseolus vulgaris L., expresso em % na matéria seca.

Em relação à porcentagem de K⁺ (Figura 4), verificou-se que houve diminuição do teor com o aumento da concentração de NaCl, em todos os órgãos analisados. A absorção de Na⁺ provocou uma redução sensível nos níveis de K⁺, principalmente nas raízes. Altas concentrações de Na⁺ podem inibir a absorção de K⁺ e Ca⁺⁺, interferindo no crescimento (Cramer et al., 1991) pois, poderia estar ocorrendo competição pelos sítios de absorção a nível de membrana (Epstein et al., 1963).

Figura 4
- Teor de potássio em folhas, caule e raízes de feijoeiro Phaseolus vulgaris L., expresso em % no material seco.

Em gramíneas Torello & Rice (1986) observaram que ocorre antagonismo na absorção entre Na⁺ e K⁺, tanto para os cultivares denominados tolerantes quanto para os sensíveis. Nimbalkar & Joshi (1975) relataram que em concentrações baixas de Na⁺ ocorre aumento da absorção de K⁺, a qual diminui em altos níveis de Na⁺. Segundo Epstein et al. (1963) ocorre competição pelos sítios de absorção a nível de membrana para ambos os cátions.

Como a absorção do Ca⁺⁺ também está sendo prejudicada devido à salinidade e, o cálcio faz parte da estrutura da peroxidase, agindo na estabilização molecular (Huystee et al., 1992), a atividade poderia estar sendo diminuída (Figura 2), devido ao efeito inibidor do Na⁺ em relação ao Ca⁺⁺.

CONCLUSÕES

Ocorreram alterações no metabolismo de aminoácidos e na atividade da peroxidase com o aumento da concentração de Na⁺, além do antagonis-mo observado em relação à absorção de potássio.

AGRADECIMENTO

Os autores agradecem à secretária do Departamento de Química Srª Claudete Ezias Grassi, pelos serviços prestados na execução deste trabalho.

Recebido para publicação em 22.10.96

Aceito para publicação em 25.04.97

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¹

Trabalho realizado com auxílio do CNPq

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Fev 1999
• Data do Fascículo
  Set 1997

Histórico

• Recebido
  22 Out 1996
• Aceito
  25 Abr 1997