EFEITO DA TREALOSE NA MANUTENÇÃO DA VIABILIDADE DE CÉLULAS DE LEVEDURAS DESIDRATADAS POR LIOFILIZAÇÃO

EFEITO DA TREALOSE NA MANUTENÇÃO DA VIABILIDADE DE CÉLULAS DE LEVEDURAS DESIDRATADAS POR LIOFILIZAÇÃO¹

A.R. ALCARDE; L.C. BASSO

Depto. de Química-ESALQ/USP, C.P. 9, CEP: 13418-900 - Piracicaba, SP.

RESUMO: O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência da trealose endógena e também o uso da trealose como crioprotetor, na preservação da viabilidade celular de leveduras de interesse industrial quando submetidas ao processo de liofilização. Foram utilizadas as cepas TA (M-300-A) e SA (cepa isolada da Usina Santa Adélia S/A) da levedura Saccharomyces cerevisiae e a cepa IZ-1904 da levedura Saccharomyces boulardii, as quais passaram por um tratamento de acúmulo da trealose endógena, através de tratamento térmico a 45^oC por duas horas em meio tampão citrato de potássio 2M, pH 4,0, acrescido de 2% de glicose, e, a seguir, foram suspensas em cada uma de três soluções crioprotetoras, que foram: leite desnatado a 10%, sacarose a 10% e trealose a 10%. Em seguida as massas de levedura foram liofilizadas e, aos 0, 10, 40 e 90 dias após o processo de liofilização, foram determinadas suas viabilidades. Para todos os crioprotetores, as culturas de levedura que passaram pelo tratamento de acúmulo da trealose endógena apresentaram maior viabilidade após a liofilização do que aquelas que não passaram pelo tratamento. Dentre os crioprotetores testados, a solução de leite desnatado a 10% foi o que proporcionou melhor crioproteção às células de levedura.

Descritores: trealose, viabilidade, Saccharomyces, liofilização

EFFECT OF TREHALOSE ON THE MAINTENANCE OF THE VIABILITY OF YEAST CELLS DEHYDRATED BY FREEZE-DRYING

ABSTRACT: To evaluate the influence of the endogenous trehalose and also the use of trehalose as a cryoprotectant medium on the maintenance of yeast cell viability, after the freeze-drying process, strains TA (M-300-A) and SA (strain isolated from Usina Santa Adélia S/A) of the yeast Saccharomyces cerevisiae and the strain IZ-1904 of the yeast Saccharomyces boulardii were tested. After accumulation of endogenous trehalose by heat treatment at 45^oC during 2 hours in a potassium citrate buffer (2M pH 4,0 with 2.0% glucose) the yeasts were suspended in one of three cryoprotectant solutions (skimmed milk 10%, sucrose 10% and trehalose 10%), freeze-dried and analysed for their cell viability after 0, 10, 40 and 90 days of storage. Higher viability maintenance after the freeze-drying process occured for all yeasts at the higher endogenous trehalose levels. The solution of skimmed milk 10% was the best cryoprotectant medium for the yeast cells.

Key Words: trehalose, viability, Saccharomyces, freeze-drying process

INTRODUÇÃO

A preocupação com a manutenção de culturas viáveis iniciou-se simultaneamente à descoberta dos meios artificiais de cultivo, pois a disponibilidade de microrganismos sempre foi considerada essencial ao desenvolvimento da Microbiologia.

Os métodos de preservação têm como objetivo manter a viabilidade e a estabilidade dos organismos. Para obter esta situação, por longo tempo, é necessário a paralisação ou o retardamento do metabolismo celular. Para tal, inúmeros processos são utilizados e constituem-se nos métodos de conservação, que são o subcultivo ou repiques sucessivos, a secagem ou desidratação, o congelamento e a liofilização.

O trealose é um dissacarídeo não redutor constituído de duas unidades de glicose. Originalmente, a trealose, juntamente com o glicogênio, eram considerados substâncias de reserva energética para a levedura, porém, recentemente, vários autores sugerem que a trealose possua função de proteção para a célula de levedura durante processos de estresse, tais como altas temperaturas, choque osmótico, efeitos tóxicos do etanol e desidratação, ficando o glicogênio como o principal carboidrato de reserva em leveduras.

Suomalainen & Pfaffli (1961) atribuem à trealose a função de manter a viabilidade celular durante o período de armazenamento de leveduras de panificação e Lillie & Pringle (1980) associaram a sobrevivência de células de levedura, por períodos prolongados de tempo, principalmente ao nível de trealose.

Há modelos que explicam o efeito de proteção da trealose na membrana da célula de levedura durante os processos de desidratação-hidratação e congelamento-descongelamento. O modelo mais aceito é o proposto por Crowe et al. (1984), pelo qual a trealose interage com os grupos polares das cadeias fosfolipídicas existentes na membrana. A trealose substituiria a água que está ligada às cabeças polares dos fosfolipídios quando em condições favoráveis e seria perdida no processo de estresse. Com a ligação da trealose à membrana não há alteração do espaçamento entre os fosfolipídios, evitando assim as separações laterais dos componentes da membrana. Com a substituição das moléculas de água pela trealose não há passagem da fase fluida para a fase gel da membrana, mantendo-se a integridade e a fluidez da membrana, e assim, a viabilidade celular.

A liofilização, que é considerada um dos mais efetivos métodos de preservação para a maioria dos microrganismos, consiste na remoção do vapor de água diretamente de amostras congeladas e continuada secagem sob vácuo, até produção de material estável.

Embora a liofilização como método de preservação de leveduras promova alta taxa de morte, a viabilidade celular remanescente permanece estável durante o período de estocagem (Silva et al., 1992; Costa & Ferreira, 1991).

Muitos agentes crioprotetores são indicados com sucesso para a liofilização, como glicerol a 10%, leite desnatado a 10%, inositol a 10%, sacarose a 10 ou 12%, rafinose a 5 ou 10% e trealose a 10%. Podlech et al. (1996), avaliando diferentes crioprotetores na conservação de Saccharomyces boulardii por liofilização, concluíram que a combinação das soluções de leite desnatado 10% e trealose 10% foi a que proporcionou melhor crioproteção às células da levedura.

Grba et al. (1975) citam que, em leveduras de panificação, a síntese de trealose é favorecida por condições aeróbias quando comparadas às condições anaeróbias. Porém, Gutierrez (1990) conseguiu o acúmulo de trealose pelas leveduras em anaerobiose durante fermentação alcoólica, conseguindo resultados consistentes de acúmulo de trealose, o qual atingiu até 14,97% (expresso em gramas de glicose por 100g de matéria seca), com a metodologia utilizada.

A trealose só se acumula e atinge concentração elevada dentro da célula quando a glicose do meio estiver quase esgotada. Lille & Pringle (1980) citam que, para que um composto seja considerado de reserva, ele deve ser acumulado quando as fontes externas de nutrientes são abundantes, para ser utilizado em períodos desfavoráveis. A trealose apresenta um comportamento diferente, ou seja, é acumulada durante a fase lag da diauxia, quando o meio está quase exaurido em glicose.

O acúmulo de trealose está associado a períodos de reduzida taxa de crescimento. Assim, segundo Lillie & Pringle (1980), aumentando-se a disponibilidade de nitrogênio no meio fermentativo ocorreu menor acúmulo de trealose. Com a maior disponibilidade de nitrogênio, as leveduras desviam glicose para a síntese de aminoácidos e proteínas reduzindo o acúmulo de trealose.

O acúmulo de trealose ocorre com estímulo de um agente estressante, dependendo do tempo de exposição. Diversos autores têm demonstrado que um tratamento térmico (mudança da temperatura do meio de 23-30 para 36-45^oC) estimula o acúmulo de trealose endógena em leveduras. Segundo Hottinger et al. (1992) as células de levedura acumulam rapidamente trealose quando mudadas de 27 para 40^oC. Os autores constataram ainda que o aumento da temperatura proporciona um aumento de seis vezes na atividade da enzima responsável pela biossíntese da trealose, a trealose-6-fosfato-sintetase.

Segundo Grba et al. (1975), para se obter uma cultura de levedura desidratada ativa, deve-se incubar previamente a cultura sob uma temperatura tal que se obtenha um acúmulo de trealose, o que confere às células uma alta resistência à desidratação. Leslie et al. (1994) também citam que existe uma clara correlação entre a quantidade de trealose presente em células de Saccharomyces cerevisiae e sua habilidade em tolerar a desidratação.

Hino et al. (1990) associaram o teor de trealose endógena à resistência de leveduras ao congelamento, uma vez que as cepas de Saccharomyces cerevisiae mais tolerantes ao congelamento, mostrando alta taxa de sobrevivência, mostraram também maior habilidade em acumular trealose quando comparadas às cepas mais sensíveis.

Eleutherio et al. (1993), trabalhando com células de Saccharomyces cerevisiae, encontraram que a trealose deve estar presente nos dois lados da camada de lipídios da membrana celular para oferecer proteção contra o estresse. Para a presença da trealose nos dois lados da membrana há necessidade de um carregador, uma vez que este carboidrato é produzido no citosol da célula. Segundo Crowe et al. (1991) Saccharomyces cerevisiae possui um carregador para a trealose.

O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência da trealose endógena, e também o uso da trealose como crioprotetor, na preservação da viabilidade celular de leveduras de interesse industrial quando submetidas ao processo de liofilização, contribuindo com informações que poderão auxiliar numa melhor preservação de células de leveduras.

MATERIAL E MÉTODOS

Optou-se por fazer o acúmulo da trealose endógena pelas leveduras em anaerobiose, devido aos bons resultados obtidos por Gutierrez (1990), pelo fato dos ensaios laboratoriais serem mais facilmente executados em anaerobiose e pelo interesse em simular uma condição de fermentação alcoólica industrial.

O meio de fermentação utilizado para estimular o acúmulo da trealose endógena pelas leveduras foi constituído por uma solução tampão de citrato de potássio, pH 4,0, acrescida de 2,0% de glicose, esterilizado em autoclave a 1,0 atmosfera de pressão, a 121^oC durante 20 minutos.

As cepas TA (M-300-A) e SA (cepa isolada da Usina Santa Adélia S/A) da levedura Saccharomyces cerevisiae e a cepa IZ-1904 da levedura Saccharomyces boulardii encontravam-se em estado liofilizado e foram reativadas em tubos de ensaio contendo 5,0 ml de meio de cultivo líquido YEPD (1,0% de extrato de levedura, 1,0% de peptona e 2,0% de dextrose) e incubadas a 26^oC±1^oC por 48 horas.

Para se obter maior massa de levedura, 0,25ml da suspensão da levedura reativada foi espalhado em placas de Petri contendo o meio de cultivo sólido YEPD (1,0% de extrato de levedura, 1,0% de peptona, 2,0% de dextrose e 1,5% de ágar). Depois das placas serem incubadas a 26^oC±1^oC por 48 horas, a massa de levedura foi raspada das placas e suspensa em solução salina (0,9% de NaCl).

Para estimular o acúmulo da trealose endógena, foi preparada, em triplicata, uma suspensão 10% de massa úmida (p/v) de cada levedura reativada em relação ao meio de fermentação, o qual, em seguida, foi submetido a um tratamento térmico a 45^oC por 2 horas (Attfield, 1987 e Gutierrez, 1990). Após o tratamento térmico foram coletadas amostras para se determinar a viabilidade celular (Amorim et al., 1989) e para se determinar o teor de trealose endógena (Trevelyan & Harrison, 1956). Em seguida, a massa de levedura a ser liofilizada, após separada por centrifugação a 800G por 10 minutos, foi ressuspensa em uma solução crioprotetora contendo 10% de trealose, comparando-a com outras duas soluções crioprotetoras: sacarose a 10% e leite desnatado a 10%. A seguir, a massa de levedura foi liofilizada, seguindo procedimentos descritos por Kirsop (1984) e Chang & Elander (1986), a uma temperatura de 40^oC negativos, com um vácuo abaixo de 100 mm de mercúrio, por 6 horas. O aparelho utilizado foi o VIRTIS (Division of Center Medical Health Supply Corp.), o qual proporciona uma taxa de resfriamento de 3^oC por minuto. O vácuo das ampolas foi testado com o aparelho de alta frequência Edwards High Vacuum ST 200K MK II, sendo as ampolas com vazamento descartadas. A viabilidade celular foi também determinada aos 10, 40 e 90 dias após o processo de liofilização.

A levedura reativada sem passar pelo tratamento de acúmulo da trealose endógena foi considerada como levedura esgotada em trealose, devido à mesma apresentar um baixo teor relativo de trealose endógena (TABELA 1).

Para a análise da manutenção da viabilidade celular das leveduras após liofilização foi utilizado o delineamento experimental inteiramente casualizado. Para a análise estatística dos dados foi utilizada a técnica dos Contrastes Ortogonais dentro do procedimento Modelos Lineares Generalizados, através do software SAS 6.8.

Para efeito de padronização das Figuras, será considerado como T1 o tratamento de esgotamento da trealose endógena das leveduras, tendo a solução de leite desnatado a 10% como crioprotetor para a liofilização; T2 o tratamento de esgotamento da trealose endógena das leveduras, tendo a solução de sacarose a 10% como crioprotetor para a liofilização; T3 o tratamento de esgotamento da trealose endógena das leveduras, tendo a solução de trealose a 10% como crioprotetor para a liofilização; T4 o tratamento de acúmulo da trealose endógena das leveduras, tendo a solução de leite desnatado a 10% como crioprotetor para a liofilização; T5 o tratamento de acúmulo da trealose endógena das leveduras, tendo a solução de sacarose a 10% como crioprotetor para a liofilização; e T6 o tratamento de acúmulo da trealose endógena das leveduras, tendo a solução de trealose a 10% como crioprotetor para a liofilização.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os valores médios do teor de trealose endógena das leveduras estudadas, submetidas aos tratamentos de acúmulo ou esgotamento da trealose endógena, encontram-se na TABELA 1.

Os valores médios da manutenção da viabilidade após 10, 40 e 90 dias da liofilização das leveduras estudadas, submetidas aos diferentes tratamentos de acúmulo ou esgotamento da trealose endógena e crioprotetores, encontram-se nas Figuras 1, 2 e 3.

Figura 1 - Efeito dos tratamentos na manutenção da viabilidade da levedura TA após liofilização.

Figura 2
- Efeito dos tratamentos na manutenção da viabilidade da levedura IZ-1904 após liofilização.

Figura 3
- Efeito dos tratamentos na manutenção da viabilidade da levedura SA após liofilização.

Para todas as leveduras e para todos os tratamentos estudados, houve efeito significativo ao nível de 1% entre teor de trealose endógena e manutenção da viabilidade aos 10 dias após a liofilização. Quanto à manutenção da viabilidade aos 10, 40 e 90 dias após a liofilização, não houve diferença estatística ao nível de 5%, para todas as leveduras e tratamentos estudados.

De uma forma geral, os resultados obtidos mostraram uma grande variação em relação à manutenção da viabilidade celular após a liofilização das leveduras frente aos tratamentos testados.

Dentre as três leveduras testadas, as leveduras TA e SA não diferiram entre si na capaci-dade de acumular trealose endógena, porém diferiram estatisticamente ao nível de 1% da levedura IZ-1904. Assim sendo, as leveduras TA e SA apresentaram uma maior capacidade de acúmulo de trealose endógena que a levedura IZ-1904. Por consequência disto, em todos os tratamentos testados, as leveduras TA e SA apresentaram também maior taxa de manutenção da viabilidade celular após a liofilização.

Nas condições da presente pesquisa observa-se que houve acúmulo da trealose endógena pelas leveduras com a aplicação de um tratamento térmico (mudança da temperatura do meio de 26 para 45^oC por duas horas). Estes resultados estão de acordo com Grba et al. (1975) e Hottinger et al. (1992), os quais citam que, quando as células de levedura são expostas a um tratamento térmico (mudança de 23-30 para 36-45^oC), há um acúmulo da trealose endógena nas células.

Pelos resultados da presente pesquisa observa-se que com o acúmulo da trealose endógena houve um significativo aumento na manutenção da viabilidade após a liofilização das três leveduras testadas. Estes resultados estão de acordo com Suomalainen & Pfaffli (1961) e Lillie & Pringle (1980) os quais verificaram que a manutenção da viabilidade celular de leveduras, por períodos de armazenamento prolongados, é devida ao alto teor de trealose endógena. Estes resultados aqui encontrados também concordam com Hino et al. (1990) e com Grba et al. (1975) e Leslie et al. (1994) os quais relatam que, com o acúmulo da trealose endógena das leveduras, aumenta-se a sua tolerância ao congelamento e à desidratação, respectivamente.

De acordo com os resultados do presente trabalho, tanto para o tratamento de acúmulo como para o de esgotamento da trealose endógena, a solução de leite desnatado a 10% foi a que proporcionou melhor crioproteção às células das três leveduras testadas, resultando em uma maior taxa de manutenção da viabilidade após a liofilização. A solução de sacarose a 10% foi a que proporcionou menor taxa de manutenção da viabilidade após a liofilização das três leveduras.

Os resultados de melhor crioproteção às células de levedura obtidos com o leite desnatado como crioprotetor para a liofilização podem ser explicados pela hipótese de que, por ser uma mistura de diversos componentes, algum ou alguns destes componentes do leite desnatado possam exercer uma melhor ação crioprotetora às células de levedura que a trealose ou a sacarose isoladamente.

Uma segunda hipótese seria que, sendo a lactose um carboidrato que a levedura não metaboliza e a sacarose e a trealose carboidratos que a levedura pode metabolizar, a ressuspensão das células de levedura nos crioprotetores sacarose e trealose pode ter levado a uma alteração no seu teor de trealose acumulada endogenamente devido a uma mudança na concentração de açúcar aproveitável pela levedura no meio, pois, segundo Lillie & Pringle (1980), quando há açúcar aproveitável no meio, as leveduras, além de não acumularem trealose, podem esgotar a sua trealose endógena acumulada anteriormente.

Numa terceira hipótese, parte da trealose acumulada endogenamente poderia ter sido transportada para fora da célula e auxiliado o leite desnatado na crioproteção das células de levedura submetidas à liofilização. Esta hipótese parece ser aceitável pois Crowe et al. (1991) relatam que a levedura Saccharomyces cerevisiae possui um carregador para que a trealose endógena possa ser transportada para fora da célula e Eleutherio et al. (1993) citam que a trealose deve estar presente nos dois lados da camada de lipídios da membrana celular para oferecer proteção contra o estresse, sugerindo que o carregador desempenhe um papel crucial para a célula de levedura, transportando a trealose endógena para o exterior da célula.

Esta terceira hipótese também concorda com Podlech et al. (1996), os quais, testando diversos crioprotetores, verificaram que a solução de leite desnatado mais trealose foi a que melhor protegeu as células da levedura Saccharomyces boulardii submetida à liofilização.

Para todas as leveduras testadas, o tratamento que proporcionou uma maior manutenção da viabilidade, tanto aos 10, 40 e 90 dias após a liofiliza-ção, foi o tratamento de acúmulo da trealose endógena tendo o leite desnatado como crioprotetor para a liofilização. O tratamento que proporcionou uma menor manutenção da viabilidade das três leveduras testadas, tanto aos 10, 40 e 90 dias após a liofilização, foi o tratamento de esgotamento da trealose endógena tendo a sacarose como crioprotetor para a liofilização.

Os resultados aqui encontrados de manutenção da viabilidade praticamente constantes até 90 dias após a liofilização estão de acordo com Costa & Ferreira (1991) e com Silva et al. (1992) os quais relatam que a liofilização mantém estável a viabilidade das culturas de levedura por longo período de armazenamento.

CONCLUSÕES

Para as condições da presente pesquisa, a análise dos resultados obtidos permite as seguintes conclusões:

- O acúmulo da trealose endógena pelas leveduras proporcionou uma maior taxa de manutenção da viabilidade celular após o processo de desidratação por liofilização.

- Dentre os crioprotetores testados, a solução de leite desnatado a 10% foi o que proporcionou uma melhor crioproteção às células de levedura, obtendo-se maior viabilidade celular após a liofilização.

- A viabilidade celular após a liofilização de todas as leveduras utilizadas manteve-se constante até 90 dias, o qual foi o prazo máximo testado.

- Das leveduras testadas, as leveduras TA e SA possuíram maior capacidade de acumular trealose endógena através do tratamento térmico.

AGRADECIMENTOS

À FERMENTEC S/C Ltda, Assistência Técnica em Fermentação Alcoólica, e em especial ao Prof. Dr. Henrique Vianna de Amorim, pelo incentivo constante ao longo do trabalho e apoio financeiro às pesquisas.

Recebido para publicação em 20.02.97

Aceito para publicação em 08.10.97

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Dissertação de Mestrado do primeiro autor apresentada à Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" (ESALQ/USP).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Fev 1999
• Data do Fascículo
  Set 1997

Histórico

• Aceito
  08 Out 1997
• Recebido
  20 Fev 1997