EFEITO DA RADIAÇÃO GAMA NA SOBREVIVÊNCIA DA LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae (cepa M-300-A) EM MOSTO DE MEL DE CANA-DE-AÇÚCAR

EFEITO DA RADIAÇÃO GAMA NA SOBREVIVÊNCIA DA LEVEDURA Saccharomyces cerevisiae (cepa M-300-A) EM MOSTO DE MEL DE CANA-DE-AÇÚCAR

A.R. ALCARDE; J.M.M. WALDER

Centro de Energia Nuclear na Agricultura/USP, C.P. 96, CEP: 13400-970, Piracicaba, SP.

RESUMO: No presente trabalho foi estudado o efeito da radiação gama na sobrevivência da levedura Saccharomyces cerevisiae em mosto de melaço de cana-de-açúcar. O melaço a 65^o Brix foi diluído a 11^o Brix e inoculado com a levedura Saccharomyces cerevisiae (cepa M-300-A). As amostras foram irradiadas com doses de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 e 6,0 kGy (Cobalto-60), a uma taxa de 1,703 kGy/h. As amostras foram armazenadas a 4, 18 e 32^oC por 7 e 14 dias. A radiação gama se mostrou efetiva em controlar a proliferação da levedura no mosto logo após a sua irradiação, sendo que nas doses de 5,0 e 6,0 kGy não foi observada nenhuma unidade formadora de colônia da levedura. As amostras armazenadas por 7 e 14 dias a 4^oC não apresentaram capacidade de proliferação da levedura, mostando resultados semelhantes àqueles obtidos logo após a irradiação do mosto. Nenhuma dose de radiação foi efetiva, porém no controle da proliferação da levedura nas amostras armazenadas por 7 e 14 dias a 18 e 32^oC. A dose D₁₀ (dose para reduzir a população a um décimo) determinada para a levedura Saccharomyces cerevisiae no mosto foi de 0,775 kGy.

Descritores: irradiação, mosto de mel de cana-de-açúcar, Saccharomyces cerevisiae, sobrevivência

EFFECT OF GAMMA RADIATION ON THE SURVIVAL OF Saccharomyces cerevisiae (strain M-300-A) IN SUGAR-CANE MOLASSES

ABSTRACT: The effect of gamma radiation was studied on yeast survival in sugar-cane molasses. Molasses (65^o Brix) was diluted to 11^o Brix and inoculated with Saccharomyces cerevisiae (strain M-300-A) yeast. The samples were irradiated with doses of 1.0; 2.0; 3.0; 4.0, 5.0 and 6.0 kGy (Cobalt-60), at a 1.703 kGy/h rate. The samples were stored at 4, 18 and 32^oC during 7 and 14 day periods. No unit-forming colony was detected at the doses of 5.0 and 6.0 kGy, immediately after irradiation. Gamma radiation was effective to control yeast proliferation on sugar-cane molasses right after irradiation. The samples stored at 4^oC for periods of 7 and 14 day did not show yeast proliferation, however none of the radiation doses was effective in controlling yeast proliferation of samples stored at 18 and 32^oC for periods of 7 and 14 days. The D₁₀ (dose for ten-times population reduction) determined for the yeast Saccharomyces cerevisiae in sugar-cane molasses, was 0.775 kGy.

Key Words: irradiation, sugar-cane molasses, Saccharomyces cerevisiae, survival

INTRODUÇÃO

Uma das principais preocupações na indústria sucro-alcooleira é combater os microrganismos contaminantes do processo de produção de álcool, representados pelas bactérias e leveduras que se instalam no processo. Estes contaminantes são causadores de problemas como: consumo de açúcar, queda de viabilidade de células de levedura devido às toxinas excretadas no meio, floculação do fermento que acarreta perda de células de levedura pelo fundo de dorna ou na centrífuga e queda no rendimento industrial (Amorim et al., 1989). Além disso, a formação de gomas, principalmente a de dextrana, provocada pela contaminação, aumenta a viscosidade do caldo, causando problemas operacionais na fábrica (Tilbury, 1975). As leveduras selvagens contaminantes, quando mais resistentes às condições do processo do que as leveduras inoculadas, podem chegar até a dominar o processo fermentativo (Basso et al., 1996).

O caldo de cana-de-açúcar contém quantidades variáveis de nutrientes orgânicos e inorgânicos, alta atividade de água, pH e temperatura favoráveis que proporcionam o crescimento de uma grande flora microbiana (Gallo, 1989). Este mesmo autor citou ainda que as próprias condições de cada etapa do processo de produção de álcool selecionam o desenvolvimento de microrganismos, sendo que todo o processo está sujeito à contaminação, desde a cana-de-açúcar no campo até a fermentação do seu caldo.

Tilbury (1975) cita que em cana-de-açúcar saudável são encontradas 10⁴ a 10⁸ bactérias e 10³ a 10⁴ leveduras selvagens por grama, sendo que os gêneros de levedura mais comumente encontrados no colmo da cana são Saccharomyces, Torula e Pichia.

Trabalhos de caracterização destes microrganismos contaminantes mostram que as leveduras contaminantes e as bactérias do grupo gram-positivo predominam no processo, sendo os gêneros bacterianos Bacillus e Lactobacillus os de maior ocorrência (Gallo, 1989).

As leveduras e as bactérias contaminantes podem produzir ácido lático e outros ácidos orgânicos, os quais, em quantidades superiores às normais, podem ser responsáveis por uma queda no rendimento da fermentação (Amorim & Oliveira, 1982).

Amorim et al. (1981) citam que quando a contaminação bacteriana atinge níveis superiores a 10⁷ células/ml pode ocorrer uma significativa queda no rendimento alcoólico. Para Amorim & Oliveira (1982) o não controle da contaminação bacteriana pode ocasionar indiretamente uma redução no rendimento da fermentação por dois motivos: aumento da viscosidade do vinho ocasionando uma maior perda do fermento no vinho centrifugado e maior consumo de açúcar, desviando este da produção de açúcar e álcool.

Alterthum et al. (1984) mostraram que quedas no rendimento alcoólico variáveis de 14 a 90% do teórico foram verificadas quando a concentração bacteriana atingiu 10⁸ a 10⁹ células/ml.

Segundo Khan & Hoq (1990) fermentações conduzidas em presença de 5,0x10⁶ bactérias, sendo que 5,0x10³ eram produtoras de ácido, apresentaram rendimento 11,4% menor que quando estas não estavam presentes.

A absorção da radiação ionizante causa alterações químicas nos componentes celulares dos microrganismos, as quais podem ter consequências para a atividade das células. De todos os mecanismos que estão envolvidos na ação da radiação sobre as células, a alteração no seu DNA é considerada a mais importante (Urbain, 1986). Como uma consequência de tais alterações induzidas pela radiação pode ocorrer a morte das células.

Leveduras e bolores têm uma sensibilidade à radiação comparada a de algumas bactérias não formadoras de esporos. As doses letais para leveduras estão, aproximadamente, na faixa de 4,65 a 20,0 kGy (Urbain, 1986). Segundo o mesmo autor a dose letal, em kGy, para os seguintes gêneros de leveduras é: Candida: 5,50-10,30; Rhodotorula: 4,72; Saccharomyces: 5,40-5,80.

Numerosas pesquisas têm demonstrado que a combinação da refrigeração com a irradiação causa um efeito inibitório sobre a multiplicação de microrganismos deterioradores, reduzindo a dose de radiação requerida para o controle da proliferação destes microrganismos.

Trabalhando com sucos de maça e uva, Kaindl (1966) verificou que foi necessária uma dose de 18,0 kGy para inibir o processo de formação de colônias de Saccharomyces cerevisiae Hansen por um período de 20 dias. Para suco de laranja, Dharkar (1964) obteve sua esterilização com dose de 8,0 kGy.

Kaupert et al. (1980) observaram que é necessária uma dose de 1,0 kGy para obter uma redução a um décimo da população de Saccharomyces rouxii em suco de maça.

Zeller et al. (1984), trabalhando com xarope de cana-de-açúcar, verificou que a DMI (dose mínima de radiação gama) necessária para sua esterilização foi de 12,67 kGy. Os mesmos autores verificaram que a dose de 10,0 kGy mostrou ser efetiva para conservar o xarope por um período de 105 dias sob condições ambientais, sem que o teor de açúcares do produto fosse alterada.

Estudos realizados por Domarco et al. (1996) concluíram que o tratamento combinado da dose de 1,0 kGy de radiação e refrigeração a 0^oC foi efetivo para o controle da proliferação de Saccharomyces cerevisiae em suco de laranja por 90 dias de armazenamento. A dose de 2,5 kGy foi suficiente para conservar o suco de laranja por 90 dias de armazenamento a 5^oC. A 25^oC somente doses mais altas (5,0 e 7,5 kGy) foram efetivas no controle da levedura no suco de laranja.

Assim sendo, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da radiação gama na proliferação, bem como determinar a dose de radiação D₁₀ (dose de radiação gama que reduz para um décimo a população) para a levedura Saccharomyces cerevisiae (cepa M-300-A) em mosto de melaço de cana-de-açúcar.

MATERIAIS E MÉTODOS

Os mostos foram obtidos de melaço a 66^o Brix (p/v), diluído a 11^o Brix (p/v) e esterilizado em autoclave a 1,0 atmosfera de pressão, a 121^oC durante 20 minutos.

A cultura de levedura Saccharomyces cerevisiae (cepa M-300-A) encontrava-se em estado liofilizado e foi reativada em tubos de ensaio contendo 5,0 ml de meio de cultivo líquido YEPD (extrato de levedura - 1,0%, peptona - 1,0%, dextrose - 2,0%). Depois de incubada a 32^oC±1^oC por 48 horas, a cultura foi repicada e incubada novamente nas mesmas condições, por mais 24 horas.

O inóculo da levedura foi preparado inoculando-se 1,0 ml da suspensão da levedura reativada em 100 ml de meio de cultivo líquido YEPD e incubando-se a 32^oC±1^oC por 24 horas. O inóculo, após a incubação, apresentava uma população na ordem de 10⁷ UFC (unidades formadoras de colônia) por ml.

Desse inóculo foi retirado 1 ml e transferido para tubos de ensaio contendo 9 ml de mosto (11^o Brix), os quais, em seguida, foram irradiados em triplicata, com doses, acumulativas, de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 e 6,0 kGy, a uma taxa de 1,703 kGy/h. Logo após a irradiação com cada dose, foi determinado o número de unidades formadoras de colônia da levedura nas amostras e os demais tubos foram mantidos a 4, 18 e 32^oC, por 7 e 14 dias de armazenamento.

A semeadura nas placas foi feita em profundidade (pour-plate), com 1,0 ml do mosto, utilizando-se três placas de Petri para cada diluição. Foi usado o meio de cultivo sólido YEPD (extrato de levedura - 1,0%, peptona - 1,0%, dextrose - 2,0%, agar - 1,5%) para a semeadura. A contagem das unidades formadoras de colônia da levedura foi realizada após 48 horas de incubação a 32^oC.

Os dados foram analisados mediante o sistema SAS 6.8. Aos dados obtidos foi aplicada a Análise de Variância Univariada e as variâncias foram discriminadas pelo teste F (P³0,01). As comparações múltiplas entre as médias foram efetuadas pelo teste de Tukey (P³0,01).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os dados originais TABELA 1 foram submetidos à análise estatística e como não apresentavam homogeneidade de variâncias (homocedasticidade) foram transformados através da fórmula x^0,069937. Em seguida, os dados transformados foram submetidos à análise de variância e os valores de F encontram-se na TABELA 2. Um efeito sinergístico é evidenciado pelo uso combinado da irradiação e da temperatura de armazenamento.

Os resultados relativos a esses fatores (dose de radiação, temperatura e período de armazenamento) são mostrados na TABELA 3. A comparação das médias das doses de radiação foi realizada dentro de cada temperatura, ao longo do período de armazenamento.

A radiação gama se mostrou efetiva no controle da proliferação da levedura em mosto de melaço de cana-de-açúcar logo após a sua irradiação, pois, observando-se os resultados da TABELA 3, pode-se notar que logo após a irradiação as parcelas irradiadas diferiram estatisticamente da testemunha em todos os níveis de irradiação. Entretanto, somente com as doses de 5,0 e 6,0 kGy as parcelas não apresentaram unidade formadora de colônia.

Aos 7 e 14 dias de armazenamento, as amostras armazenadas a 4^oC não resultaram em proliferação da levedura, mostrando resultados idênticos aos obtidos logo após a irradiação do mosto, com as parcelas irradiadas diferindo da testemunha em todos os níveis de irradiação e não apresentando unidade formadora de colônia nas doses de 5,0 e 6,0 kGy (TABELA 3).

Nenhuma dose de radiação foi efetiva em suprimir a proliferação da levedura nas amostras armazenadas por 7 e 14 dias a 18 e 32^oC, pois, observando-se a TABELA 3, nota-se que as parcelas irradiadas não diferiram estatisticamente da testemunha em todos os níveis de irradiação.

Portanto, pelos resultados encontrados, observa-se que não houve a esterilização do mosto nem com a dose de 6,0 kGy, a qual foi a dose mais alta empregada no trabalho. Estes resultados estão de acordo com Dharkar (1964), o qual obteve esterilização de suco de laranja somente com dose de 8,0 kGy, e com Kaindl (1966), o qual verificou ser necessária uma dose de 18,0 kGy para inibir o processo de formação de colônias de Saccharomyces cerevisiae em sucos de maça e uva por um período de 20 dias.

Os resultados aqui encontrados concordam também com Zeller et al. (1984), os quais verificaram que a dose mínima de radiação gama necessária para a esterilização do xarope de cana-de-açúcar foi de 12,67 kGy.

Os resultados do presente trabalho concordam com os do realizado por Domarco et al. (1996), no qual doses de radiação de 1,0 e 2,5 kGy foram efetivas em controlar a proliferação de Saccharomyces cerevisiae em suco de laranja por 90 dias de armazenamento a 0 e 5^oC, respectivamente. No entanto, os autores constataram que a 25^oC as doses de 5,0 e 7,5 kGy foram efetivas no controle do crescimento da levedura no suco de laranja, o que não foi conseguido com a dose de 5,0 kGy em mosto de melaço na presente pesquisa.

De acordo com a Figura 1, a dose D₁₀ (dose para reduzir a um décimo a população) determinada para a levedura Saccharomyces cerevisiae foi de 0,775 kGy. Este resultado é menor que o encontrado por Kaupert et al. (1980), os quais trabalharam com irradiação de suco de maça inoculado com Saccharomyces rouxii, constatando que foi necessária uma dose de 1,0 kGy para se obter o mesmo efeito.

R = 98,73% y = -1,291.x + 7,001 Dose D₁₀ = 0,775 kGy

Figura 1 - Variação da população da levedura Saccharomyces cerevisiae em mosto de cana-de-açúcar irradiado, em função das doses de radiação.

Os resultados da presente pesquisa indicam que a radiação gama pode ser um importante expediente para o controle de Saccharomyces contaminantes do mosto de melaço de cana-de-açúcar.

Assim, pesquisas devem ser feitas para um estudo mais profundo do assunto, que parece ser promissor, pois Zeller et al. (1984) já constataram que não ocorreu alteração no teor de açúcares do xarope de cana-de-açúcar com a irradiação. Também poderão ser realizados estudos para verificar a influência da radiação gama sobre as bactérias contaminantes do mosto de cana-de-açúcar, as quais representam um problema sério enfrentado pelos produtores de álcool, tanto pelos prejuízos causados por estes contaminantes quanto pelo alto custo dos agentes antimicrobianos.

O melaço de cana-de-açúcar é armazenado pela indústria sucro-alcooleira para posterior utilização na fermentação alcoólica e, por possuir alta concentração de açúcares, não há grandes problemas com contaminação microbiana durante seu armazenamento. No entanto, a indústria não tem interesse no armazenamento do mosto de cana-de-açúcar, o qual é fermentado quase que imediatamente após sua obtenção. O que é de interesse no caso é a redução da população dos microrganismos contaminantes deste mosto, o que o processo de irradiação poderá vir a proporcionar.

CONCLUSÕES

Para as condições do presente estudo, os resultados obtidos permitem as seguintes conclusões:

- A radiação gama se mostrou efetiva em evitar a proliferação da levedura em mosto de melaço de cana-de-açúcar logo após sua irradiação, sendo a dose D₁₀ determinada para a levedura Saccharomyces cerevisiae neste mosto de 0,775 kGy.

- Somente na temperatura de armazenamento de 4^oC é que a radiação gama se mostrou eficiente em restringir o crescimento da levedura até aos 14 dias de armazenamento. As amostras armazenadas a 18 e 32^oC já aos 7 dias de armazenamento mostraram crescimento vigoroso da população de leveduras.

- A dose de 6,0 kGy, a mais elevada empregada no trabalho, não foi suficiente para esterilizar o mosto inoculado com a levedura Saccharomyces cerevisiae (cepa M-300-A).

- A radiação gama pode ser um importante expediente para o controle da contaminação por leveduras em mosto de melaço de cana-de-açúcar.

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Recebido para publicação em 20.02.97

Aceito para publicação em 23.09.97

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Fev 1999
• Data do Fascículo
  Set 1997

Histórico

• Aceito
  23 Set 1997
• Recebido
  20 Fev 1997