ACÚMULO DE CÁDMIO POR Saccharomyces cerevisiae FERMENTANDO MOSTO DE MELAÇO

ACÚMULO DE CÁDMIO POR Saccharomyces cerevisiae FERMENTANDO MOSTO DE MELAÇO

L.G. do PRADO-FILHO¹; R.N. DOMINGOS²; S.M.G. da SILVA³

¹Depto. de Ciência e Tecnologia Agroindustrial-ESALQ/USP, C.P. 9, CEP: 13.418-900 - Piracicaba, SP.

²Faculdade de Engenharia Ambiental-UNITINS - Paraíso do Tocantins, TO.

³Pós-Graduando do Dep. Ciência e Tecnologia Agroindustrial-ESALQ/USP.

RESUMO: O presente trabalho visou o estudo do acúmulo de cádmio (Cd) por Saccharomyces cerevisiae, fermentando mosto de melaço com contaminações controladas em níveis sub-tóxicos do citado metal. As condições de fermentação foram similares às reinantes na produção industrial de etanol. O mosto, não esterilizado, continha 12% de açúcares redutores totais (ART) e pH 4,5. Para a contaminação controlada empregou-se dois sais de cádmio, cloreto e acetato e, quatro níveis de contaminação 0,5; 1,0; 2,0 e 5,0 mg Cd.kg^-1 mosto. A inoculação do mosto foi executada com fermento de panificação (10% p/p). Após a fermentação (4 horas) foram determinados, porcentagem de fermento no vinho centrifugado e teor alcoólico. Na levedura separada foram determinados peso úmido, matéria seca, proteína bruta e teores de cádmio por espectrofotometria de absorção atômica. Em todos os níveis de contaminação estudados houve acúmulo de Cd pela levedura e diminuição do rendimento em etanol.

Descritores:Saccharomyces cerevisiae, melaço, metal pesado, cádmio, espectrofotômetria de absorção atômica

ACCUMULATION OF CADMIUM BY Saccharomyces cerevisiae FERMENTING WORT OF MOLASSES

ABSTRACT: The aim of this paper was to study the cadmium (Cd) accumulation by Saccharomyces cerevisiae fermenting wort of molasses, under sub-toxic levels of controlled cadmium contamination. Fermentation conditions were similar to industrial alcohol production. Non-sterelized wort had 12% of total reducing sugars (w/w) and pH 4.5. For the controlled contamination, two cadmium salts were used (chloride and acetate), at four levels of contamination: 0.5; 1.0; 2.0 and 5.0 mg Cd.kg^-1 wort. The inoculation of the wort was carried out with commercial bread yeast (10% w/w). After fermentation (4 hours), samples were evaluated for cellular viability, alcohol content and yeast percentage in the centrifuged wine. The centrifuged yeast cells were evaluated for total fresh and dry weight, total protein, and cadmium concentration by atomic absortion spectroscopy. In all Cd levels, there was cadmium accumulation by yeast and a decrease in ethanol yield.

Key Words:Saccharomyces cerevisiae, wort of molases, heavy metal, cadmium, atomic absorption spectroscopy

INTRODUÇÃO

A crescente industrialização nas últimas décadas, expôs animais e vegetais à muitas espécies químicas potencialmente tóxicas. Os metais pesados ou, metais traço, destacam-se como os mais perigosos, pois mesmo à níveis traço podem causar danos eco-biológicos irreversíveis (Miranda, 1993).

Recentes estudos sobre o comportamento dos metais traço no ambiente concluíram que muitos destes elementos, especialmente o cádmio, trazem sérios problemas devido à sua toxidade aliada ao fenômeno de bioacumulação (Ferguson, 1990; Pacyna, 1996; Pereira, 1995; Robards & Woursfold, 1991). O cádmio, particularmente, tem sido descrito como um dos elementos traço mais perigosos encontrados em alimentos e no ambiente (Gerhardsson & Skerfving, 1996; Reilly, 1991).

Embora o cádmio tenha sido descrito como um elemento relativamente raro (Valle & Ulmer, 1972; Wood, 1974), posteriormente, foi constatado que o mesmo encontra-se presente no ambiente em baixos níveis (Varma, 1988). Nos dias atuais, a concentração de cádmio na crosta terrestre varia entre 0,15 e 0,20 mg.kg^-1, sendo o 67º metal em abundância (Mattiazzo-Prezotto, 1994).

Como resultado do fenômeno de bioacumulação, as quantidades sub-tóxicas presentes no ambiente podem atingir níveis de risco nos elos finais da cadeia trófica (Volesky, 1990a). É bem conhecido que microrganismos possuem capacidade de acumular cádmio, sendo que Saccharomyces cerevisiae não é exceção (Brady & Duncan, 1994; Myada, 1987; Volesky, 1990b; Volesky & May-Phillips, 1995).

Quando as matérias primas para fermentação são oriundas de solos ácidos tratados com adubos fosfatados ou com lodo de esgoto, podem conter quantidades apreciáveis de cádmio, transportando este metal para o processo fermentativo (Babich & Stotzky, 1983).

O processo de fermentação normalmente utilizado no Brasil é o Melle-Boinot, no qual as células de levedura recuperadas são recirculadas no processo, mantendo elevada a concentração celular, e obtendo-se, assim, um aumento do rendimento alcoólico devido o menor consumo de açúcar para multiplicação e crescimento celular (Lopes, 1989). Entretando, várias usinas e destilarias desviam do processo parte do leite de levedura (10 a 20%), não comprometendo a produção de etanol (Lima, 1983).

A levedura que cresce em meio com concentrações sub-tóxicas aceitáveis de qualquer metal poderá apresentar, devido à capacidade de bioacumulação, maiores níveis que aqueles presentes no meio de crescimento (Volesky, 1990b; Volesky & May-Phillips, 1995), podendo atingir teores não admissíveis pela legislação vigente, o que a invalidaria como ingrediente de ração e, principalmente, como suplemento protéico humano.

O presente trabalho estudou o acúmulo de cádmio (Cd) por Saccharomyces cerevisiae, fermentando mosto de melaço com contaminações controladas, em níveis sub-tóxicos, empregando acetato e cloreto de cádmio como fonte do metal.

MATERIAIS E MÉTODOS

Para condução dos experimentos foi projetado e construído um conjunto de 3 minidornas construídas de prolipropileno com tampa de polietileno, com capacidade de 1,0 litro cada. O conjunto era dotado de um sistema de registros que permitia o controle independente da temperatura em cada uma das minidornas (Domingos, 1996).

O mosto, não esterilizado, foi preparado uma única vez, em volume de 18 litros, suficiente para realizar todo o trabalho. O melaço, obtido da Usina Costa Pinto - Piracicaba - SP safra 91/92, com 63,5% de açúcares redutores totais (ART) e 59,3% de açúcares redutores (AR), foi diluído a 12% de ART com água destilada (Amorim, 1982). Foram acrescentados, como nutrientes, 300 mg nitrogênio [(NH₄)2SO₄], 150 mg fósforo (K₂HPO₄) 50 mg magnésio (MgCl₂.6H₂O) por quilograma de mosto. O pH foi ajustado a 4,5 com ácido sulfúrico. Após a homogenização, o volume total de mosto foi dividido em frações de 4,0 kg, recebendo cada uma doses dos sais de cádmio, cloreto (CdCl₂.½H₂O) e acetato (CdC₄H₆O₄.2H₂ O), que correspondiam as concentrações de 0,5; 1,0; 2,0 e 5,0 mg de Cd.kg^-1 de mosto, sendo uma fração não contaminada a testemunha. As frações contaminadas foram subdivididas em porções de 0,5 kg, e armazenadas em potes de polietileno à -20ºC até o momento do uso, quando eram descongeladas e acrescentava-se 10% p/p de fermento.

O fermento de panificação, marca Fleischmann, foi adquirido no comércio, de uma única partida, em pacotes de 500 g, os quais foram homogeneizados, através da quebra dos blocos, e estocados em geladeira até o momento do uso, quando era determinada a viabilidade celular (Sharf, 1972). Todas as fermentações duraram 4 horas cada, e o término foi confirmado por 3 medidas de ºBrix coincidentes, feitas de quinze em quinze minutos, e pelo término da formação da espuma. Ao final das fermentações retirou-se alíquotas de 5,0 ml para controle da viabilidade celular (Sharf, 1972).

O vinho foi então centrifugado a 12X10³ gravidades (ultra centrifuga CEPA, tipo LE, com rotor vertical de separação contínua sólido-líquido). O peso úmido total da levedura recuperada foi determinado para cada ensaio, para cada sal. No vinho quantificou-se o etanol, após destilação, em densímetro digital (Calculating Digital Density Meter AP Paar DMA 45), determinando-se a sua massa específica a 20ºC, e, expressando o teor alcoólico em mL de etanol por 100 mL do destilado.

Após a secagem da levedura (Silva, 1990a), 1,25g da mesma foi submetida a digestão sulfo-nitro-perclórica (H₂SO₄:HNO₃:HClO ₄, na proporção de 2:5:3), segundo a metodologia proposta por Varma (1988). As amostras de biomassa desmineralizadas foram então diluídas até 25mL e quantificadas por espectrofotometria de absorção atômica (espectrofotometro VARIAN-AA 175). Os teores de cádmio das soluções foram expressos em mg.kg^-1 de levedura úmida. Da biomassa seca, analisou-se o nitrogênio total segundo Silva (1990b).

O experimento foi realizado segundo o modelo estatístico de "bloco incompleto" no sistema fatorial 2 X 4 + controle (Cochram & Cox, 1957). Os resultados foram analisados pelo programa SANEST (Zonta & Machado, 1992).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em todos os níveis de contaminação houve acúmulo de Cd, pela levedura, estatisticamente significante ao nível de 99% de confiança para ambos os sais. A figura 1 mostra a alta correlação entre os teores do metal no mosto e na levedura bruta recuperada, r = 0,9759 para acetato e r = 0,9490 para cloreto.

Figura 1 -
Concentração de cádmio adsorvido pela levedura durante o processo de fermentação, por 4h a 30^o em mosto de melaço.

Nas condições estudadas, o acúmulo do metal pela levedura não pode ser quantificado se foi devido a biosorção, ou à bioacumulação, ou ambas simultaneamente.

Entretanto, sob quaisquer aspectos, a acumulação total, ou global ficou comprovada no estudo levado a efeito. A acumulação de cádmio na levedura bruta não diretamente proporcional aos teores de contaminações nos mostos pode ser atribuída às muito pouco conhecidas interações entre o elemento na forma de cátion ou metálica, e os compostos orgânicos e inorgânicos presentes em um meio complexo como o melaço. A ação individual de grupos quelantes, de sequestradores, de ligações como RS^-, S^-, SO₄^2-, F^-, NO₃^-, NH₃, etc, em um meio complexo como um melaço, é desconhecida, bem como as interações no ambiente fermentativo do mosto de melaço (Remacle, 1990).

Substratos complexos de composição química pouco definida podem comprometer os sítios de absorção ou adsorsão da parede celular. Quando o comportamento dos sítios de ligação da parede celular fica alterado, a levedura perde o seu potencial biológico em diferentes graus, chegando à perda da viabilidade. O comprometimento da parede celular pelo cádmio pode ser uma das razões da adsorsão não linear do metal pela levedura. Este comprometimento não se dá quando se trata de compostos que não interferem com a parede celular, como no caso dos azo-compostos (Barbosa, 1995).

A TABELA 1 mostra os teores alcoólicos nos vinhos das fermentações com diferentes níveis de contaminação de cádmio. Estatisticamente, foi detectada uma diferença significativa na produção de etanol entre os mostos contaminados e a testemunha, para ambos os sais de cádmio.

Nas condições estudadas não é possível afirmar se a diferença observada é devida a altera-ções do transporte de metabólitos através da parede celular ou, à influência direta sobre as enzimas que necessitam de ions divalentes para sua atividade.

Não foram detectadas diferenças estatisticamente significares entre os tratamentos e a testemunha na viabilidade celular, cuja média foi 98,95% de células vivas; no peso úmido da levedura bruta recuperada, cuja média foi 58,13 gramas e, no teor de proteína bruta da levedura, cuja média foi 35,88%.

Entretanto, o presente estudo não incluiu o reaproveitamento das leveduras em fermentações sucessivas. Assim sendo, não fica excluída a possibilidade de, com numerosas reciclagens do fermento, aparecerem sintomas de toxidade crônica, com reflexos negativos nos parâmetros supra citados e, mesmo, nos teores de cádmio nas células.

CONCLUSÕES

- Saccharomyces cerevisiae acumula cádmio duran-te a fermentação de mosto de melaço com contami-nações sub-tóxicas de cloreto e acetato de cádmio.

- Nos teores de contaminações empregados no presente estudo, 0,5; 1,0; 2,0 e 5,0 mg.kg^-1 de mosto, houve diminuição estatisticamente significante na produção de etanol.

- Nas dosagens utilizadas e, sem a reutilização da levedura em fermentações sucessivas, não foram detectados efeitos tóxicos aparentes, não havendo diferenças significantes entre os tratamentos no que se refere à viabilidade celular, peso úmido da levedura recuperada e, proteína bruta nas células após a fermentação.

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Recebido para publicação em 21.10.97

Aceito para publicação em 12.02.98

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  12 Nov 1998
• Data do Fascículo
  Jan 1998

Histórico

• Aceito
  12 Fev 1998
• Recebido
  21 Out 1997