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Scientia Agricola

Print version ISSN 0103-9016

Sci. agric. vol. 55 n. 2 Piracicaba May/Aug. 1998

http://dx.doi.org/10.1590/S0103-90161998000200021 

AVALIAÇÃO DE METODOLOGIA ALTERNATIVA PARA O TESTE DE TETRAZÓLIO PARA SEMENTES DE SOJA1

 

N.P. da COSTA2,3; J.B. FRANÇA NETO2,3; F.C. KRZYZANOWSKI2,3; A.A. HENNING2,3; J.E. PEREIRA2
2Embrapa Soja, C.P. 231, CEP: 86001-970 - Londrina, PR.
3Bolsista do CNPq.

 

 

RESUMO: Uma metodologia alternativa para o teste de tetrazólio, evidenciou a possibilidade de redução do período de embebição (pré-condicionamento) das sementes de 16 horas à 25ºC para 6 horas à 41ºC. Como a metodologia foi testada, até o momento, em um número limitado de cultivares, permaneceu a dúvida se o procedimento alternativo (6h/41ºC) era aplicável para uma gama maior de cultivares de soja. Assim sendo, executou-se a presente pesquisa onde foram avaliados três períodos de embebição (4h, 6h e 16 horas), duas temperaturas (41ºC e 25ºC) em sementes das cultivares BR-13, EMBRAPA 4, EMBRAPA 48, FT-Abyara, FT-5, IAS 5, OCEPAR 13, OCEPAR 14, OCEPAR 16 e OCEPAR 17. Os seguintes testes foram realizados: grau de umidade e tetrazólio (determinando-se os índices de vigor, viabilidade, dano mecânico, deterioração por umidade e lesão de percevejo). Concluiu-se que: a) o pré-condicionamento das sementes de soja à temperatura de 41ºC por 6 h possibilitou o desenvolvimento de coloração nítida para a leitura do teste de tetrazólio, fornecendo condições para uma avaliação precisa dos índices de vigor e de viabilidade, b) o pré-condicionamento pelo período de 4 h à 41ºC afeta drasticamente o desenvolvimento da coloração das sementes, não permitindo identificar com precisão às classes de vigor e de viabilidade para todas as cultivares testadas; entretanto esse procedimento é eficiente para a caracterização das lesões causadas por percevejos.
Descritores:
teste de tetrazólio, Glycine max ( L.) Merrill, viabilidade, vigor

 

EVALUATION OF AN ALTERNATIVE METHOD OF THE
TETRAZOLIUM TEST FOR SOYBEAN SEEDS

ABSTRACT: An alternative method of the tetrazolium test established that the preconditioning period of soybean seeds could be successfully shortened from the traditionally 16 hours at 25ºC to 6 hours at 41ºC. Since this alternative method has been tested so far with a limited number of soybean cultivars, it is imperative that it should be tested for additional cultivars. The applicability of this alternative procedure of seed preconditioning was tested in ten soybean cultivars: BR-13, EMBRAPA 4, EMBRAPA 48, FT-Abyara, FT-5, IAS 5, OCEPAR-13, OCEPAR-14, OCEPAR-16, and OCEPAR-17. Two imbibition periods (4 h and 6 h) at 41ºC were tested and compared to the traditionally recommended period for preconditioning. The following tests were carried out: seed moisture content and tetrazolium through determinations of vigor, viability and level of mechanical damage, weathering and sting bug damage. From the results, the following conclusions can be drawn: a) seed preconditioninig for 6h at 41ºC resulted in adequate staining patterns of the seeds, allowing accurate estimates of vigor and viability; b) seed preconditioning for 4 h at 41°C did not develop adequate staining of the seeds, to correctly evaluate vigor and viability of the seeds; however, this procedure was efficient to identify sting bug damage on seeds.
Key Words:
tetrazolium Test, Glycine max (L.), viability, vigor

 

 

INTRODUÇÃO

O emprego de testes rápidos, em programas de controle de qualidade, torna-se uma ferramenta imprescindível para a avaliação da qualidade fisiológica de um lote de sementes. Dentre esses, o teste de tetrazólio tem sido considerado como uma alternativa promissora, devido à rapidez e à eficiência na caracterização da viabilidade, do vigor e da deterioração por umidade, de danos mecânicos, de percevejos e de secagem. Os dados obtidos através do teste auxiliam no processo de controle de qualidade durante as etapas de colheita, transporte, beneficiamento e armazenamento de sementes de soja. Essas informações possibilitam estabelecer bases sólidas para fins de comercialização (Carvalho, 1986).

A avaliação da qualidade fisiológica de sementes de soja, por meio do teste de tetrazólio, tem proporcionado, nos últimos anos, contribuição altamente significativa na identificação dos níveis de vigor e viabilidade, fundamentais para o controle de qualidade de sementes no Brasil (Costa & Marcos Filho,1994b); (Marcos Filho et al. 1987). Além da importância do referido teste na avaliação do vigor, destaca-se o monitoramento da deterioração no campo, que compromete a qualidade da semente, especialmente nas regiões de baixas latitudes, onde as condições climáticas geralmente são mais drásticas. Além disso, o teste permite a avaliação do controle de percevejos e da redução de danos mecânicos durante a colheita.

A atual metodologia do teste de tetrazólio estabelece um período de 16 h à 25ºC de pré-condicionamento para a realização do teste (França Neto et al., 1998). Esse período tem sido considerado, em algumas situações, como sendo relativamente longo e, muitas vezes, pode dificultar a geração de informação, principalmente quando há urgência na obtenção de resultados. Tal fato vem sendo questionado por parcela expressiva de produtores de sementes, os quais têm sugerido estudos para o aprimoramento do teste, no que diz respeito à redução do período de embebição das sementes, fase que antecede o processo de coloração para sua realização. Todavia, para se obter ganhos significativos em termos de rapidez na realização do teste, as evidências apontam que o aumento da temperatura, durante a etapa de pré-condicionamento, seguramente resultará na redução do processo de embebição, condição fundamental para aceleração do desenvolvimento de coloração das sementes pelo tetrazólio. A confirmação dessa hipótese para uma ampla gama de cultivares de soja possibilitará ao setor sementeiro dispor de tecnologia eficiente, rápida e confiável, permitindo a condução do teste de tetrazólio em período inferior ao preconizado pela metodologia tradicional (16 h à 25ºC). A esse respeito, Costa (1992), Hsu et al. (1983), Burch & Delouche (1959) detectaram que temperaturas elevadas podem aumentar a velocidade de embebição da semente, permitindo o entumescimento das mesmas em período relativamente curto e, conseqüentemente, obtendo-se precioso ganho na redução de tempo para a execução do teste. Por outro lado, McDonald et al. (1988) destacam que, proporcionalmente, o eixo embrionário de sementes de soja absorve maior quantidade de água do que o tegumento e cotilédones. Ainda destacam que não ocorreu diferença em volume de absorção de água entre sementes deterioradas quando comparadas com sementes não deterioradas.

A literatura tem mostrado que o grau de umidade das sementes, após a fase de pré-condicionamento é um fator extremamente importante para um desenvolvimento normal de coloração pelo teste de tetrazólio. Costa & Marcos Filho (1994b) observaram que, a partir de 27% de umidade, ocorreu um bom desenvolvimento de coloração pelo tetrazólio, para sementes de três cultivares de soja. Costa (1992) comprovou que esse grau de umidade das sementes pode ser atingido com pré-condicionamento realizado por 6 horas à 41ºC. Estas condições propiciaram uma adequada coloração das sementes pelo tetrazólio, permitindo a sua execução com um ganho de 10 horas, em relação à metodologia tradicional de pré-condicionamento, que requer um período de embebição de 16 horas à 25ºC.

A presente pesquisa foi realizada com o objetivo de ampliar a gama de informações para cultivares de soja, quanto à redução do período de pré-condicionamento das sementes no teste de tetrazólio, com base no aumento da temperatura de embebição.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Para a realização do estudo, foram coletadas amostras de sementes de soja, produzidas na Embrapa-Soja, em Londrina, PR, durante a safra 1995/96, das seguintes cultivares: BR-13; EMBRAPA 4; EMBRAPA 48 ; FT-Abyara; FT-5; IAS 5; OCEPAR 13; OCEPAR 14; OCEPAR 16; OCEPAR 17. Para execução das análises de laboratório, foram colhidas aproximadamente 30 kg de sementes de cada cultivar. Após a homogenização das sementes, cada amostra foi subdividida em quatro repetições de um kg, utilizando-se no processo um divisor cônico. Posteriormente, cada amostra foi acondicionada em caixa de papelão e armazenada em câmara fria (10ºC/50%UR) até o momento em que as análises de laboratório foram executadas.

Para estudar o efeito dos diferentes tratamentos sobre a redução do período de embebição em sementes de soja, foram empregados os seguintes procedimentos: o teste de tetrazólio, cuja concentração da solução do sal foi de 0,075%, através do qual as sementes foram avaliadas individualmente, segundo procedimentos descritos por França Neto et al. (1998). Após o seccionamento longitudinal das sementes entre os cotilédones (com o cuidado para que o eixo embrionário fosse dividido ao meio nessa secção longitudinal), com o auxílio de uma lâmina de barbear. Após o corte das sementes, as duas metades foram separadas e o tegumento removido para a exposição da superfície externa dos cotilédones, observando-se a ocorrência dos danos mecânicos, por percevejos e deterioração por umidade, nas partes externas e internas dos cotilédones; dando-se atenção especial ao eixo embrionário. Durante a leitura e a interpretação foi observado, com detalhes, se a ocorrência de determinado dano no eixo embrionário era superficial, atingindo apenas o córtex ou se afetava o cilindro central. Para a informação dos resultados do referido teste, cada semente foi analisada e classificada em classes de viabilidade de 1 a 8 (França Neto et al., 1998). Após essa avaliação, registraram-se os níveis de vigor, de viabilidade e a identificação da(s) causa(s) que possa(m) ter determinado a citada classe. A somatória dos percentuais das classes 1 a 3 resultou no índice de vigor (TZ 1-3) e a somatória de 1 a 5 no índice de viabilidade (TZ 1-5) das sementes de cada cultivar (França Neto et al.,1998). Por sua vez, o diagnóstico de perda de qualidade foi efetuado através do exame das sementes incluídas nas classes 6 a 8, identificando-se as causas determinantes (dano mecânico, lesões de percevejos e deterioração por umidade), cujos resultados foram expressos em percentagem, segundo França Neto et al. (1998). Foi ainda conduzido o seguinte teste complementar: grau de umidade da semente (%) (Brasil, 1992).

A metodologia utilizada para o pré-condicionamento das sementes das 10 cultivares foi através da embebição de 200 sementes (quatro sub-amostras com 50 sementes) por repetição e por tratamento. As sementes foram pré-condicionadas em papel germitest, previamente umedecido com quantidade de água equivalente a 2,5 vezes o seu peso e, posteriormente, submetidas ao processo de pré-condicionamento por 16 horas à 25ºC (testemunha), 4 horas à 41ºC e 6 horas à 41ºC. As amostras foram acondicionadas em caixas plásticas (gerbox), com bandeja de tela, sendo adicionados 50 ml de água, objetivando manter uniforme a umidade relativa do ar no interior das mesmas. As caixas foram fechadas e colocadas em germinadores regulados nas temperaturas citadas acima. Passado cada período, as amostras de sementes da cada cultivar foram retiradas do germinador sendo, duas sub-amostras utilizadas para a avaliação do grau de umidade, através do método de estufa (105ºC/24h), segundo Brasil (1992). Para a avaliação da qualidade de sementes de todas as cultivares pelo teste de tetrazólio, foram utilizadas as outras duas sub-amostras. Após a embebição, as amostras foram retiradas do germinador e colocadas em copos plásticos de 50 ml contendo solução de tetrazólio na concentração de 0,075% e levadas a uma estufa mantida à temperatura de 40ºC durante o período de duas horas e meia, para o desenvolvimento de coloração (França Neto et al., 1998). O experimento foi organizado em delineamento de blocos ao acaso, com quatro repetições em esquema fatorial, sendo os fatores cultivar (10 cultivares), duas temperaturas (25ºC e 41ºC), e três períodos de embebição (4 h, 6 h e 16 h). Foi aplicado o teste de Tukey (P£0,05) para a separação das médias dos valores obtidos para todas as análises realizadas.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A análise de variância mostrou efeito significativo para todos os parâmetros analisados com relação ao fator cultivar. O fato é decorrente da variabilidade genética existente entre os diferentes genótipos, comportamento esse considerado normal, quando se realiza uma análise de qualidade de sementes em soja, segundo Kueneman (1982) e Wien & Kueneman (1981). O grau de umidade das sementes das 10 cultivares após a etapa de embebição por seis horas à 41ºC variou de 27,9% a 30,3% (TABELA 1). Apesar das médias correspondentes aos graus de umidade terem se apresentado inferiores aos valores das médias determinados para a testemunha (16h/25ºC) as mesmas proporcionaram o desenvolvimento de coloração adequada das sementes, permitindo a leitura e a interpretação do teste de tetrazólio, para as cultivares testadas. A esse respeito, Costa & Marcos Filho (1994a) verificaram um bom desenvolvimento de coloração em sementes de duas cultivares, quando pré-condicionadas por períodos inferiores a 10 horas a 42ºC; Costa et al. (1997) também constataram que o pré-condicionamento por seis horas à 41ºC foi adequado para a realização do teste de tetrazólio. Esses autores identificaram que o período de quatro horas à 41ºC afetou o desenvolvimento de coloração das sementes para a leitura do vigor (TZ 1-3) e da viabilidade (TZ 1-5), sendo que parcelas expressivas das mesmas apresentaram coloração totalmente desuniforme em toda extensão do eixo embrionário, inclusive, muitas delas, com características de mosaico e apresentando uma depressão na região central dos cotilédones, ocorrendo também percentual elevado de sementes duras em algumas cultivares, as quais comprometem a leitura e a interpretação do teste. A razão do surgimento dessas características, pode ser atribuída ao tempo insuficiente de absorção de umidade ou mesmo à restrição proporcionada pelo tegumento à entrada de água, durante o período de pré-condicionamento, comforme demonstrou Veiga (1988). Vertucci & Leopold (1983, 1984) observaram que o grau de umidade das sementes abaixo de 24% restringe o início dos processos metabólicos e respiratórios, não permitindo a ativação enzimática, especialmente com relação ao grupo das desidrogenases, responsáveis pelo desenvolvimento da coloração no teste de tetrazólio. Destacaram ainda que a intensificação dos processos enzimáticos aumentam rapidamente quando o grau de umidade estiver na faixa de 24% a 32%. Baseado nos resultados obtidos com o desenvolvimento de coloração das sementes, nos períodos de 4 horas e 6 horas à temperatura de 41ºC, é razoável a hipótese de que a reação do sal de tetrazólio catalizada pelas enzimas desidrogenases ocorra em células vivas do embrião com o grau de umidade superior à 25%. Todavia, outros componentes das sementes também participam ativamente da velocidade de embebição das sementes, tendo conseqüência direta no desenvolvimento da coloração pelo tetrazólio, como, a composição química da semente, qualidade fisiológica e impermeabilidade de tegumento das mesmas. (Hsu et al., 1983 e McDonald et al., 1988).

 

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Nos resultados correspondentes ao vigor (TABELA 2), observou-se para todas as cultivares testadas que sementes pré-condicionadas pelo período de 6 horas à 41ºC tiveram médias estatisticamente semelhantes à testemunha (16h/25ºC). Contudo, o período de 4h/41°C de embebição não proporcionou condicionamento adequado às sementes, uma vez que o grau de umidade das mesmas ficou abaixo do ideal, isto é, 27% (Costa & Marcos Filho, 1994b), para o desenvolvimento da coloração apropriada pelo tetrazólio (TABELA 1), o que, em conseqüência, comprometeu seriamente as análises de vigor para o referido tratamento (TABELA 2). Resultados similares foram também relatados por Costa & Marcos Filho (1994a) e Costa et al. (1997).

 

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Quanto à viabilidade [(TZ 1-5)], os valores médios (TABELA 3) referentes ao período de pré-condicionamento de 6h/41ºC, não diferiram estatisticamente da testemunha (16h/25ºC), à exceção da cultivar OCEPAR 17. Para a referida cultivar, essa variação na proporção em que ocorreu (4,0%), embora estatisticamente significativa ao nível de 5,0% de probabilidade, pode ser considerada tolerável do ponto de vista prático. O baixo coeficiente de variação observado na análise de variância dos dados (3,35%) resultou numa diferença minima significativa de 2,8%, evidenciando que a diferença constatada de 4,0% está muito próxima desse valor. Além disso, erros amostrais do processo analítico podem ter contribuído para essa variação. Já, o tratamento 4h/25ºC propiciou, para todas as cultivares, valores de viabilidade estatisticamente inferiores aos obtidos na testemunha (16h/25ºC).

 

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Os resultados observados para os índices de sementes com sinais de deterioração por umidade (TABELA 4) revelaram elevados percentuais de sementes deterioradas para o tratamento com 4h/41ºC, quando comparados com os obtidos após 6h/41ºC e com a própria testemunha (16h/25ºC). Essa situação propiciou sérios problemas de interpretação de leitura do teste, devido às alterações morfológicas apresentadas pela maioria das sementes, afetando a leitura e a interpretação dos níveis de vigor e de viabilidade das sementes de todas cultivares estudadas. Ainda, observaram-se alterações substanciais no processo de coloração pelo tetrazólio, onde o tratamento com 4h/41ºC superestimou a ocorrência de sementes com sinais de deterioração por umidade, sendo que parte expressiva das sementes mostraram características de mosaico, fator este, extremamente prejudicial durante a leitura e a interpretação do teste. A razão desse fenômeno pode ser atribuída à absorção de água em quantidade insuficiente durante a etapa de pré-condicionamento, a ponto de não permitir o entumescimento adequado dos tecidos cotiledonares e embrionários das sementes, e conseqüentemente, dificultando o processo de coloração durante a execução do teste, condição essa fundamental para um desenvolvimento adequado de coloração das sementes, quando em contato com a solução de tetrazólio. Por outro lado, comparando-se os valores de sementes deterioradas obtidos para o tratamento de 6h/41ºC com os valores da testemunha (16h/25ºC), constatou-se que em 6 das 10 cultivares analisadas não ocorreram diferenças estatísticas entre si. Contudo, as cultivares EMBRAPA 4, OCEPAR 14, OCEPAR 17 e FT-Abyara indicaram maiores índices de sementes deterioradas com o período de 6h/41ºC, isto quando comparadas com a testemunha (16h/25ºC). Todavia, esses resultados não chegaram a comprometer as análises de vigor e de viabilidade, realizados pelo teste de tetrazólio, à exceção da cultivar OCEPAR 17. Esses resultados estão de acordo com os obtidos por Costa & Marcos Filho (1994b).

 

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Os resultados de danos mecânicos (TABELA 5) indicaram que o período de embebição de 6 h à 41ºC permitiu a identificação dos danos sem grandes problemas, após a coloração das sementes pelo tetrazólio, sendo que as médias obtidas não diferiram estatisticamente da testemunha, para oito das dez cultivares testadas. Resultados similares também foram relatados por Costa (1992), que, através de um estudo semelhante, detectou que tanto o pré-condicionamento a 4h/42ºC como a 6h/42ºC propiciaram uma caracterização precisa de injúria mecânica em cinco cultivares estudadas.

 

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Com relação aos danos de percevejos (TABELA 6), tanto para o período de 4h/41ºC como para o período de 6h/41ºC de pré-condicionamento, oito das dez cultivares testadas apresentaram resultados comparáveis à testemunha (16h/25ºC). Sementes das cultivares OCEPAR 13 e OCEPAR 16 apresentaram pequenas variações consideradas toleráveis. Esta constatação pode servir de subsídios tanto para técnicos como para produtores de sementes, para uma avaliação segura da infestação de percevejos de um campo de sementes no estádio de pré-colheita da soja, conforme também reportado por Costa et al. (1997).

 

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CONCLUSÕES

- é possível reduzir o período de pré-condicionamento das sementes no teste de tetrazólio;

- o emprego da metodologia alternativa de 6h/41ºC de embebição, possibilita a redução da etapa de pré-condicionamento, período que antecede a realização do teste de tetrazólio;

- o período de 4h/41ºC, afeta drasticamente o desenvolvimento de coloração pelo tetrazólio, não permitindo identificar claramente as classes de vigor (TZ 1-3) e de viabilidade (TZ 1-5) para todas as cultivares testadas, mas, pode ser utilizado na caracterização de lesões de percevejos.

 

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvi-mento Científico e Tecnológico - CNPq, pelo apoio financeiro. Manuscrito aprovado para publicação pelo Chefe Adjunto Técnico da Embrapa Soja nº 018/97.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recebido para publicação em 11.02.98
Aceito para publicação em 19.05.98

 

 

1Projeto desenvolvido com apoio do CNPq.