Caracterização de rizóbios (Bradyrhizobium japonicum) e produtividade da soja

Rhizobia Bradyrhizobium japonicum characterization and soybean productivity

CARACTERIZAÇÃO DE RIZÓBIOS (Bradyrhizobium japonicum) E PRODUTIVIDADE DA SOJA

S.C. LIMA^1,4;E.S. LOPES^2,5; E.G.M. LEMOS³

¹Pós-Graduanda do DCA-FEA/UNICAMP.

²Seção de Microbiologia do Solo-IAC, C.P. 28, CEP: 13020-902 - Campinas, SP.

³Depto. de Tecnologia-UNESP, C.P.354, CEP: 14870-000 - Jaboticabal, SP.

⁴Bolsista da FAPESP.

⁵Bolsista do CNPq.

RESUMO: Fez-se um estudo de campo sobre a competição e a dinâmica de ocupação de sítios de nodulação de estirpes de Bradyrhizobium japonicum naturalizadas ou inoculadas em sementes. O ensaio foi instalado em Latossolo Vermelho Escuro utilizando blocos ao acaso, com 8 repetições dos seguintes tratamentos: A) controle sem inoculante; B) controle sem inoculante, com adubação nitrogenada; C) inoculante com cerca de 10⁷ rizóbios/g (8g/kg de semente); D) inoculação com cerca de 10¹⁰ rizóbios/g (8g/kg de semente). Os inoculantes foram preparados com as estirpes recomendadas na ocasião, SMS - 314 (= SEMIA 587) e SMS - 463 (= SEMIA 5019 = 29W). A identificação das estirpes formadoras dos nódulos foi realizada em amostras coletadas aos 10, 42 e 70 dias após a germinação. Realizou-se também a colheita dos grãos para avaliação da produção e de N-total. A tipificação sorológica foi feita com antissoro preparado a partir de antígenos constituídos pelas seguintes estirpes de Bradyrhizobium japonicum: SEMIA 587, SEMIA 5019 e SEMIA 5052 (= USDA 6), utilizando-se da técnica "immunodot". A caracterização das estirpes dos nódulos revelou um pequeno aumento (6,2 a 8,7%), na ocorrência de nódulos formados pelas estirpes recomendadas, nas três épocas de amostragem. Houve expressiva participação da estirpe 5052 (= sorogrupo USDA 6) na formação dos nódulos. Verificou-se que as estirpes naturalizadas podem contribuir de forma diferente na formação dos nódulos durante o ciclo, dependendo da amostragem.

Descritores: soja, Bradyrhizobium japonicum, nodulação, Glycine max, bactéria

RHIZOBIA Bradyrhizobium japonicum CHARACTERIZATION AND SOYBEAN PRODUCTIVITY

ABSTRACT: A field study on the competion and on the dynamics of occupation of nodulation sites by naturalized and seed inoculated strains of Bradyrhizobium japonicum was conducted on a Dark Red Latosol. The experimental design consisted of randomized blocks, with eight replications of the following treatments: A) control without inoculation; B) control without inoculation, with nitrogen fertilizer; C) inoculation with about 10⁷ rhizobia/g (8g/kg of seed); D) inoculation with about 10¹⁰ rhizobia/g (8g/kg of seed). The inoculant was prepared with the strains SMS-314 (= SEMIA-587) and SMS-463 (=SEMIA-5019 = 29W), officially recommended for inoculant production. The identification of the strains which formed nodules was made in samples collected at 10, 42 and 70 days after seed germination. The grains were harvested to evaluate production and nitrogen content. Sorological typification was made with antiserum prepared from antigens constituted by B. japonicum strains SEMIA-587, SEMIA-5019 and SEMIA-5052 (=USDA-6), using the immunodot method. The characterization of the strains in nodules revealed a small increase (6,2 to 8,7%) in the occurrence of nodules formed by the recommended strains for the three sampling dates. There was an expressive participation of the strain 5052 (serogroup USDA-6) in the formation of the nodules. It was also observed that the naturalized strains may contribute differently to the formation of the nodules during the cycle, depending on the time of sampling.

Key Words: soybean, Bradyrhizobium japonicum, nodulation, Glycine max, bacteria

INTRODUÇÃO

A soja foi introduzida no Brasil no século passado, e sua produção comercial despontou na década de cinqüenta, no Rio Grande do Sul obtendo importante papel na economia do país, principalmente a partir da década de setenta (Gomes, 1990). Atualmente o Brasil é o segundo maior produtor mundial de soja. Dentre as contribuições da pesquisa para o adequado manejo de cultura da soja e do solo, destacam-se: seleção de estirpes eficientes de rizóbios, plantio direto, controle de ervas daninhas, insetos-praga e doenças (Kaster & Bonato, 1980).

No ano de 1992 foi cultivada uma área de 465.621 ha de soja no Estado de São Paulo (Anuário Estatístico do Brasil, 1993). Considerando a média de 6,4% de N nas sementes e a produtividade média de grãos de 2,1 t/ha, a extração de N naquela área corresponde à 62.579,5 t. Considerando um custo de U$ 800,00 por t de nitrogênio, pode-se calcular que a economia com a adubação nitrogenada no Estado de São Paulo é no mínimo da ordem de 50 milhões de dólares, sem considerar que a eficiência do aproveitamento do nitrogênio do adubo nitrogenado não ultrapassa a 50%.

Entre os fatores que podem limitar a fixação de nitrogênio e consequentemente a produtividade em Glycine max (L.) Merr. encontram-se a competição por sítios nodulares entre estirpes utilizadas nos inoculantes e os rizóbios do solo, quando estas são de menor eficiência. Condições de baixa fertilidade do solo e elevadas doses de nitrogênio combinado, (Grahan & Temple, 1984), o efeito da rizosfera, tensão da água, pH do solo, salinidade, temperatura, toxinas e predadores podem também afetar a nodulação e/ou a fixação do N₂ de leguminosas junto à vasta variedades de estirpes de Rhizobium (Kamicker & Brill, 1986).

A soja é uma leguminosa introduzida e uma das poucas espécies que se associa com Bradyrhizobium japonicum. Portanto é pouco provável a ocorrência natural dessa bactéria em nossos solos, havendo entretanto possibilidades de que algumas das estirpes introduzidas no solo, juntamente com as sementes ou através de inoculação artificial, sobrevivam e se "naturalizem".

Este trabalho teve como objetivo verificar a dinâmica da predominância de estirpes de Bradyrhizobium japonicum em nódulos formados espontaneamente em área previamente cultivada com soja, em função da época de amostragem e verificar "in situ" se as estirpes atualmente recomendadas competem eficientemente com a população naturalizada, promovendo aumentos na produtividade.

MATERIAIS E MÉTODOS

Planta: Soja [Glycine max (L.) Merr. cv "IAS-5"] fornecida pela Cooperativa Agrícola da Região de Orlândia (CAROL), SP, Brasil.

Área: Escolheu-se uma propriedade particular na qual se iria cultivar soja. A propriedade - Fazenda Invernada - situa-se no município de São Joaquim da Barra, SP. Nesta fazenda a soja é cultivada sob sistema rotação soja/cana-de-açúcar, sendo que a cana vinha sendo cultivada por 6 anos consecutivos, sem adubação química, aplicando-se apenas vinhaça, na base de 40.000L/ha/ano. O solo da área escolhida foi identificado como Latossolo Vermelho Escuro. As análises químicas estão indicadas no QUADRO 1.

Bactérias dos inoculantes: Estirpes de Bradyrhizobium japonicum SMS 314 (=SEMIA 587) e SMS 463 (=SEMIA 5019) obtidas da Seção de Microbiologia do Solo do Instituto Agronômico de Campinas, IAC, SP - Brasil.

Produção do inoculante: Preparou-se o inoculante com uma mistura das estirpes SMS 314 e SMS 463, que em 1991 eram as únicas recomendadas. As estirpes foram testadas quanto a pureza, sendo posteriormente cultivadas em meio líquido-YM (Vincent, 1970), sob agitação até final da fase exponencial. A contagem total de células, em cada inoculante, foi feita pelo método de diluição e inoculação de gotas em placa, conforme Vincent (1970). Posteriormente os inoculantes foram misturados em quantidades tais que permitissem concentrações iguais das duas estirpes na mistura. O inoculante a ser usado no tratamento D, continha cerca de 1,8 x 10¹⁰ rizóbios/g de turfa (10¹⁰), e o a ser usado no tratamento C, 9,8 x 10⁶ rizóbios/g de turfa (10⁷).

Instalação e condução do ensaio: O ensaio foi instalado em blocos ao acaso, com 8 repetições dos seguintes tratamentos:

A - sem inoculante

B - sem inoculante e com adubação nitrogenada (uréia: 60kg/ha)

C - inoculante com 10⁷ rizóbios/g.

D - inoculante com 10¹⁰ rizóbios/g.

Coletaram-se 2 plantas por parcela para avaliar número e peso de matéria seca de nódulos aos 10, 28, 42, 56, 70 e 85 dias da germinação. Para a caracterização das estirpes formadoras dos nódulos coletaram-se de 2 a 5 plantas, para obter-se 100 nódulos por parcela. Aos 113 dias do plantio realizou-se a coleta dos grãos. Colheram-se as plantas de duas linhas centrais de cada parcela (5m de cada). Fez-se também a análise de N-total nos grãos, pelo método Kjeldahl.

Análise sorológica: Para identificação das estirpes nos nódulos fizeram-se testes com nódulos intactos utilizando-se a técnica "immunodot" (Olsen & Rice, 1989).

Os nódulos foram previamente desinfestados com hipoclorito de sódio (1:3) e lavados com água estéril. Macerou-os em solução fisiológica (NaCl 0,85%), num volume que variou de 750 a 2000 mL dependendo do tamanho do nódulo.

Aplicou-se 1-5 mL da suspensão de nódulos sobre membranas de nitrocelulose (SIGMA - N - 2764). As membranas foram sêcas à temperatura ambiente e incubadas durante 15min em solução bloqueadora composta de leite em pó desnatado (5%) em tampão fosfato (PBS). Inativou-se a peroxidase endógena em solução de H₂O₂ por 10min. Lavou-se 3 vezes em solução bloqueadora durante 5min. As membranas foram então incubadas com o respectivo antissoro (antissoro SEMIA 587 e 5019 diluídos 1:3000 e SEMIA 5052 1:2000) diluído em solução bloqueadora durante 1h., sob agitação moderada e à temperatura ambiente. As membranas foram novamente lavadas 3 vezes em PBS durante 5min. e então incubadas por uma hora com o antissoro anti IgG de coelho, conjugado à peroxidase, diluído 1:3000 em solução bloqueadora, sob agitação e à temperatura ambiente. As membranas foram outra vez lavadas como anteriormente e incubadas em solução de revelação contendo 100mL de solução cloronaftol + 10 mL de H₂O₂ 30% + 10mL de Tris 50mM durante 5-10min.. A reação foi interrompida em PBS e as membranas foram secas à temperatura ambiente.

Antissoros: Utilizaram-se os antissoros de células inteiras contra SEMIA 587, 5019 e 5052. Os antissoros foram cedidos pelo Departamento de Tecnologia da UNESP/Jaboticabal - SP - Brasil.

As variáveis número e peso de matéria seca de nódulos foram analisadas estatisticamente. Os dados foram computados e analisados através do SISTEMA DE ANÁLISE ESTATÍSTICA (SANEST) com um nível de significância de 5%. Com o objetivo de se estudar o comportamento da nodulação em função do tempo, utilizou-se a regressão polinomial.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na análise de número de nódulos utilizou-se a transformação . Encontrou-se diferenças significativas entre as médias de tratamentos, em duas amostragens, aos 10 e aos 85 dias após a germinação (DAG), (TABELA 1). Na primeira amostragem o tratamento com adubação nitrogenada apresentou a menor média de número de nódulos, diferindo-se significativamente do tratamento sem inoculação e do com inóculo de 10⁷ rizóbios/g. Houve aumento no número de nódulos da soja até a amostragem dos 56 dias após germinação, quando a média, considerando os três tratamentos inoculados, foi de 50 nódulos por planta. A curva do peso da matéria seca dos nódulos foi diferente da do número de nódulos, onde se observaram incrementos até a última amostragem, aos 85 DAG (média de 268,1 mg/pl.), embora também não tenham sido detectadas diferenças significativas entre os tratamentos de inoculação (TABELA 1).

Ruschel & Reuszer (1973) encontraram diferenças significativas no número de nódulos por grama de planta, durante os diferentes estádios do desenvolvimento da soja.

O número e peso de matéria seca de nódulos, peso de matéria seca das folhas, acúmulo de N e produção de sementes dependem da cultivar. Varela & Agudelo (1986) estudaram a nodulação espontânea em quatro variedades de soja (ICA Línea 119, ICA Línea 121, ICA Línea 124 e uma variedade comercial ICA Túnia), na Colômbia, utilizando-se um solo com textura argilo-limosa, pH 6,5 e de alta fertilidade. Foi observado que o número de nódulos, no início da floração, nas variedades ICA L-121 e 119 foi maior; na ICA Túnia obteve-se o menor número. A variedade ICA L-121 produziu o maior peso de matéria seca de nódulos, apesar de ser a mais tardia em iniciar a floração. Arraràs et al. (1986), na Argentina, utilizando inoculante com as estirpes recomendadas, também encontraram diferenças altamente significativas entre as variedades e o número e peso dos nódulos, sendo que a nodulação foi alta nas variedades de soja "Coker Hampton 266A" e "Bragg". No Rio Grande do Sul, Kolling et al. (1986), utilizando-se de níveis diferentes de inóculo, em solo com população estabelecida, não encontraram diferenças entre os tratamentos ao avaliarem a nodulação 30 dias após a emergência, o que mostra que a população estabelecida compete eficientemente com a do inóculo na formação dos nódulos.

O peso de matéria seca e o número de nódulos de soja não são critérios satisfatórios para caracterização de estirpes eficientes (Lopes et al., 1976).

As médias de produção e do total de nitrogênio nos grãos estão apresentadas na TABELA 2. Para estas variáveis não encontraram-se diferenças significativas entre as médias dos tratamentos. A ausência de resposta à inoculação é normalmente observada e pode estar associada à presença de uma nodulação natural eficiente. A média de produção de grãos de soja do Estado de São Paulo , nesta safra (1991/92), foi de 1834 kg/ha, segundo Anuário Estatístico do Brasil - 1993 (IBGE), portanto verificou-se que a média deste experimento, no tratamento inoculado, foi de pelo menos 1242 kg/ha a mais que a média do Estado, mas não diferiu estatisticamente dos outros tratamentos.

Kolling et al. (1986) também não obtiveram resposta da soja à inoculação com diferentes níveis de inóculo de B. japonicum em solo que ficou em pousio durante três anos. As estirpes naturalizadas haviam sobrevivido e promoveram efetiva nodulação no tratamento sem inoculação. Neste caso também não se verificou resposta significativa da reinoculação na produção, e essa ausência foi atribuída à baixa ocorrência de nódulos formados pelas estirpes dos inoculantes, que não superaram as já estabelecidas no solo na competição pelos sítios de nodulação.

Na análise sorológica dos nódulos caracterizaram-se os nódulos coletados em 3 épocas de amostragem, de 3 tratamentos (controle, inóculo com 10⁷ rizóbios/g e 10¹⁰ rizóbios/g ).

A caracterização das estirpes dos nódulos das amostragens feitas aos 10, 42 e 70 dias após a germinação revelou que houve tendência para predominância das recomendadas, SEMIA 587 e 5019 (TABELA 3) nas três épocas de amostragem, tanto nos tratamentos inoculados como não inoculado. Observou-se também um ligeiro aumento (cerca de 8%) na predominância das estirpes recomendadas, devido à inoculação, nas três épocas de amostragem (Figura1). A estirpe SEMIA 5019 mostrou-se mais competitiva que a 587, principalmente nas duas últimas épocas de amostragem, quando a porcentagem de ocorrência dessa estirpe diminuiu consideravelmente. Convém notar que, as estirpes SEMIA 5019 e SEMIA 587 foram recentemente reclassificadas como da espécie Bradyrhizobium elkanii (Rumjanek et al., 1993). Uma característica comum destas estirpes é a de nodularem outras leguminosas tropicais, além da soja. Reações cruzadas de soros de Bradyrhizobium spp ("cowpea") com estas estirpes foram recentemente observadas (Lemos, 1994). Essas observações levaram a autora a sugerir que pode estar havendo uma superestimativa da competitivi-dade delas devido a possibilidade de reação dos seus soros com estirpes de Bradyrhizobium spp que eventualmente tenham nodulado a soja. Foi também observada uma elevada ocorrência das estirpes não identificadas com os três antissoros empregados, principalmente na primeira amostragem (cerca de 39%). A porcentagem de ocorrência das estirpes não identificadas diminuiu no final do ciclo em função do aumento das estirpes inoculadas (Figura 1) e principalmente da USDA-6 (=SEMIA 5052 = Bradyrhizobium japonicum ATCC 10324, do mesmo sorogrupo da SEMIA 509), também identificada, naturalizada em função de introduções anteriores, desde 1952 (Vargas et al., 1994). A expressiva participação do sorogrupo USDA-6 na formação dos nódulos e o aumento observado no final do ciclo sugerem a sobrevivência das estirpes de Bradyrhizobium japonicum (TABELA 3).

Figura 1 - Porcentagem de nódulos de soja (IAS-5) ocupados pelos sorogrupos I (SEMIA-5052); III (SEMIA-587); IV (SEMIA-5019) e Não Identificado, do tratamento D (inóculo com 10¹⁰ rizóbios/g. Caracterizados pela técnica "immunodot", nas 3 épocas de amostragem.

Como comentado anteriormente (TABELA 1) observou-se uma nodulação natural abundante e sobrevivência das estirpes de inoculações anteriores (Figura 2), sendo que os tratamentos de inoculação com as estirpes atualmente recomendadas contribuíram para um ligeiro aumento na ocupação dos nódulos por essas estirpes, (Figura 1). A estirpe SMS-463 (=SEMIA-5019 = 29W) mostrou ser mais competitiva que a SMS-314 (=SEMIA-587). Verificou-se também que as estirpes naturalizadas podem contribuir de forma diferente na formação dos nódulos durante o ciclo, dependendo da época de amostragem (Figura 2).

Figura 2
- Porcentagem de nódulos de soja (IAS-5) ocupados pelos sorogrupos I (SEMIA-5052); III (SEMIA-587); IV (SEMIA-5019) e Não Identificado, do tratamento A (controle). Caracterizados pela técnica "immunodot", nas 3 épocas de amostragem.

Também houve nódulos que reagiram com mais de um antissoro, sugerindo a presença de diferentes estirpes no mesmo nódulo, ou como já constataram Date & Decker (1965) que estirpes de um mesmo grupo de reatividade compartilham determinantes antigênicos comuns, justificando as reações cruzadas aqui obtidas. Há necessidade de se estudar também metodologias de inoculação que possam aumentar a ocupação nodular da estirpe de interesse.

CONCLUSÕES

- A nodulação promovida pelos rizóbios já estabelecidos no solo foi abundante, sendo que não foram constatadas diferenças expressivas devidas à inoculação;

- O número de nódulos da soja aumentou até os 56 dias após a germinação e a produção de matéria seca desses nódulos até 85 dias após a germinação;

- Houve cerca de 8% de aumento na ocupação nodular pelas estirpes dos inoculantes, sendo que a SEMIA 5019 (=29W) mostrou-se mais competitiva;

- A estirpe 587 mostrou-se menos competitiva que a estirpe 5052 (sorogrupo USDA 6), já estabelecida no solo, que passou a predominar no final do ciclo da soja.

Recebido para publicação em 08.09.97

Aceito para publicação em 14.07.98

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Maio 1999
• Data do Fascículo
  1998

Histórico

• Recebido
  08 Set 1997
• Aceito
  14 Jul 1998