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Scientia Agricola

On-line version ISSN 1678-992X

Sci. agric. vol.56 n.1 Piracicaba  1999

http://dx.doi.org/10.1590/S0103-90161999000100028 

IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS NO PROCESSO DE FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA EM USINA DO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL

 

Katia Teresinha Cabrini*; Claudio Rosa Gallo
Depto. de Agroindústria, Alimentos e Nutrição-ESALQ/USP, C.P. 9, CEP: 13.418-900 - Piracicaba, SP.
e-mail: crgallo@carpa.ciagri.usp.br

 

 

RESUMO: Com o objetivo de se obter um levantamento das espécies de leveduras presentes no processo de fermentação para a produção de álcool, procedeu-se a identificação de leveduras durante um semestre da safra 94/95 na Usina da Pedra no município de Serrana - SP, utilizando-se amostras de caldo primário, mosto e leite de leveduras coletadas mensalmente. A identificação das leveduras isoladas foi realizada de acordo com a taxonomia numérica proposta por Griffiths (1981), sendo que 72 leveduras, pertencentes a 5 gêneros foram identificadas. A espécie Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae) foi a levedura dominante na unidade industrial pesquisada e o gênero Saccharomyces, o de maior incidência.
Palavras-chave: leveduras, fermentação, álcool, identificação, contaminação

 

YEAST IDENTIFICATION IN ALCOHOLIC FERMENTATION PROCESS IN A SUGAR CANE INDUSTRY UNIT OF THE SÃO PAULO STATE, BRAZIL

ABSTRACT: The aim of this research was the evaluation of yeast species present in the fermentation process for alcohol production. Yeast identification was carried out during a semester in the cropping season of 94/95 in the Usina da Pedra at Serrana - SP . Samples of primary juice, must and yeast cream were monthly collected. The identification of isolated yeasts was carried out according to numerical taxonomy proposed by Griffiths (1981) and 72 yeast species, belonging to 5 genera, were identified. The Saccharomyces cerevisiae species: S. uvarum (S. cerevisiae) was the dominant yeast in the sugar cane industry unit studied, and the Saccharomyces genus, was the dominant one.
Key words: yeasts, fermentation, alcohol, identification, contamination

 

 

INTRODUÇÃO

Pode-se definir levedura contaminante como qualquer levedura presente no processo fermentativo, que não seja a levedura selecionada para a condução da produção de álcool.

Leveduras contaminantes podem sobrenumerar o fermento em poucos dias, já no início da safra, devido à alguns fatores como agressividade na competição por nutrientes, maior velocidade de multiplicação, pressão de seleção favorável e proporção inicial significativa. Estes fatores ainda são pouco conhecidos para casos específicos (Tavares, 1992).

Tais leveduras podem trazer sérios prejuízos ao processo fermentativo, como redução no rendimento, maior tempo de fermentação, problemas operacionais, etc. Contudo, as leveduras contaminantes podem, ao contrário dos efeitos prejudiciais citados anteriormente, apresentar bom desempenho fermentativo, podendo ser selecionadas para atuarem como as leveduras de processo numa safra posterior.

A presença de leveduras contaminantes na produção de álcool tem sido pouco estudada, estando as pesquisas concentradas, preferencialmente, em problemas relativos às contaminações bacterianas.

Leveduras dos gêneros Saccharomyces, Torula e Pichia foram isoladas de canas verdes por Bevan & Bond (1971), que também identificaram leveduras dos gêneros Rhodotorula, Candida e, novamente Torula, da superfície de canas com mais de 24 horas após a queima.

Neder (1957) também identificou leveduras dos gêneros Saccharomyces, Pichia e Candida, a partir de caldo de cana e de mosto em fermentação, sendo identificadas espécies como Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis, S. chevalieri, Candida krusei, C. guilliermondii, C. tropicalis, Pichia membranaefaciens, entre outras.

A análise de amostras de caldo bruto, caldo misto e água de embebição em usina de açúcar de cana, realizada por Lima et al. (1974), permitiu a identificação das espécies Candida diddensiae, C. fabianii, C. intermedia, C. santamariae, Cryptococcus kuetzingii, Hansenula polymorpha, Kloeckera corticis, Rhodotorula pallida, R. rubra, Saccharomyces uvarum, Torulopsis norvegica e Trichosporon cutaneum.

Oliveira & Pagnocca (1988) detectaram as leveduras Hansenula anomala, Candida famata, Saccharomyces kluyveri e S. cerevisiae, como contaminantes em uma unidade industrial a partir de amostras de fermento centrifugado, fermento tratado e mosto em fermentação.

Miniac (1989) cita a espécie Brettanomyces intermedius como contaminante em várias destilarias na França, com prejuízo ao processo fermentativo, levando, inevitavelmente à necessidade de renovação de todo o fermento em processo.

Em algumas unidades industriais produtoras de álcool, Amorim et al. (1989), também constataram problemas no processo fermentativo, decorrentes da contaminação pela levedura Candida krusei.

Entretanto, em trabalho realizado por Amorim et al. (1991), três leveduras contaminantes isoladas do mosto e do vinho de uma unidade industrial, não foram responsáveis pela redução do rendimento da fermentação alcoólica, sendo tal fato, comprovado através de ensaios fermentativos, comparando-se as leveduras contaminantes com uma levedura de processo.

A espécie Dekkera bruxellensis, apresentou-se como a levedura de maior incidência e relevância pelo poder competitivo e conseqüências adversas ao processo de produção de álcool em uma unidade industrial, segundo Silva (1994). Além desta espécie, outras leveduras foram ainda, identificadas pelo autor, sendo elas: Candida maltosa, C. mogii, Issatchenkia occidentalis (Candida sorbosa), Rhodotorula minuta/mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, S. chevalieri, S. uvarum, Schizosaccharomyces pombe e Torulaspora delbrueckii (Candida colliculosa).

Em trabalhos de Basso et al. (1993); Basso et al. (1994); Basso et al. (1995) e Basso et al. (1996), constatou-se, respectivamente, nas safras de 92/93, 93/94, 94/95 e 95/96, a predominância de leveduras contaminantes do gênero Saccharomyces em unidades produtoras de álcool.

Algumas espécies de leveduras contaminantes, detectadas por Oliveira et al. (1996), durante as safras de 91/92 a 95/96 em várias unidades industriais foram: Saccharomyces capensis, S. bayanus, Pichia ohmeri, Trichosporon brassicae, Torulaspora pretoriensis, Kluyveromyces vanudenii.

Este trabalho teve como objetivo identificar as leveduras presentes no processo de produção de álcool durante um semestre da safra 94/95 na Usina da Pedra, no município de Serrana - SP, utilizando-se amostras de caldo primário, mosto e leite de leveduras, a fim de se obter um levantamento da variedade de espécies de leveduras ao longo do processo fermentativo.

 

MATERIAL E MÉTODOS

A identificação de leveduras na Usina da Pedra foi realizada a partir de amostras de caldo primário, mosto e leite de leveduras, coletadas mensalmente durante um semestre da safra 94/95.

As amostras enviadas ao laboratório foram submetidas ao processo de liofilização (Kirsop, 1984) para conservação das culturas brutas de leveduras contidas nas amostras. Desta forma, tais culturas foram armazenadas temporariamente à temperatura ambiente até a realização dos processos de isolamento, purificação e identificação das leveduras.

As leveduras foram isoladas e purificadas em meio de cultivo YEPD (extrato de levedura, peptona e dextrose) e identificadas de acordo com a taxonomia numérica proposta por Griffiths (1981), a qual baseia-se principalmente em testes bioquímicos de assimilação e fermentação de fontes de carbono, atribuindo-lhes valores numéricos específicos dos quais são obtidos códigos numéricos de identificação. A TABELA 1 ilustra as características usadas na obtenção dos códigos numéricos para a identificação das leveduras.

 

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Além dos testes fornecidos pelo método, alguns outros foram ainda acrescentados, sendo eles: assimilação da trealose, L-arabinose, D-ribose, L-ramnose e fermentação da maltose, rafinose e melibiose, cujos resultados foram comparados com os manuais de identificação de leveduras: Barnett et al. (1983); Barnett et al. (1990) e Kreger-van Rij (1984).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos no presente trabalho encontram-se na Figura 1 que demonstra as leveduras identificadas na unidade industrial pesquisada e nas Figuras 2, 3 e 4 que demonstram, respectivamente, as porcentagens dos isolados identificados no caldo primário, mosto e leite de leveduras.

 

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Figura 1 - Leveduras identificadas na Usina da Pedra.

 

 

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Figura 2 - Porcentagens dos isolados identificados no caldo primário na Usina da Pedra.

 

 

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Figura 3 - Porcentagens dos isolados identificados no mosto na Usina da Pedra.

 

 

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Figura 4 - Porcentagens dos isolados identificados no leite de leveduras na Usina da Pedra.

 

A TABELA 2 contém as abreviações utilizadas para designar as espécies de leveduras citadas nas Figuras 1, 2, 3 e 4.

 

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As TABELAS 3, 4 e 5 demonstram, respectivamente, as leveduras presentes nas amostragens mensais de caldo primário, mosto e leite de leveduras na unidade industrial analisada. As leveduras indicadas entre parênteses correspondem à atualização das espécies, segundo Barnett et al. (1983), Barnett et al. (1990) e Kreger-van Rij (1984).

 

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Foi isolado um total de 78 culturas de leveduras, das quais 72 puderam ser identificadas através da metodologia utilizada, sendo identificadas 30 leveduras a partir de amostras do caldo primário, 14 a partir do mosto e 28 a partir do leite de leveduras.

Analisando a Figura 1, observa-se que os 72 isolados identificados pertenceram a 15 espécies, sendo elas: Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae), S. coreanus (S. cerevisiae), S. bayanus, S. chevalieri (S. cerevisiae), S. pretoriensis (Torulaspora pretoriensis), Candida entomophila, C. krusei: Torulopsis castellii (Candida castellii), C. membranaefaciens, C. rugosa, Torulopsis dattila (Kluyveromyces thermotolerans), T. haemulonii (Candida haemulonii), Pichia membranaefaciens, P. guilliermondii, P. ohmeri e Schizosaccharomyces pombe.

Observa-se, portanto, que muitas leveduras detectadas na presente pesquisa, foram também identificadas por outros autores, conforme demonstra a literatura.

A Figura 1 demonstra também, a predominância das leveduras Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae): 34,95%, Candida entomophila: 16,83%, Saccharomyces coreanus (S. cerevisiae) e S. bayanus: ambas com 11,1% em relação as demais leveduras detectadas na Usina da Pedra, destacando-se principalmente, a espécie Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae). Os gêneros de leveduras detectados nesta unidade industrial foram, Saccharomyces, Candida, Torulopsis, Pichia e Schizosaccharomyces, observando-se a predominância do gênero Saccharomyces, seguido do gênero Candida. Os demais gêneros detectados apresentaram-se com baixas freqüências de isolamento.

Há, portanto, concordância dos gêneros identificados na presente pesquisa com aqueles citados pela literatura existente sobre o assunto, sendo que os resultados relativos à predominância do gênero Saccharomyces, corroboram com aqueles obtidos por Basso et al. (1993); Basso et al. (1994); Basso et al. (1995) e Basso et al. (1996).

Das espécies que, segundo a metodologia utilizada, enquadraram-se no gênero Candida, o segundo gênero de maior detecção nesta unidade industrial, apenas a espécie Candida rugosa apresentou resultado de fermentação negativo para todas as fontes de carbono testadas, tendo as demais espécies deste gênero, fermentado pelo menos uma das fontes de carbono utilizadas. Tomando-se por base a glucose e a sacarose, açúcares de interesse direto na fermentação alcoólica e constantes na metodologia utilizada, verificou-se os seguintes perfis fermentativos para as espécies do gênero Candida: Candida entomophila: 66,67% fermentaram sacarose e 91,67% fermentaram glucose; Candida krusei: Torulopsis castellii (Candida castellii): 100% de fermentação para glucose e Candida membranaefaciens: 100% de fermentação para glucose e sacarose.

Vale ressaltar que na presente pesquisa as amostras não foram coletadas pensando-se em analisar a sobrevivência de leveduras ao longo do processo de fermentação alcoólica, ou seja, caldo primário, caldo após tratamento térmico, melaço, mosto, vinho final, água no pé-de-cuba e leite de leveduras, tornando-se difícil e muito arriscado tecer comentários a este respeito, razão pela qual somente serão discutidos aspectos de freqüência e persistência ao longo da safra, das espécies identificadas em três etapas do processo de produção de álcool, ou seja, no caldo primário, no mosto e no leite de leveduras.

Assim, como pode ser observado pela análise da Figura 2, que demonstra as porcentagens dos isolados identificados no caldo primário na Usina da Pedra, a espécie Candida entomophila apresentou-se como a levedura de maior incidência, com freqüência de 30%, seguida pelas espécies: Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae), 16,6% e S. coreanus (S. cerevisiae), 13,4%. As demais leveduras detectadas neste ponto apresentaram freqüências inferiores, como demonstra a Figura 2.

Já no mosto, predominou a espécie Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae), com uma porcentagem de 42,86, seguida da levedura S. coreanus (S. cerevisiae) com freqüência de 28,58%. Saccharomyces chevalieri (S. cerevisiae) e Schizosaccharomyces pombe, também detectadas no mosto, apresentaram freqüências iguais, ou seja, 14,28% (Figura 3).

Também, como pode ser observado através da Figura 4, a espécie Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae) apresentou-se como dominante no leite de leveduras, com freqüência de 50%, seguida pelas espécies: S. bayanus, 21,44%, S. pretoriensis (Torulaspora pretoriensis) e Candida entomophila, ambas com 10,71% cada. Saccharomyces chevalieri (S. cerevisiae) e Pichia ohmeri, foram identificadas com freqüências bastante reduzidas, ou seja, 3,57% cada.

É importante mencionar que a Usina da Pedra utilizou uma mistura de leveduras para iniciar o processo de produção de álcool durante a safra de 94/95, mistura esta, composta pelas espécies Saccharomyces cerevisiae e S. bayanus. Assim, como pode ser observado através da Figura 4, Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae) e S. bayanus foram detectadas com elevadas freqüências no leite de leveduras desta unidade industrial, podendo tal fato, relacionar-se às leveduras do processo.

Pela análise global das porcentagens dos isolados nestes três pontos amostrados (Figuras 2, 3 e 4), observa-se a elevada freqüência da espécie Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae), presente nestes três pontos e dominante em dois deles. Saccharomyces coreanus (S. cerevisiae) com freqüência relativamente elevada no caldo primário, teve sua porcentagem dobrada no mosto e não foi detectada no leite de leveduras. A levedura Saccharomyces bayanus, apesar da baixa freqüência no caldo primário e ausência no mosto, apresentou freqüência bastante significativa no leite de leveduras, o contrário acontecendo com a espécie Candida entomophila, com elevada freqüência no caldo primário, reduzindo significativamente este valor no leite de leveduras. Saccharomyces chevalieri (S. cerevisiae), com freqüência relativamente elevada no mosto, apresentou-se com valor bastante reduzido no leite de leveduras. Vale ressaltar ainda, as freqüências significativas das espécies: Schizosaccharomyces pombe, esta presente somente no mosto e Saccharomyces pretoriensis (Torulaspora pretoriensis), presente apenas no leite de leveduras.

A análise global destes três pontos amostrados (caldo primário, mosto e leite de leveduras) na Usina da Pedra, revela ainda, uma maior diversidade de leveduras detectada no caldo primário em relação ao mosto e ao leite de leveduras desta unidade industrial (Figuras 2, 3 e 4), o que pode ser explicado pelas condições drásticas do processo de produção de álcool em relação a tratamento térmico do caldo, teor alcoólico na dorna de fermentação, acidez no pé-de-cuba, metabólitos de outros contaminantes, etc., que certamente são responsáveis pela destruição e/ou inativação de muitas leveduras que chegam com a matéria-prima na indústria.

Analisando ainda as Figuras 2, 3 e 4, fica fácil observar os gêneros de leveduras presentes em cada ponto amostrado na Usina da Pedra. Assim, verifica-se no caldo primário (Figura 2), a presença dos seguintes gêneros: Saccharomyces, Candida, Torulopsis e Pichia. Já, no mosto (Figura 3), apenas os gêneros Saccharomyces e Schizosaccharomyces estiveram presentes, enquanto que no leite de leveduras (Figura 4) detectou-se os gêneros Saccharomyces, Candida e Pichia.

Observa-se, portanto, a presença do gênero Saccharomyces nos três pontos amostrados, enquanto os gêneros Candida e Pichia foram detectados em dois pontos, ou seja, no caldo primário e no leite de leveduras. Já, o gênero Torulopsis apareceu exclusivamente no caldo primário e o gênero Schizosaccharomyces, exclusivamente no mosto.

Analisando as leveduras presentes nas amostragens mensais de caldo primário, observa-se através da TABELA 3, que a espécie Candida entomophila foi detectada em todas as amostragens mensais, indicando, portanto, sua constante introdução no processo, provavelmente com a chegada da cana-de-açúcar à indústria e/ou através da água de lavagem da cana. Também, a espécie Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae) foi detectada na maior parte das amostragens mensais de caldo primário, estando ausente apenas nas 1ª e 4ª amostragens mensais, correspondendo, respectivamente, aos meses de maio e agosto. Destaque ainda, pode ser dado à levedura Saccharomyces coreanus (S. cerevisiae) a qual foi detectada em três das seis amostragens mensais de caldo primário realizadas nesta unidade industrial, amostragens estas, correspondendo aos meses de junho, julho e setembro. Nota-se também, pela análise da TABELA 3, que as 2ª e 3ª amostragens mensais (meses de junho e julho, respectivamente) apresentaram praticamente as mesmas espécies de leveduras, fato também observado entre as duas últimas amostragens mensais de caldo primário, correspondendo aos meses de setembro e outubro, respectivamente. Particularmente, as leveduras detectadas nestas duas últimas amostragens mensais também estiveram presentes nas 2ª e 3ª amostragens mensais de caldo primário.

Nas amostragens mensais de mosto (TABELA 4), destaca-se a presença da espécie Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae) detectada nas três primeiras amostragens mensais, correspondendo aos meses de maio, junho e julho, indicando a persistência de uma provável recontaminação do mosto, possíveis falhas no tratamento térmico do caldo em processo ou resistência térmica das leveduras. A levedura Schizosaccharomyces pombe, detectada nas duas últimas amostragens mensais de mosto, respectivamente nos meses de setembro e outubro, foi a única espécie presente nestas amostragens. Nota-se ainda, que as espécies de leveduras detectadas nas 1ª e 2ª amostragens mensais de mosto (respectivamente meses de maio e junho), estiveram presentes na 3ª amostragem, correspondente ao mês de julho, tornando esta 3ª amostragem bastante similar em relação às duas primeiras.

Não houve detecção de leveduras a partir da amostra de mosto referente ao mês de agosto (TABELA 4), devido ao não crescimento celular durante o cultivo das culturas brutas de leveduras a partir de tal amostra. Um pré-enriquecimento da amostra de mosto, inoculando-se 1 mL da amostra em 5 mL de caldo YEPD (extrato de levedura, peptona e dextrose) esterilizado, foi realizado na tentativa de se obter a recuperação de leveduras, não havendo, contudo, nenhum crescimento.

Como pode ser observado através da TABELA 5, a levedura Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae) foi também a levedura de maior detecção ao longo das amostragens mensais de leite de leveduras na Usina da Pedra, estando ausente apenas na 2ª amostragem mensal (mês de junho). A análise da TABELA 5 indica ainda, que as leveduras detectadas na 2ª amostragem mensal (mês de junho), também estiveram presentes na 1ª amostragem (mês de maio). A mesma espécie de levedura foi detectada nas 3ª e 5ª amostragens mensais de leite de leveduras (meses de julho e setembro, respectivamente), sendo a única espécie presente nestas amostragens. Finalmente as 4ª e 6ª amostragens mensais (meses de agosto e outubro, respectivamente), apresentaram praticamente as mesmas espécies de leveduras.

 

CONCLUSÕES

Maior incidência da espécie Saccharomyces cerevisiae: S. uvarum (S. cerevisiae) na unidade industrial pesquisada; predominância do gênero Saccharomyces e destaque para o gênero Candida, corroborando com dados da literatura que demonstram tais gêneros como contaminantes freqüêntes do processo fermentativo e, finalmente, eficiência da metodologia utilizada, uma vez que, das 78 culturas isoladas, 72 puderam ser identificadas, correspondendo a uma porcentagem de 92,3.

 

AGRADECIMENTO

Nossos agradecimentos à Usina da Pedra pelas amostras enviadas.

 

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Recebido para publicação em 20.10.97
Aceito para publicação em 19.10.98

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