ACÚMULO DE CÁDMIO POR Saccharomyces cerevisiae EM CALDO DE CANA-DE-AÇÚCAR CONTAMINADO COM ACETATO DE CÁDMIO

ACCUMULATION OF CADMIUM BY Saccharomyces cerevisiae IN SUGAR-CANE MUST CONTAMINATED WITH CADMIUM ACETATE

ACÚMULO DE CÁDMIO POR Saccharomyces cerevisiae EM CALDO DE CANA-DE-AÇÚCAR CONTAMINADO COM ACETATO DE CÁDMIO¹

Samuel Mariano-da-Silva²; Luíz Gonzaga do Prado-Filho^3*

²Pós-Graduando do Depto. de Agroindústria, Alimentos e Nutrição - ESALQ/USP.

³Depto. de Agroindústria, Alimentos e Nutrição - ESALQ/USP, C.P. 09 - CEP:13.418-900 - Piracicaba, SP.

*e-mail: [e-mail]

RESUMO: O presente trabalho visou estudar o acúmulo de cádmio (Cd) por Saccharomyces cerevisiae, fermentando mosto de caldo de cana-de-açúcar com contaminações controladas, em níveis sub-tóxicos do citado metal. As condições de fermentação foram similares às reinantes na produção industrial de etanol. O mosto, não esterelizado, continha 12% de açúcares redutores totais (ART) e pH 4,5. Para a contaminação controlada empregou-se acetato de cádmio em quatro níveis de contaminações (0,5; 1,0; 2,0 e 5,0 mg Cd kg^-1 mosto). A inoculação do mosto foi executada com fermento de panificação (10% p/p). Após a fermentação (4 horas) foram determinados, porcentagem de fermento no vinho centrifugado e teor alcoólico do mesmo. Na levedura separada foram determinados peso úmido, matéria seca, proteína bruta e teores de cádmio por espectrofotometria de absorção atômica. Em todos os níveis de contaminação estudados houve acúmulo de Cd pela levedura.

Palavras-chave:Saccharomyces cerevisiae, caldo de cana, metal pesado, cádmio

ACCUMULATION OF CADMIUM BY Saccharomyces cerevisiae IN SUGAR-CANE MUST CONTAMINATED WITH CADMIUM ACETATE

ABSTRACT: The aim of this paper was to study accumulation of cadmium (Cd) by Saccharomyces cerevisiae fermenting sugar-cane must, with sub-toxic additions of cadmium. Fermentation conditions were the same as those used in industrial production of alcohol, using non-sterilized must at pH 4.5 containing 12% total reducing sugar (w/w). Using cadmium acetate, four levels of contamination were applied, as follows: 0.5; 1.0; 2.0 and 5.0 mg Cd kg^-1 must. The must was inoculated with baker's yeast (10% w/w). After 4 hours of fermentation, the wine was centrifuged and alcohol content and percent of yeast in the wine were determined. The separated yeast was analyzed for wet weight, solid and crude protein contents. Cadmium content was determined by atomic absorption spectrophotometry. Accumulation of cadmium by the yeast was shown at all levels of contamination.

Key words: Saccharomyces cerevisiae, heavy metal, cadmium acetate, must of sugar-cane

INTRODUÇÃO

O homem, desde os tempos mais remotos, tem tido contato com os metais pesados, que se encontram naturalmente no solo, na água e que, provavelmente provocaram os primeiros envenenamentos. Os metais utilizados nos utensílios domésticos, tubulações de água entre outros, aumentaram os riscos de intoxicação (Miranda, 1993).

O advento da era industrial e a mineração em alta escala, possibilitaram o aparecimento de enfermidades relacionadas com os diversos metais tóxicos (Gerhardsson & Skerfving, 1996; Miranda, 1993).

O problema da contaminação do meio ambiente por estes metais, alcança hoje dimenções mundiais, sendo observado tanto em países desenvolvidos como naqueles subdesenvolvidos. A ausência de controle dos rejeitos contaminados por metais pesados, alterou o solo, a água e o ar, trazendo como consequência a contaminação dos sistemas aquáticos, continentais e marinhos.

Estudos recentes têm detectado a toxidade do cádmio (Cd), que juntamente com o chumbo (Pb) e o mercúrio (Hg) são os elementos que têm concentrado a atenção dos pesquisadores devido a toxidez e a recente penetração nos ecossistemas, como resultado do desenvolvimento tecnológico (Babich & Stotzky, 1983).

O cádmio é o elemento número 48 da tabela periódica, com um peso atômico de 112,4 (Varma, 1986). É medianamente denso (8,6 g m^-3), branco prateado, sendo um metal maleável com ponto de fusão 320,9ºC e ebulição 765ºC (Adriano, 1986; Reilly, 1991). Embora o cádmio tenha sido descrito como um elemento relativamente raro (Valle & Ulmer, 1972; Wood, 1974), posteriormente, foi constatado que o mesmo se encontra presente no ambiente em baixos níveis (Varma, 1986). Nos dias atuais, a concentração de cádmio na crosta terrestre varia entre 0,15 e 0,20 mg kg^-1, sendo o 67º metal em abundância (Mattiazzo-Prezotto, 1994).

A produção anual de cádmio está ao redor de 20x10³ toneladas (Volesck, 1990a), devendo-se o uso industrial ao seu baixo ponto de fusão (320,9ºC).

Quando introduzido no organismo via oral, o cádmio é pouco absorvido, sendo que 95% é eliminado (Gerhardsson & Skerfving, 1996). Porém, o restante é acumulado nos rins e figado, onde foi detectado que sua meia vida biológica é de 10 anos (Tavares & Carvalho, 1992).

Este risco em potencial sucitou pesquisas na área de alimentos, uma vez que este contaminante tem caráter cumulativo na cadeia biológica da qual o homem faz parte (Miranda, 1993). Como resultado do fenômeno de bioacumulação, as quantidades subtóxicas presentes no meio ambiente podem atingir níveis de risco nos elos finais da cadeia trófica (Volesck, 1990a).

É bem conhecido que microrganismos possuem capacidade de acumular cádmio, sendo que Saccharomyces cerevisiae não é exceção (Brady & Duncan, 1994; Miyada, 1987; Volesky, 1990b; Volesky & May-Phillips, 1995).

Quando as matérias primas para fermentação são oriundas de solos ácidos tratados com adubos fosfatados, ou com lodo de esgoto, podem conter quantidades apreciáveis de cádmio, transportando este metal para o processo fermentativo (Babich & Stotzky, 1983).

O processo de fermentação normalmente utilizado no Brasil é o chamado Melle-Boinot, no qual as células de levedura recuperadas são recirculadas no processo, mantendo elevada a concentração celular, e obtendo-se, assim, um aumento do rendimento alcoólico, devido o menor consumo de açúcar para multiplicação e crescimento celular (Lopes, 1989). Entretando, várias usinas e destilarias desviam do processo parte do leite de levedura (10 a 20%), não comprometendo a produção de etanol (Lima, 1983).

A levedura que cresce em meio com concentrações sub-tóxicas aceitáveis de qualquer metal poderá apresentar, devido à capacidade de bioacumulação, maiores níveis que aqueles presentes no meio de crescimento (Volesky, 1990b; Volesky & May-Phillips, 1995), podendo atingir teores não admissíveis pela legislação vigente, o que a invalidaria como ingrediente de ração e como suplemento proteico humano (Domingos, 1996).

O presente trabalho visou o estudo do acúmulo de cádmio (Cd) por S. cerevisiae, fermentando mosto de caldo-de-cana, com contaminações controladas em níveis sub-tóxicos do metal.

MATERIAL E MÉTODOS

O mosto, não esteralizado, foi preparado uma única vez, em volume de 10,0 litros, suficiente para realizar toda a pesquisa. A cana foi moída, extraindo-se o caldo, o qual após a homogenização manual foi subdividido em porções de 2 litros, sendo então armazenado em frascos e estocado a -20ºC ± 1, até o momento do uso, quando foi descongelado. Este foi então diluído, apresentando como características finais 12% ART (Amorim, 1982), e pH 4,5. Foram acrescentados, como nutrientes, 300 mg nitrogênio [(NH₄)₂SO₄], 150 mg fósforo (K₂HPO₄) e 50 mg magnésio (MgCl₂.6H₂O) por quilograma de mosto. O pH foi ajustado a 4,5 com ácido sulfúrico. Após a homogenização manual, o mesmo foi dividido em porções de 300 g em erlenmeyers de 500 mL, recebendo cada uma quantidades tais de acetato de cádmio (CdC₄H₆O₄.2H₂ O), que resultavam nas concentrações de 0,0; 0,5; 1,0; 2,0 e 5,0 mg de Cd kg^-1 de mosto. As porções sem contaminação foram utilizadas como testemunha. Acrescentou-se então 10% p/p de fermento de panificação, marca Fleischmann, adquirido no comércio, de uma única partida, na forma de 2 pacotes de 500g, os quais foram homogenizados, através da quebra dos blocos e, estocados em geladeira à 7ºC ± 1 por dois dias, até o momento do uso, quando era determinada a viabilidade celular (Moraes & Alves, 1986). Todas as fermentações foram conduzidas em estufa incubadora B.O.D. NT705 à 30ºC ± 1, por 4 horas, sendo o término das mesmas confirmado por 3 medidas de Brix coincidentes, feitas a cada quinze minutos e, pelo término da formação da espuma. Ao final das fermentações retirou-se alíquotas de 5,0 mL para controle da viabilidade celular (Moraes & Alves, 1986). Em seguida, o vinho foi centrifugado a 1.500 G, e o peso úmido total da levedura recuperada determinado para cada ensaio, quantificando-se no vinho o etanol por cromatografia gasosa (Araújo, 1995). Após a secagem da levedura (Silva, 1990a), 1,25g da mesma foi submetida a digestão sulfo-nitro-perclórica (H₂SO₄:HNO₃:HClO ₄, na proporção de 2:5:3), segundo a metodologia proposta por Varma (1986). As amostras de biomassa mineralizadas foram então diluídas a 25mL e o cádmio presente quantificado por espectrofotometria de absorção atômica (espectrofotômetro VARIAN-AA 175). Os teores de cádmio foram expressos em mg kg^-1 de levedura bruta seca. O nitrogênio total, na biomassa seca, foi determinado segundo Silva (1990b).

O experimento foi conduzido segundo o delineamento estatistico de "blocos casualizados", constando de 5 tratamentos com 3 repetições (Gomes, 1990), e os resultados analisados pelo programa SANEST (Zonta & Machado, 1992).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em todos os níveis de contaminação estudados houve acúmulo estatisticamente significante de cádmio, a nível de 99% de confiança, como mostra a TABELA 1. Os teores do metal na levedura bruta, mostram uma alta correlação (r = 0,9537) com aqueles adicionados aos mostos (Figura 1), sendo devidos à biosorção e/ou bioacumulação, não sendo possível, nas condições estudadas, diferenciar quantitativamente a contribuição de cada um destes mecanismos.

Figura 1
- Regressão linear das concentrações de c ádmio adsorvidas pela levedura durante o processo de fermentação, por 4h a 30º C em mosto de caldo de cana.

Não foram detectadas diferenças estatisticamente siguinificantes entre os tratamentos e a testemunha, no que se refere ao etanol presente no vinho centrifugado, cuja média foi de 6,48% (v/v), viabilidade celular, cuja média foi 91,55% de células vivas e peso seco da levedura bruta recuperada, cuja média foi 25,24%.

Gutierrez et al. (1991), concluiram que os efeitos do níquel sobre S. cerevisiae durante a fermentação alcoólica parecem ser devidos à inibição do processo de transporte de açúcar para dentro da célula de levedura, devido a complexação de grupos fosfato da membrana por níquel. Este mecanismo poderia ser facilmente aplicado ao cádmio, devido às semelhanças entre este e o níquel, o que esplicaria mudanças nas atividades metabólicas da levedura, com reflexos nos parametros supracitados.

Contudo, o presente estudo não inclui o reaproveitamento das leveduras em fermentações consecutivas, não ficando excluída a possibilidade de, com numerosas reciclagens do fermento, aparecerem sintomas de toxidade crônica, com reflexos na viabilidade celular, peso seco da levedura bruta recuperada e produção de etanol.

Entre os teores de proteína bruta mostrados na TABELA 2, foi detectada diferença significante entre a levedura oriunda do mosto contaminado com concentração de cádmio de 5,0 mg kg^-1 de mosto e os demais tratamentos (0,0; 0,5; 1,0 e 2,0) segundo o teste de Tukey a 1% de significância. Mesmo não se tendo detectada diferença estatistica entre a levedura oriunda dos demais níveis de contaminação, pode-se observar um aumento nas porcentagens de proteína em relação aos teores de cádmio no meio.

Como pode-se observar na Figura 2, houve uma alta correlação (r = 0,9002) entre a concentração de cádmio pelas leveduras e os teores de proteína bruta das mesmas.

Figura 2
- Correlação polinomial das concentrações de cádmio adsorvidas pela levedura e Proteína bruta da levedura recuperada após a fermentação.

Estes resultados mostram uma relação crescente, entre os níveis de cádmio na célula de levedura e a produção de proteína pela levedura, ou seja, pelo menos para os nívies estudados, quanto mais cádmio a levedura acumula, maior seu teor proteico.

Isto pode ser reflexo do bloqueio de vias metabólicas, favorecendo a permanência de produtos nitrogenados dentro da célula, fazendo assim que as mesmas fujam da normalidade metabólica em uma determinada condição, e passem a acumular produtos nitrogenados (Domingos, 1996).

Por outro lado, o cádmio é acumulado pela levedura no citossol, ligado a metaloproteinas (metalotionina), que tem grande afinidade pelo metal (Brady & Duncan, 1994; Macaskie & Dean, 1990; Volesky, 1990b). A produção de metalotioninas, ou de proteínas semelhantes a estas, é induzida por cádmio, sendo um dos mecanismos de destoxificação (Ecker et al., 1986; Macaskie & Dean, 1990).

CONCLUSÕES

Saccharomyces cerevisiae concentra cádmio durante a fermentação de mosto de caldo de cana-de-açúcar, com contaminações sub-tóxicas de acetato de cádmio.

Na maior dose de contaminação empregada no presente estudo, houve aumento estatisticamente significante no teor de proteína bruta nas células recuperadas com relação aos demais tratamentos.

Nas dosagens utilizadas e, sem a reciclagem da levedura, não foram detectados efeitos tóxicos aparentes, não havendo diferenças entre os tratamentos no que se refere à produção de etanol, viabilidade celular, peso úmido da levedura recuperada, após as fermentações.

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Recebido para publicação em 30.01.98

Aceito para publicação em 17.08.98

¹

Trabalho apresentado no 5º Simpósio de Iniciação Científica da USP, Piracicaba, 1997.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Jul 1999
• Data do Fascículo
  1999

Histórico

• Aceito
  17 Ago 1998
• Recebido
  30 Jan 1998