Efeitos do estádio de desenvolvimento da antera e da radiação gama na formação de calos derivados de anteras de tomate

Anther development stage and gamma radiation effects on tomato anther-derived callus formation

Ana Christina R. Brasileiro¹; Lilia Willadino²*; Marcelo Guerra³; Waldeciro Colaço⁴; Isabelle Meunier⁵; Terezinha R. Camara⁶

¹Pós-Graduanda do Depto. de Biologia - Lab. de Cultura de Tecidos Vegetais - UFRPE.

²Depto. de Biologia - Lab. de Cultura de Tecidos Vegetais - UFRPE, R. Dom Manoel de Medeiros, s/n, CEP: 52171-950 - Recife, PE.

³Depto. de Botânica - Lab. de Citogenética Vegetal - UFPE, Av. Prof. Luiz Freire, 1000 - CEP: 50670-420 - Recife, PE.

⁴Depto. de Energia Nuclear - Lab. de Radioagronomia - UFPE.

⁵Depto. de Engenharia Florestal - UFRPE.

⁶Depto. de Química - Lab. de Cultura de Tecidos Vegetais - UFRPE.

*e-mail: [e-mail]

RESUMO: Este trabalho foi conduzido visando: (I) determinar a influência do estádio de desenvolvimento de anteras de tomate sobre a formação de calos e (II) analisar o efeito da radiação gama no cultivo in vitro de anteras. No primeiro experimento, anteras de híbridos de tomate IPA 5 x Rotam 4 (F₁) foram cultivadas em três meios nutritivos. Apesar da formação de calos ter sido induzida em todos os estádios de desenvolvimento, variando de prófase I à micrósporo mononucleado, a freqüência de calos produzidos decresceu com o avanço do estádio de desenvolvimento e se apresentou de forma semelhante nos meios testados. Anteras contendo meiócitos em estádio de prófase I mostraram maior freqüência de formação de calos. Tanto o comprimento da antera quanto o do botão floral apresentaram correlação significativa com o estádio de desenvolvimento. No segundo experimento, sementes e botões florais dos híbridos IPA 5 x Rotam 4 (F₂), IPA 6 x Rotam 4 (F₂) e IPA 8 x 217.1 (F₂) foram submetidos à radiação gama e suas anteras foram cultivadas em dois meios descritos por Gresshoff & Doy (1972), contendo 2,0 mg L^-1 de ANA + 5,0 mg L^-1 de cinetina e 2,0 mg L^-1 de ANA + 1,0 mg L^-1 de cinetina. Não foram constatadas diferenças significativas, no que se refere à formação de calos, para os genótipos e doses estudadas - 200 Gy, para sementes e 20 Gy, para botões florais.

Palavras-chave: Lycopersicon esculentum, cultura de anteras, raios gama, tomate

Anther development stage and gamma radiation effects on tomato anther-derived callus formation

ABSTRACT: Two experiments were carried (I) to determine tomato anther development stage influence on callus production; and (II) to investigate gamma radiation effects on anther culture. In the first experiment, anthers of a tomato hybrid (IPA 5 x Rotam 4 - F₁) were grown on three media. Although calli were induced at all stages of anther development, varying from prophase I to mononucleate microspore, callus frequency decreased as anther development progressed and calli induction were not significantly affected by all media tested. Anthers containing prophase I meiocytes produced the highest calli frequency. Anther and flower bud length both were significantly correlated with anther development stage. In the second experiment, seeds and floral buds of tomato hybrids IPA 5 x Rotam 4 (F₂), IPA 6 x Rotam 4 (F₂) and IPA 8 x 217.1 (F₂) were submitted to gamma-ray and anthers were plated on two media described by Gresshoff & Doy (1972) supplemented with 2.0 mg L^-1 NAA + 5.0 mg L^-1 KIN and 2.0 mg L^-1 NAA + 1.0 mg L^-1 KIN. No significant differences for genotype and dosage tested were found for calli formation.

Key words: Lycopersicon esculentum, anther culture, gamma-ray, tomato

INTRODUÇÃO

A indução de plantas haplóides ou duplo-haplóides a partir da cultura de anteras, ou androgênese, oferece ao melhoramento convencional a possibilidade de obter linhas puras, derivadas de grãos de pólen oriundos de plantas da geração F₁ (Clapham, 1971) ou F₂. A utilização dessa técnica em programas de melhoramento genético é uma realidade para diversas culturas (Yin et al., 1976; Research Group of Haploid Breeding, 1981; Wenzel & Uhrig, 1981) embora, para o tomate, ainda não esteja otimizada.

Plantas haplóides de tomate foram obtidas por Gresshoff & Doy (1972). Entretanto, elas eram morfologicamente anômalas e não apresentavam formação de órgãos reprodutivos. Posteriormente, Ziv et al. (1982), utilizando anteras oriundas do cruzamento entre o mutante ms 10³⁵ e um genótipo homozigoto para um marcador morfológico, cultivadas em sistema descrito por Zamir et al. (1980), obtiveram plantas duplo-haplóides de tomate. Contudo, a obtenção de plantas provenientes de micrósporos de tomate permanece restrita à utilização deste mutante macho estéril.

A resposta androgenética pode ser influenciada por diversos fatores, destacando-se, dentre eles, o estádio de desenvolvimento do micrósporo (Dao & Shamina, 1978; Gulshan et al., 1981; Summers et al., 1992). Em tomate, há controvérsia quanto à indicação do estádio de desenvolvimento da antera mais adequado para a produção de calos. Dao & Shamina (1978), observaram formação de calos em todos os estádios da microsporogênese, embora micrósporos mononucleados e pólens maduros tenham sido os mais favoráveis para a indução da embriogênese. Alguns pesquisadores observaram maior formação de calos nos estádios iniciais da meiose (Gresshoff & Doy, 1972; Summers et al., 1992). Por outro lado, tétrades (Zamir et al., 1980) ou micrósporos mononucleados (Gulshan et al., 1981; Him Him, 1987) foram considerados, por outros autores, como os melhores para a proliferação de calos.

A indução de mutação no cultivo in vitro, por meio de agentes químicos ou físicos, tem sido utilizada em diversas espécies (Bulk et al., 1990; Novak et al., 1990; Al-Safadi & Simon, 1996; Predieri et al., 1997; Bhagwat & Duncan, 1998). Esta associação entre o uso de técnicas in vitro e de mutações induzidas pode acelerar programas de melhoramento, desde a geração de variabilidade, passando pela seleção, até a multiplicação de genótipos desejáveis (Maluszynski et al., 1995). Resultados favoráveis foram observados em anteras de Brassica napus cv Topas, com a produção de duplo-haplóides tolerantes ao herbicida imidazolinone (Swanson et al., 1989) e, em arroz, com a obtenção de linhas mutantes de boa performance no campo e de alta qualidade alimentar (Yamagishi et al., 1996).

O presente trabalho teve como objetivos: (I) estabelecer a relação entre comprimento do botão floral, comprimento e estádio de desenvolvimento da antera com a formação de calos; (II) analisar o efeito da radiação gama no cultivo de anteras de tomate.

MATERIAL E MÉTODOS

Experimento I

Foram utilizados, como doadores de anteras, híbridos F₁ de tomate, oriundos do cruzamento IPA 5 x Rotam 4. Botões florais, da primeira floração, com comprimento de 5,0 a 9,0 mm, foram coletados entre 7:00 e 8:00 horas da manhã e acondicionados em câmara úmida, durante seis horas a 6 °C, no escuro. Em seguida, foram desinfestados e as anteras isoladas sob condições assépticas, as quais foram inoculadas em número de quatro por tubo de ensaio contendo 10 mL de meio de cultura. Três diferentes meios semi-sólidos, descritos por Gresshoff & Doy (1972) (2,0 mg L^-1 de ANA + 5,0 mg L^-1 de cinetina), Dao & Shamina (1978) (4,0 mg L^-1 de ANA + 4,0 mg L^-1 de BAP) e Cappadocia & Sree Ramulu (1980) modificado com 1,0 mg L^-1 de ANA + 1,0 mg L^-1 de BAP, foram usados visando induzir a formação de calos. As anteras foram mantidas no escuro, a 26 ± 2°C, durante uma semana. Após este período, passaram a um ambiente com fotoperíodo de 16 horas, a uma intensidade de 90 a 110 mmols m^-2 s^-1, sendo subcultivadas aos 60 e 90 dias. Com o intuito de regenerar plantas, alguns calos foram transferidos para meio com 0,001 mg L^-1 de ANA + 0,01 mg L^-1 de BAP.

Para a identificação do estádio de desenvolvimento, de cada botão floral uma antera foi reservada para análise citogenética e as quatro restantes inoculadas. A primeira foi fixada em Carnoy (3 álcool etílico:1 ácido acético glacial), permanecendo por duas horas à temperatura ambiente, sendo, então, estocada a -20°C até o preparo das lâminas. As anteras fixadas foram, lavadas em água destilada, hidrolisadas em HCl 5 N, durante 20 minutos, esmagadas em ácido acético 45% (v/v) e coradas com hematoxilina 1% (p/v) (Fujii & Guerra, 1998).

Com a finalidade de identificar alterações no número e/ou estrutura dos cromossomos, pontas de raízes desenvolvidas a partir de alguns calos foram tratadas e analisadas segundo metodologia descrita por Guerra (1983).

Foram estimados os coeficientes de correlação linear de Pearson (r) entre comprimento da antera, comprimento do botão floral e estádio de desenvolvimento. Para a estimativa dos coeficientes de correlação entre estádio de desenvolvimento e as demais variáveis, adotou-se a representação por numerais ordinais, de um a quatro, para as fases prófase I; metáfase I a telófase II; tétrade e micrósporo mononucleado, respectivamente.

O experimento foi conduzido segundo delineamento inteiramente casualizado, em um arranjo fatorial 4 x 3, perfazendo um total de 12 tratamentos, correspondentes a quatro classes de comprimento de botão floral, definidas em milímetros (5,0 - 6,0; 6,0 - 7,0; 7,0 - 8,0; 8,0 - 9,0) e aos três meios de cultura. A unidade experimental constou de um tubo contendo quatro anteras, com nove a 16 repetições por tratamento. Os explantes foram avaliados aos 30, 60, 90 e 120 dias após a inoculação, adotando-se como variável a presença ou ausência de calos e de enraizamento e observando-se o aspecto do calo. Os dados obtidos aos 90 dias foram transformados e submetidos à análise da variância. As médias foram comparadas pelo teste de Tukey (Gomes, 1990), ao nível de 0,05 de probabilidade, utilizando-se diferentes comparadores de médias em função do número de repetições.

Experimento II

Foram utilizados, como doadores de explantes, três híbridos de tomate, em F₂, dos cruzamentos IPA 5 x Rotam 4; IPA 6 x

Com a finalidade de observar o desenvolvimento das anteras in vitro bem como identificar possíveis alterações cromossômicas, parte de alguns calos foi tratada e analisada segundo metodologia descrita por Guerra (1983), aos 30, 45 e 60 dias de cultivo.

O experimento foi conduzido segundo delineamento inteiramente casualizado, em um arranjo fatorial 3 x 3 x 2, perfazendo um total de 18 tratamentos, correspondentes a três genótipos, três tipos de materiais irradiados e dois meios de cultura. A unidade experimental consistiu de um tubo de ensaio contendo quatro anteras, com quatro a 10 repetições por tratamento. Os explantes foram avaliados aos 30, 60 e 90 dias após a inoculação, usando-se como variáveis a presença ou ausência de calos e de enraizamento e observando-se o aspecto dos calos formados. Os dados obtidos aos 90 dias foram transformados e submetidos à análise da variância (Gomes, 1990).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Experimento I

Verificou-se uma correlação significativa entre o comprimento da antera e do botão floral (r = 0,86). Da mesma forma, o estádio de desenvolvimento da antera apresentou correlação significativa tanto com os comprimentos da antera (r = 0,67) quanto com os do botão floral (r = 0,63). Trabalhando com anteras de tomate, Summers et al. (1992) também verificaram correlações significativas para estas mesmas variáveis. No presente estudo, para cada estádio de desenvolvimento, os valores de comprimento das respectivas anteras e de seus botões foram maiores do que os observados por Summers et al. (1992).

A identificação do estádio de desenvolvimento das anteras demonstrou que a maioria das anteras em meiose (75,0%) apresentou comprimento de 2,0 - 2,3 mm. Por sua vez, 68,18% das anteras observadas em tétrade mediam entre 2,3 - 2,9 mm. Por fim, 97,67% das anteras com micrósporos mononucleados apresentaram comprimentos que variaram de 2,9 - 4,1 mm. Essas amplitudes de classes de comprimento de anteras de 2,0 - 2,3; 2,3 - 2,9 e 2,9 - 4,1 mm, representativas para os estádios de meiose, tétrade e micrósporo mononucleado, respectivamente, foram tomadas como base para os experimentos subseqüentes (TABELA 1).

A produção de calos variou ao logo do tempo. Aos 30 dias, foi incipiente, não permitindo avaliações conclusivas sobre os tratamentos. Dos 30 aos 90 dias, observou-se um incremento no número de calos formados e, a partir dos 90 dias, houve clara tendência à estabilização. A maioria dos calos analisados aos 120 dias apresentava coloração marrom.

A freqüência de calos produzidos nas anteras, aos 90 dias, foi semelhante nos três meios e nas quatro classes de comprimento de botão floral, identificando-se, entretanto, interação significativa entre os fatores. Anteras, predominantemente em meiose, provenientes de botões com comprimento entre 5,0 e 6,0 mm, cultivadas em meio de Dao & Shamina (1978), apresentaram uma produção de calos (29,25%) superior à obtida no meio de Cappadocia & Sree Ramulu (1980, modificado) (6,25%) (TABELA 2). Phippen & Ockendon (1990) observaram, em couve-flor, que o comprimento do botão floral, isoladamente, não apresentou efeito significativo sobre a androgênese, mas a sua interação com o genótipo sim. Por outro lado, em micrósporos isolados de Raphanus sativus, o tamanho do botão influenciou a resposta androgenética (Takahata et al., 1996).

Observou-se também formação de calos na região final do filete das anteras, que foi favorecida significativamente no meio de Cappadocia & Sree Ramulu (1980, modificado) (43,25%) (TABELA 3) e pelas classes de comprimento de botão de 5,0 - 6,0 e de 6,0 - 7,0 mm, com anteras predominantemente em meiose (TABELA 4). Segundo Wenzel & Foroughi-Wehr (1984), o crescimento destes tecidos diplóides, em detrimento dos micrósporos, é influenciado por componentes do meio de cultura. Em algumas espécies, a inclusão de uma determinada concentração de auxina, individualmente ou associada, pode desviar o desenvolvimento do micrósporo para induzir a formação de calos a partir do tecido conectivo (Sunderland, 1971) ou do filete (Wenzel & Foroughi-Wehr, 1984).

Os calos formados nas anteras, cultivadas nos três meios testados, eram, em geral, brancos, cobertos, total ou parcialmente, por pequenas (menores do que 1 mm de diâmetro) estruturas brancas arredondadas. Estes calos eram freqüentemente translúcidos e friáveis, podendo tornarem-se compactos, quando do aparecimento das estruturas arredondadas. Por outro lado, os calos oriundos da região do filete eram inicialmente verdes e compactos, com posterior formação superficial de pequenas estruturas brancas arredondadas.

A formação de calos foi induzida em todos os estádios de desenvolvimento (Figura 1). Verificou-se que a freqüência de calos decresceu com a progressão do estádio de desenvolvimento de prófase I a micrósporo mononucleado. Anteras contendo meiócitos em estádio de prófase I, principalmente em leptóteno, predominantes em botões com aproximadamente 5,0 mm de comprimento, contendo anteras com cerca de 2,0 mm, apresentaram a maior freqüência de formação de calos (27%). Estes resultados foram semelhantes aos obtidos por Summers et al. (1992). Gresshoff & Doy (1972) sugeriram que o melhor estádio de desenvolvimento para a produção de calos e regeneração de plantas de tomate é o de metáfase I. Levenko et al. (1977) e Gulshan et al. (1981) observaram que apenas anteras contendo micrósporos mononucleados em estádios iniciais apresentaram resposta androgenética.

No presente trabalho, a freqüência de calos produzidos, a partir do cultivo in vitro de anteras do híbrido IPA 5 x Rotam 4, foi de aproximadamente 30,2%. Este percentual foi semelhante aos obtidos por Zamir et al. (1980; 1981) e por Summers et al. (1992), os quais observaram uma percentagem de formação de calos na ordem de 26% e 33% das anteras inoculadas, respectivamente.

Aos 60 dias de cultivo, constatou-se também a formação de raízes em alguns calos obtidos, atingindo aos 120 dias uma freqüência de aproximadamente 8,33%, independente do meio de cultivo e da classe de comprimento do botão floral. Nas raízes analisadas, verificou-se a presença de alterações cromossômicas, como o aparecimento de células aneuplóides ou de pontes anafásicas associadas a fragmentos perdidos. As variações no número cromossômico podem ter ocorrido durante o preparo das lâminas, ou em função de perdas ou ganhos reais de cromossomos. Por outro lado, o aparecimento de pontes anafásicas em mitose ocorre como resultado de quebras e fusões cromossômicas (Guerra, 1986). Este processo tem sido constatado por outros autores, como no caso do cultivo in vitro de calos de milho (Fluminhan et al., 1996; Fluminhan & Kameya, 1996). A ocorrência de alterações cromossômicas é comum em células e tecidos derivados de calos (Karp & Bright, 1985); além disso, calos derivados de anteras apresentam variabilidade cromossômica maior do que os oriundos de tecidos somáticos (Singh, 1993).

Experimento II

Observou-se a formação de calos a partir de anteras dos três genótipos, tanto no material irradiado como no não irradiado. Contudo, não foram verificadas diferenças significativas para os tratamentos estudados, no que se refere ao número de calos formados. Os calos formados aos 30 dias apresentaram, em geral, coloração verde claro e aspecto friável. Os calos obtidos posteriormente tinham coloração variando de branco, amarelo pálido a verde e aos poucos começaram a apresentar-se marrom.

Nos calos analisados aos 30 e 45 dias, observou-se, independente do tratamento, células meristemáticas e células em divisão. Tais células foram identificadas a partir de anteras cultivadas em estádio inicial de prófase I, o que corrobora os resultados observados no Experimento I e aqueles descritos por Summers et al. (1992).

Tanto as células com características meristemáticas como aquelas em divisão foram constatadas, principalmente, em meio contendo 2,0 mg L^-1 de ANA + 1,0 mg L^-1 de cinetina. Neste meio, foi observado, aos 30 dias, o dobro da formação de calos (8,9%) em relação ao meio contendo 2,0 mg L^-1 de ANA + 5,0 mg L^-1 de cinetina. Gulshan et al. (1981), estudando o efeito de cinco meios no cultivo de anteras de tomate, constataram, também, que o meio descrito por Gresshoff & Doy (1972) contendo 2,0 mg L^-1 de ANA e 1,0 mg L^-1 de cinetina promovia uma melhor indução de calos.

CONCLUSÕES

Nas condições em que foi desenvolvido o presente trabalho, os resultados permitem concluir que:

• Existe correlação positiva entre o estádio de desenvolvimento com os comprimentos das anteras (r = 0,67) e dos botões florais (r = 0,63) do tomateiro.

• Anteras contendo meiócitos em estádio de prófase I (2,0 - 2,3 mm de comprimento) apresentam maior freqüência de indução de calos.

• O meio descrito por Cappadocia & Sree Ramulu (1980) contendo 1,0 mg L^-1 de ANA + 1,0 mg L^-1 de BAP favorece a formação de calos na região do filete das anteras, para o híbrido de tomate IPA 5 x Rotam 4.

• A radiação g nas doses utilizadas – 20 Gy para botões florais e 200 Gy para sementes – não promove efeitos significativos, no que se refere à formação de calos desenvolvidos a partir de anteras dos híbridos de tomate, em F₂, IPA 5 x Rotam 4; IPA 6 x Rotam 4 e IPA 8 x 217.1.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA) pelas sementes híbridas de tomate utilizadas nos experimentos. Agradecem, também, à Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e ao Banco do Nordeste do Brasil (BNB) pelo apoio financeiro.

Recebido para publicação em 13.10.98

Aceito para publicação em 31.03.99

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⁶⁰

Rotam 4 e IPA 8 x 217.1. Uma parte das sementes foi exposta aos raios gama (g) de uma fonte de Co (Cobalt Irradiator, Radionics Laboratory, Scotch Plains, New Jersey, USA; taxa de dose 24,7 Gy hora

^-1), a uma dose de 200 Gy

^I, no Departamento de Energia Nuclear/ UFPE. Após a irradiação, as sementes foram plantadas da mesma forma que as não irradiadas e cultivadas em casa de vegetação. Botões florais, contendo anteras com 2,0 a 2,5 mm de comprimento, foram

coletados tanto das matrizes oriundas das sementes irradiadas quanto das não irradiadas. Metade dos botões, oriundos das sementes não irradiadas, recebeu uma dose de 20 Gy

^II de raios g. Os botões foram acondicionados em câmara úmida, identificados de acordo com o genótipo e com o tipo de irradiação e submetidos ao mesmo processo descrito no Experimento I. As anteras foram inoculadas em dois meios de cultura descritos por Gresshoff & Doy (1972): 2,0 mg L

^-1 de ANA + 5,0 mg L

^-1 de cinetina (I) e 2,0 mg L

^-1 de ANA + 1,0 mg L

^-1 de cinetina (II), com a finalidade de induzir a formação de calos. O material foi mantido sob as mesmas condições de cultivo descritas no Experimento I.

^I Dose selecionada, baseado em estudos preliminares com radiação g em sementes de tomate.

^II Dose indica por trabalho realizado por Him Him (1987).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  11 Jan 2000
• Data do Fascículo
  Out 1999

Histórico

• Aceito
  31 Mar 1999
• Recebido
  13 Out 1998