Acessibilidade / Reportar erro

Ácido salicílico inibe a formação de micorrizas arbusculares e modifica a expressão de quitinases e b-1,3-glucanases em raízes de feijoeiro

Salicylic acid inhibits arbuscular mycorrhyzae formation and changes chitinase and b-1,3-glucanase expression in bean roots

Resumos

Os mecanismos que controlam o processo de colonização intrarradicular por fungos micorrízicos arbusculares ainda não são conhecidos, mas podem envolver o sistema de defesa vegetal. Normalmente, em condições favoráveis à formação de micorrizas arbusculares (MAs), e.g. baixo fosfato (P), ocorre supressão da expressão de genes de defesa, como quitinases e b-1,3-glucanases, em certos estágios do desenvolvimento das simbioses. Assim, a inibição do crescimento fúngico intrarradicular em condições de alto P pode ser decorrência da atenuação da supressão e/ou indução de genes de defesa específicos. Se o sistema de defesa está envolvido no controle do crescimento fúngico intrarradicular em condições de alto P, a aplicação às raízes de um indutor de respostas de defesa, como o ácido salicílico (AS), poderia simular o efeito inibitório do P. Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do AS na colonização intrarradicular e nas atividades de quitinases e b-1,3-glucanases em raízes de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L. var. Carioca 80-SH) inoculadas com Glomus clarum ou Glomus intraradices, em condições de baixo e alto P. Em condições de baixo P, a aplicação de AS inibiu a colonização intrarradicular a níveis similares aos observados em condições de alto P. Em condições de alto P, a inibição da micorrização pelo AS foi ainda maior. Associado a essa inibição, incrementos de aproximadamente 10 vezes nas atividades específicas de quitinases e redução nas atividades de b-1,3-glucanases nas raízes das plantas que receberam AS foram observados. Em função dos padrões de atividades de quitinases e b-1,3-glucanases nas raízes não-inoculadas e inoculadas, não foi possível estabelecer uma relação entre as atividades dessas hidrolases e o crescimento fúngico intrarradicular.

resposta de defesa; colonização intrarradicular; fosfato


Even though the mechanisms controlling intraradical colonization by arbuscular mycorrhizal fungi are not yet known, they may involve the plant defense system. Normally, under appropriate conditions for mycorrhiza formation, e.g. low phosphate (P), the expression of plant defense genes, such as chitinases and b-1,3-glucanases, is suppressed. Under high P conditions, the inhibition of intraradical fungal growth may be due to an attenuation of the suppression and/or induction of specific plant defense genes. If the plant defense system limits intraradical fungal growth under high P conditions, then the application of a plant defense inducer to the roots, such as salicylic acid (SA), might have the same effect as high P. The aim of this work was to evaluate the effects of SA on the intraradical colonization and on the activities of chitinases and b-1,3-glucanases in bean (Phaseolus vulgaris L. cv. Carioca 80-SH) roots inoculated with Glomus clarum or Glomus intraradices, and grown under low and high P conditions. Under low P, the application of SA to bean roots resulted in inhibition of intraradical fungal colonization, to the same levels as observed for high P conditions. This inhibition was even greater under high P conditions. Associated with the inhibition of root colonization, a 10-fold increase in chitinase and reduction of b-1,3-glucanase activities were observed in roots that received SA. Based on the patterns of chitinase and b-1,3-glucanase activities in not-inoculated and inoculated roots, it was not possible to establish a relationship between activities of these hidrolases and intraradical fungal growth.

plant defense response; intraradical colonization; phosphate


Ácido salicílico inibe a formação de micorrizas arbusculares e modifica a expressão de quitinases e b-1,3-glucanases em raízes de feijoeiro

Heron Salazar Costa1,2; Winston Franz Ríos-Ruiz1,3; Marcio Rodrigues Lambais1,4*

1Depto. de Solos e Nutrição de Plantas - USP/ESALQ, C.P. 9 - CEP: 13418-900 - Piracicaba, SP.

2Bolsista CAPES.

3Bolsista FAPESP.

4Bolsista CNPq.

*Autor correspondente <mlambais@carpa.ciagri.usp.br>

RESUMO: Os mecanismos que controlam o processo de colonização intrarradicular por fungos micorrízicos arbusculares ainda não são conhecidos, mas podem envolver o sistema de defesa vegetal. Normalmente, em condições favoráveis à formação de micorrizas arbusculares (MAs), e.g. baixo fosfato (P), ocorre supressão da expressão de genes de defesa, como quitinases e b-1,3-glucanases, em certos estágios do desenvolvimento das simbioses. Assim, a inibição do crescimento fúngico intrarradicular em condições de alto P pode ser decorrência da atenuação da supressão e/ou indução de genes de defesa específicos. Se o sistema de defesa está envolvido no controle do crescimento fúngico intrarradicular em condições de alto P, a aplicação às raízes de um indutor de respostas de defesa, como o ácido salicílico (AS), poderia simular o efeito inibitório do P. Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do AS na colonização intrarradicular e nas atividades de quitinases e b-1,3-glucanases em raízes de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L. var. Carioca 80-SH) inoculadas com Glomus clarum ou Glomus intraradices, em condições de baixo e alto P. Em condições de baixo P, a aplicação de AS inibiu a colonização intrarradicular a níveis similares aos observados em condições de alto P. Em condições de alto P, a inibição da micorrização pelo AS foi ainda maior. Associado a essa inibição, incrementos de aproximadamente 10 vezes nas atividades específicas de quitinases e redução nas atividades de b-1,3-glucanases nas raízes das plantas que receberam AS foram observados. Em função dos padrões de atividades de quitinases e b-1,3-glucanases nas raízes não-inoculadas e inoculadas, não foi possível estabelecer uma relação entre as atividades dessas hidrolases e o crescimento fúngico intrarradicular.

Palavras-chave: resposta de defesa, colonização intrarradicular, fosfato

Salicylic acid inhibits arbuscular mycorrhyzae formation and changes chitinase and b-1,3-glucanase expression in bean roots

ABSTRACT: Even though the mechanisms controlling intraradical colonization by arbuscular mycorrhizal fungi are not yet known, they may involve the plant defense system. Normally, under appropriate conditions for mycorrhiza formation, e.g. low phosphate (P), the expression of plant defense genes, such as chitinases and b-1,3-glucanases, is suppressed. Under high P conditions, the inhibition of intraradical fungal growth may be due to an attenuation of the suppression and/or induction of specific plant defense genes. If the plant defense system limits intraradical fungal growth under high P conditions, then the application of a plant defense inducer to the roots, such as salicylic acid (SA), might have the same effect as high P. The aim of this work was to evaluate the effects of SA on the intraradical colonization and on the activities of chitinases and b-1,3-glucanases in bean (Phaseolus vulgaris L. cv. Carioca 80-SH) roots inoculated with Glomus clarum or Glomus intraradices, and grown under low and high P conditions. Under low P, the application of SA to bean roots resulted in inhibition of intraradical fungal colonization, to the same levels as observed for high P conditions. This inhibition was even greater under high P conditions. Associated with the inhibition of root colonization, a 10-fold increase in chitinase and reduction of b-1,3-glucanase activities were observed in roots that received SA. Based on the patterns of chitinase and b-1,3-glucanase activities in not-inoculated and inoculated roots, it was not possible to establish a relationship between activities of these hidrolases and intraradical fungal growth.

Key words: plant defense response, intraradical colonization, phosphate

INTRODUÇÃO

Micorrizas arbusculares (MAs) são associações simbióticas mutualísticas entre fungos da ordem Glomales e plantas vasculares (Bonfante-Fasolo, 1984). Seu desenvolvimento é fortemente influenciado pelo fosfato (P) na planta, o qual, em altas concentrações, inibe a colonização intrarradicular (Abbott et al., 1984; Gerdemann, 1968; Koide & Schreiner, 1992). É provável que o P controle o desenvolvimento das MAs através de um complexo sistema de regulação de genes relacionados ao sistema de defesa vegetal, incluindo quitinases e b-1,3-glucanases (Lambais & Mehdy, 1995). Isoformas específicas de quitinases e b-1,3-glucanases são, normalmente, induzidas durante o processo de infecção de tecidos vegetais por fungos patogênicos (Dumas-Gaudot et al., 1996; Guzzo & Martins, 1996). Essas hidrolases podem atuar sinergisticamente na degradação da parede celular de vários fungos (Mauch et al., 1988), e poderiam estar envolvidas no controle do crescimento intrarradicular de fungos micorrízicos arbusculares (Lambais & Mehdy, 1995).

Em MAs, as atividades de quitinases são induzidas nos estádios iniciais do desenvolvimento da simbiose e suprimidas posteriormente a níveis inferiores aos observados em controles não-micorrizados (Spanu et al., 1989; Lambais & Mehdy, 1993). Essa supressão é atenuada em condições de alto P e pode ser essencial para o desenvolvimento dos fungos micorrízicos nas raízes (Lambais & Mehdy, 1993). Em condições de alto P, o acúmulo de mRNAs codificando uma isoforma ácida de quitinase é induzido em células contendo arbúsculos ou sua vizinhança (Lambais & Mehdy, 1998). Aparentemente, a capacidade de diferentes isolados de fungos micorrízicos arbusculares em colonizar o tecido cortical da planta hospedeira está relacionada à sua capacidade em suprimir as atividades de quitinases (Lambais & Mehdy, 1996).

As atividades de b-1,3-glucanases em MAs são também suprimidas em certos estádios do desenvolvimento da simbiose, e dependem da concentração de P e da interação fungo-planta (Lambais & Mehdy, 1995). Em condições de baixo P, tem sido observado acúmulo de mRNAs codificando uma isoforma de b-1,3-glucanase, homóloga a uma isoforma básica de soja, em células contendo arbúsculos e suas imediações. Além da indução localizada, uma supressão sistêmica, em condições de alto P ou em raízes micorrizadas, também tem sido observada (Lambais & Mehdy, 1998).

A regulação diferencial de isoformas de quitinases e b-1,3-glucanases em MAs pode ser decorrência de alterações hormonais e/ou síntese de moléculas elicitoras/supressoras específicas (Lambais & Mehdy, 1995; David et al., 1998). Se a expressão diferencial de genes de defesa tem, de fato, papel relevante no controle do desenvolvimento de MAs não se sabe. Uma das maneiras de demonstrar o envolvimento direto de proteínas de defesa no controle da colonização intrarradicular em MAs seria através da alteração da expressão desses genes, utilizando super-expressão em plantas transgênicas ou através da utilização de indutores/supressores de genes específicos. Dentre esses compostos, o ácido salicílico (AS) pode atuar como indutor de vários genes relacionados ao sistema de defesa e está diretamente envolvido no desenvolvimento da resistência sistêmica adquirida (Gaffney et al., 1993; Dann et al., 1996; Rao et al., 1997). Sua aplicação na parte aérea de fumo e ervilha, dentre outras plantas, pode inibir atividades de catalases, induzir o acúmulo de espécies ativas de oxigênio e ativar vários genes de defesa, incluindo quitinases e b-1,3-glucanases (Ohashi & Matsuoka, 1987; Yalpani et al., 1991; Dann et al., 1996; Srivastava & Dwivedi, 1998). Se o AS induz a expressão de genes de defesa no sistema radicular, não se sabe. Porém, sua aplicação em solução nutritiva inibe a formação de nódulos em raízes de alfafa inoculadas com Rhizobium meliloti (Martínez-Abarca et al., 1998). Em MAs, o efeito do AS é desconhecido.

Considerando-se que a inibição da formação de MAs por altas concentrações de P envolva a ativação de genes de defesa vegetal e que o AS atua como indutor da expressão desses genes, é provável que, na presença de AS e em condições de baixo P, o desenvolvimento de MAs seja inibido de maneira similar ao que ocorre em condições de alto P. Adicionalmente, se quitinases e b-1,3-glucanases estão envolvidas no controle do crescimento fúngico intrarradicular, seus padrões de expressão devem ser semelhantes em ambas situações.

O presente trabalho teve como objetivo, avaliar o efeito do AS no desenvolvimento de MAs e nas atividades de quitinases e b-1,3-glucanases em raízes de feijoeiro, em condições de baixo e alto P no solo.

MATERIAL E MÉTODOS

Material biológico, condições de cultivo e colheita

As unidades experimentais consistiram de plantas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L. var. Carioca 80-SH) em vasos contendo 1 L de uma mistura autoclavada de areia e vermiculita (3:1, v/v). As sementes foram desinfestadas superficialmente com solução de hipoclorito de sódio comercial (5%, v/v), lavadas em água esterilizada e colocadas para germinar em placas de Petri esterilizadas, à 28oC no escuro. Por ocasião do plantio, o substrato recebeu 10 mL de uma suspensão de esporos (2000 esporos mL-1) de Glomus intraradices Schenck & Smith ou de Glomus clarum Nicolson & Shenck. No tratamento controle, aplicou-se 10 mL do filtrado (0,45 mm) da suspensão de esporos. Dois dias antes do plantio aplicou-se as seguintes quantidades de nutrientes (em mg L-1 de substrato): 80 de N, 100 de K, 40 de Ca e 20 de Mg, nas formas de NH4NO3, KCl, CaCl2, MgSO4.7H2O, respectivamente. Cada vaso recebeu também 0,2 mL de solução de Fe-EDTA e 0,2 mL de solução de micronutrientes de Hoagland. Os vasos receberam 20 ou 150 mg de P L-1 de substrato na forma de KH2PO4. Adubações com 20 mg L-1 de N na forma de NH4NO3 ou Ca(NO3)2 foram feitas aos 20 e 42, e 33 dias após o plantio, respectivamente. Duas semanas após o plantio (SAP) iniciou-se a aplicação intermitente (2 em 2 dias) de AS (7,24 mmol por vaso) ao substrato de cultivo. Até 10 SAP, as plantas receberam 25 aplicações, totalizando 181 mmoles de AS. Os tratamentos controle receberam o mesmo volume de H2O desionizada e esterilizada. A quantidade de AS e o intervalo de aplicação foram definidos em ensaios preliminares, de forma a manter as atividades de quitinases em níveis superiores aos dos controles sem AS. As plantas foram colhidas 4, 6, 8 e 10 SAP. O sistema radicular foi separado da parte aérea, lavado em água corrente e congelado em nitrogênio líquido. Uma porção do terço médio do sistema radicular foi utilizada para avaliação do nível de colonização micorrízica intrarradicular. A matéria seca da parte aérea (MSPA) foi determinada após secagem à 65oC. O controle de ácaros foi feito com Omit® 720CE (2 mL L-1), Dicofol® (1 mL L-1) e Vertimec® 18CE (0,5 mL L-1), aos 45, 47 e 58 dias após o plantio, respectivamente.

Determinação do nível de colonização micorrízica intrarradicular

As raízes foram tratadas com KOH 10% (90oC, 45 min) e coloridas com azul-de-tripano em lactoglicerol (90oC, 5 min), de acordo com Phillips & Hayman (1970). A porcentagem de colonização foi determinada pelo método da placa reticulada (Giovannetti & Mosse, 1980).

Extração de proteínas

A extração de proteínas solúveis das raízes foi feita de acordo com Lambais & Mehdy (1993). Subamostras de 3 g de raízes foram maceradas em nitrogênio líquido e homogeneizadas em 9 mL de solução tampão (Na-citrato 100 mM, pH 5,3; EDTA 5 mM, pH 8,0; PMSF 1 mM; b-mercaptoetanol 1 mM), à 4oC. Em seguida, o homogeneizado foi centrifugado à 20000g por 20 min, à 4oC. O sobrenadante foi armazenando em tubos de 1,5 mL à -20oC até ocasião das análises enzimáticas. A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Bradford (1976) utilizando-se o kit comercial da BioRad™ e albumina de soro bovino como padrão.

Análises enzimáticas

As atividades de quitinases foram determinadas por espectrofotometria através da degradação de carboximetil-quitina marcada com remazol violeta brilhante (CM-chitin RBV, Loewe Biochemica, Munique, Alemanha), conforme proposto por Wirth & Wolf (1990). Os ensaios foram realizados com quantidades de proteínas na faixa linear de resposta, determinada em ensaios preliminares. Os conteúdos protéicos foram ajustados com Na-citrato 100 mM (pH 5,3). A 50 mL de solução de proteínas foram adicionados 950 mL de substrato (quitina RBV, 2 mg mL-1). As amostras foram incubadas por 30 min, à 37oC. A reação foi interrompida com 150 mL de HCl 1N. As amostras foram centrifugadas à 8000g por 5 min, à 4oC, e a absorbância do sobrenadante à 550 nm foi determinada. Nas provas em branco, a solução de proteínas foi substituída pelo mesmo volume de solução tampão. Os resultados de atividades específicas foram expressos em unidades de absorbância à 550 nm por mg de proteína por hora (UA550 mg-1 h-1). Foram realizadas três determinações para cada repetição.

As atividades de b-1,3-glucanases foram determinadas por espectrofotometria, através da degradação de carboximetil-curdlan marcado com remazol azul brilhante (CM-curdlan-RBB, Loewe Biochemica, Munique, Alemanha). Uma aliquota de 950 mL de cada amostra em tampão Na-citrato 100 mM (pH 5,3) contendo 40 mg de proteínas foi incubada com 150 mL do substrato (CM-curdlan-RBB 4 mg mL-1) por 1 h, à 37oC. A reação foi interrompida com 150 mL de HCl 2N. As amostras foram centrifugadas à 9000g por 5 min, à 4oC, e a absorbância do sobrenadante à 600 nm foi determinada. Nas provas em branco, a solução de proteínas foi substituída pelo mesmo volume de solução tampão. O resultados de atividade específica foram expressos em unidades de absorbância à 600 nm por mg de proteína por hora (UA600 mg-1 h-1). Foram realizadas três determinações para cada repetição.

Delineamento experimental e análise estatística

O ensaio foi montado com delineamento inteiramente ao acaso, em esquema fatorial (3 x 2 x 2), com 4 repetições. Foram utilizados os seguintes fatores, e respectivos níveis: inoculação (sem fungo, G. intraradices, G. clarum); P (20 e 150 mg L-1 de substrato); AS (sem e com aplicação). As médias foram comparadas pelo teste t de Student (p<0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Crescimento das plantas

A concentração de AS e sua freqüência de aplicação foram definidas em feijoeiro variedade Safira, em condições de alto P, de modo a não ocorrer fitotoxidez (dados não publicados). No entanto, na variedade Carioca 80-SH, constatou-se efeito inibitório significativo (p<0,05) do AS sobre o acúmulo de MSPA, tanto nas plantas não-inoculadas quanto nas inoculadas, colhidas com 4, 6 e 10 SAP (Figura 1). Para as plantas inoculadas com G. clarum, a aplicação de AS não afetou significativamente a produção de biomassa aérea (p<0,05), independente da dose de P. De uma maneira geral, a inoculação de G. clarum ou G. intraradices não afetou significativamente o crescimento das plantas, comparado com os tratamentos não-inoculados, dentro de cada um dos níveis de AS, em condições de baixo ou alto P, com exceção da inoculação com G. clarum, em plantas que receberam AS. Neste caso, houve um estimulo do crescimento da parte aérea, em relação aos controles não-inoculados (Figura 1B). Aparentemente, a inoculação de fungos micorrízicos arbusculares eficientes em colonizar o sistema radicular pode aliviar os efeitos tóxicos do AS sobre o feijoeiro. Como o AS está envolvido na geração de espécies ativas de oxigênio em tecidos vegetais (Rao et al., 1997), é possível que algumas MAs, dependendo da interação fungo-planta, possuam mecanismos anti-oxidativos mais eficientes do que raízes não-micorrizadas, aumentando assim sua tolerância ao AS e outros estresses ambientais.


Colonização micorrízica intrarradicular

Nas raízes inoculadas com G. clarum ou G. intraradices, os maiores níveis de colonização intrarradicular foram observados 10 SAP (Figura 2). Tanto na presença quanto na ausência de AS, G. clarum apresentou maior eficiência em colonizar o tecido cortical das raízes do feijoeiro (infectividade) do que G. intraradices, em todas as épocas de amostragem (p<0,05) (Figura 2). Em feijoeiro, aparentemente, a infectividade de G. intraradices está relacionada com a variedade da planta cultivada. Na variedade Tendergreen, taxas de colonização intrarradicular mais elevadas do que as obtidas nestes experimentos já foram observadas, em condições de cultivo semelhantes (Lambais & Mehdy, 1993). Na variedade Safira, no entanto, as taxas de colonização por G. intraradices são inferiores às observadas na variedade Carioca 80-SH (dados não publicados). Esses dados demonstram que, embora os fungos micorrízicos sejam considerados simbiontes não-específicos, o nível de colonização intrarradicular dependente da interação dos genótipos da planta e do fungo (Koide & Schreiner; 1992; Lambais & Mehdy, 1996).


A colonização micorrízica intrarradicular foi inibida pelo aumento da concentração de P no solo, independente da aplicação de AS (Figura 2). Na ausência de AS, os níveis de colonização por G. clarum e G. intraradices em condições de alto P, 10 SAP, foram 63% e 62% menores, respectivamente, do que em condições de baixo P (Figura 2A). Já, na presença de AS, os níveis de colonização por G. clarum, em condições de alto P, foram 90% menores, do que em condições de baixo P, enquanto que a colonização por G. intraradices foi totalmente inibida (Figura 2B). O efeito inibitório do P sobre a colonização das raízes por fungos micorrízicos arbusculares é conhecido de longa data. No entanto, o mecanismo bioquímico que determina o menor crescimento fúngico intrarradicular não é conhecido. Tem sido sugerido que a ativação do sistema de defesa vegetal em condições de alto P estaria envolvida no controle do desenvolvimento de MAs (Lambais & Mehdy, 1995). Em altos níveis de P, a supressão do sistema de defesa é atenuada em relação a baixos níveis de P (Lambais & Mehdy, 1993). Adicionalmente, em raízes de feijoeiro variedade Tendergreen colonizadas por G. intraradices, isoformas específicas de quitinases são induzidas em células contendo arbúsculos e/ou sua proximidade sob condições de alto P (Lambais & Mehdy, 1998), o que poderia contribuir para a limitada colonização do tecido cortical nessas condições.

A aplicação de AS, um indutor do sistema de defesa vegetal, resultou em redução significativa do crescimento intrarradicular de G. intraradices e G. clarum (p<0,05), em todas as épocas de avaliação (Figura 1B). Nas parcelas cultivadas em baixo P e que receberam AS, os níveis de colonização por G. clarum são comparáveis aos obtidos em raízes cultivadas em condições de alto P, na ausência de AS, sugerindo que o AS atua de modo similar ao P. O efeito negativo do AS na colonização das raízes ocorreu, provavelmente, devido à inibição do crescimento fúngico intrarradicular, e não devido ao efeito inibitório nas fases de pré-infecção (germinação dos esporos, crescimento de tubos germinativos, diferenciação de apressórios), já que os níveis iniciais de colonização, em todas as situações, são similares.

Atividades de quitinases

Na ausência de AS e em condições de baixo P, 8 SAP, as atividades específicas de quitinases nas raízes colonizadas por G. intraradices ou G. clarum foram suprimidas, em relação aos controles não-inoculados, (p<0,05; Figura 3A). Em condições de alto P, essa supressão não foi observada. Já, em condições de baixo e alto P, 10 SAP, as atividades específicas de quitinases formam induzidas em raízes colonizadas por G. clarum, em relação aos controles não-inoculados (p<0,05; Figura 3A). As atividades de quitinases em raízes colonizadas por G. intraradices, 10 SAP, não diferiram dos controles não-inoculados, independente da concentração de P no solo (p<0,05). Resultados semelhantes foram observados em alho, feijão e fumo (Spanu et al., 1989; Lambais & Mehdy, 1993; David et al., 1998). Aparentemente, a supressão de quitinases ocorre durante o processo de transcrição dos genes, conforme demonstrado em plantas de fumo transgênicas expressando constitutivamente uma quitinase básica que apresentava expressão diferencial em raízes micorrizadas, e o P atuaria atenuando essa supressão (Lambais & Mehdy, 1993; David et al., 1998).


A aplicação de AS induziu aproximadamente 10 vezes as atividades específicas de quitinases nas raízes, em relação aos tratamentos que não receberam AS, 8 e 10 SAP (Figura 3B). Ao contrário do padrão de atividades de quitinases observado em raízes sem AS, não foi observada supressão significativa (p<0,05) nas raízes inoculadas com G. clarum ou G. intraradices, em condições de baixo P 8 SAP (Figura 3B). Já, 10 SAP, supressão significativa (p<0,05) das atividades específicas de quitinases, em relação ao controle não-inoculado, foi observada somente em raízes colonizadas por G. clarum, em condições de baixo P, e por G. intraradices em condições de alto P (Figura 3B). Aparentemente, a elevada atividade de quitinases nas raízes que receberam AS, foi o fator determinante dos baixos níveis de colonização micorrízica.

Embora o papel das quitinases no controle do desenvolvimento de MAs não seja conhecido, é provável que a indução localizada de isoformas específicas iniba o crescimento fúngico intrarradicular (Lambais & Mehdy, 1995; Lambais & Mehdy, 1998). Normalmente, a indução de atividades de quitinases está relacionada ao aumento da resistência vegetal à infecção por fungos patogênicos (Dassi et al., 1996; Guzzo & Martins, 1996; Pozo et al., 1996) e mecanismos semelhantes poderiam atuar em MAs. As atividades de quitinases são induzidas na parte aérea de várias plantas após a aplicação de concentrações fisiológicas de AS (Raskin, 1995). O mecanismo de atuação do AS não está totalmente esclarecido, mas existem evidências mostrando que esse composto fenólico interfere no estado redox das células, através de uma indução do acúmulo de radicais de oxigênio livres (Rao et al., 1997). Assim, mesmo que os níveis de colonização de raízes inoculadas com G. clarum ou G. intraradices em condições de alto P sejam similares àqueles observados na presença de AS e condições de baixo P, seus mecanismos de atuação são, provavelmente, distintos, já que a indução de quitinases por P foi muito inferior à indução por AS. Seria interessante determinar quais isoformas de quitinases são reguladas pelo P e pelo AS, e se existem isoformas que são reguladas de maneira similar na presença de AS e condições de alto P.

Atividades de b-1,3-glucanases

Em condições de baixo P, 8 e 10 SAP, foi observada uma supressão significativa das atividades específicas de b-1,3-glucanases nas raízes inoculadas com G. clarum, na ausência de AS, em relação aos controles não-inoculados (p<0,05; Figura 4A). Essa supressão não foi observada em condições de alto P, ou em raízes inoculadas com G. intraradices, em condições de baixo e alto P. Ao contrário, em raízes inoculadas com G. clarum, em condições de alto P, houve indução significativa (p<0,05).


No geral, as atividades de b-1,3-glucanases nas raízes que receberam AS foram significativamente menores do que nas que não receberam AS, independente da concentração de P, 8 e 10 SAP (p<0,05; Figura 4). Raízes inoculadas com G. intraradices apresentaram diferenças significativas, em relação ao controle não-inoculado, somente 10 SAP (p<0,05). Nessa época de amostragem, as atividades de b-1,3-glucanases foram induzidas em condições de baixo P e suprimidas em condições de alto P (Figura 4B). Já, nas raízes colonizadas por G. clarum, essas atividades diferiram do controle não-inoculado somente em condições de baixo P, 8 SAP. Nessas condições houve um incremento de 58% nas atividades específicas dessa hidrolase.

Normalmente, quitinases e b-1,3-glucanases apresentam padrões de regulação semelhantes, isto é, são co-reguladas (Vögeli et al., 1988). Neste experimento, os padrões de atividades específicas de b-1,3-glucanases diferiram daqueles observados para atividades específicas de quitinases, mostrando que, em raízes colonizadas por fungos micorrízicos arbusculares, a expressão desses genes não é co-regulada. Resultados similares foram observados por Lambais & Mehdy (1993) em raízes de feijoeiro variedade Tendergreen colonizadas por G. intraradices, com base nas padrões de atividades específicas de quitinases e b-1,3-glucanases e de acúmulo de mRNAs codificando diferentes isoformas dessas enzimas.

b-1,3-glucanases são enzimas hidrolíticas produzidas tanto por fungos quanto por plantas (Cassab & Varner, 1988; Griffin, 1994). Presume-se que essas hidrolases estejam relacionadas aos processos de formação e alongamento da parede celular (Helleboid et al., 1998). Adicionalmente, isoformas específicas de quitinases e b-1,3-glucanases podem sinergisticamente atuar na degradação da parede celular de fungos fitopatogênicos (Mauch et al., 1988). No entanto, em MAs, a indução local de isoformas específicas de b-1,3-glucanases, em condições de baixo P, poderia contribuir para a degradação parcial da parede celular vegetal, facilitando o crescimento fúngico intrarradicular (Lambais & Mehdy; 1995). Assim, a ocorrência de supressão das atividades de b-1,3-glucanases em raízes colonizadas pelo fungo mais infectivo, G. clarum, não descarta a possibilidade de indução localizada de alguma isoforma específica, como observado em raízes de feijoeiro variedade Tendergreen colonizadas por G. intraradices (Lambais & Mehdy, 1998).

CONCLUSÕES

Os resultados obtidos mostram que o AS inibe a colonização micorrízica intrarradicular, de forma semelhante a condições de alto P. No geral, o AS induziu atividades de quitinases e inibiu atividades de b-1,3-glucanases nas raízes. Os dados sugerem que os mecanismos de regulação de quitinases pelo AS e P são distintos. Os padrões de atividades de quitinases ou b-1,3-glucanases nas diferentes situações do experimento não permitem estabelecer uma relação entre atividades dessas hidrolases e colonização micorrízica intrarradicular.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABBOTT, L.K; ROBSON, A.D.; BOER, G. The effect of phosphorus on the formation of hyphae in soil by the vesicular-arbuscular mycorrhizal fungus, Glomus fasciculatum. The New Phytologist, v.97, n.3, p.437-446, 1984.

BONFANTE-FASOLO, P. Anatomy and morphology of mycorrhizae. In: POWELL, C.L. (Ed.) VA Mycorrhiza. Boca Raton: CRC Press, 1984. cap.2, p.5-33.

BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v.72, n.1/2, p.248-254, 1976.

CASSAB, G.I.; VARNER, J.E. Cell wall proteins. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v.39, p.321-353, 1988.

DANN, E.K.; MEUWLY, P.; MÉTRAUX, J.-P.; DEVERALL, B.J. The effect of pathogen inoculation or chemical treatment on activities of chitinase and b-1,3-glucanase and accumulation of salicylic acid in leaves of green bean, Phaseolus vulgaris L. Physiological and Molecular Plant Pathology, v.49, n.5, p.307-319, 1996.

DASSI, B.; DUMAS-GAUDOT, E.; ASSELIN, A.; RICHARD, C.; GIANINAZZI, S. Chitinase and b-1,3-glucanase isoforms expressed in pea roots inoculated with arbuscular mycorrhizal or pathogenic fungi. European Journal of Plant Pathology, v.102, n.1, p.105-108, 1996.

DAVID, R.; ITZHAKI, H.; GINZBERG, I.; GAFINI, Y.; GALILI, G.; KAPULNIK, Y. Suppression of tobacco basic chitinase gene expression in response to colonization by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus intraradices. Molecular Plant-Microbe Interactions, v.11, n.6, p.489-497, 1998.

DUMAS-GAUDOT, E.; SLEZACK, S.; DASSI, B.; POZO, M.J.; GIANINAZZI-PEARSON, V.; GIANINAZZI, S. Plant hydrolytic enzymes (chitinases and b-1,3-glucanases) in root reactions to pathogenic and symbiotic microorganisms. Plant and Soil, v.185, p.211, 1996.

GAFFNEY, T.; FRIEDRICH, L.; VERNOOIJ, B.; NEGROTTO, D.; NYE, G.; UKNES, S.; WARD, E.; KESSMANN, H.; RYALS, J. Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance. Science, v.261, p.754-756, 1993.

GERDEMANN, J.W. Vesicular-Arbuscular mycorrhiza and plant growth. Annual Review of Phytopathology, v.6, p.397-418, 1968.

GIOVANNETTI, M.; MOSSE, B. An evaluation of techniques for measuring vesicular arbuscular mycorrhizal infection in roots. The New Phytologist, v.84, n.3, p.489-500, 1980.

GRIFFIN, D.H. Fungal physiology. 2.ed. New York: Wiley-Liss, 1994. cap.3, p.63-101.

GUZZO, S.D.; MARTINS, E.M.F. Local and systemic induction of b-1,3-glucanase and chitinase in coffee leaves protected against Hemileia vastatrix by Bacillus thuringiensis. Journal of Phytopathology, v. 144, p. 449-454, 1996.

HELLEBOID, S.; BAUW, G.; BELINGHERI, L.; VASSEUR, J.; HILBERT, J.-L. Extracellular b-1,3-glucanases are induced during early somatic embryogenesis in Cichorium. Planta, v.205, n.1, p.56-63, 1998.

KOIDE, R.T.; SCHREINER, R.P. Regulation of the vesicular-arbuscular mycorrhizal symbiosis. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v.43, p.557-581, 1992.

LAMBAIS, M.R.; MEHDY, M.C. Suppression of endochitinase, b-1,3-glucanase, and chalcone isomerase expression in bean vesicular-arbuscular mycorrhizal roots under different soil phosphate conditions. Molecular Plant-Microbe Interactions, v.6, n.1, p.75-83, 1993.

LAMBAIS, M.R.; MEHDY, M.C. Differential expression of defense-related genes in arbuscular mycorrhiza. Canadian Journal of Botany, v.73, p.s533-s540, 1995.

LAMBAIS, M.R.; MEHDY, M.C. Soybean roots infected by Glomus intraradices strains differing in infectivity exhibit differential chitinase and b-1,3-glucanase expression. The New Phytologist, v.134, p.531-538, 1996.

LAMBAIS, M.R.; MEHDY, M.C. Spatial distribution of chitinases and b-1,3-glucanase transcripts in bean arbuscular mycorrhizal roots under low and high soil phosphate conditions. The New Phytologist, v.140, n.1, p.33-42, 1998.

MARTÍNEZ-ABARCA, F.; HERRERA-CERVERA, J. A.; BUENO, P.; SANJUAN, J.; BISSELING, T.; OLIVARES, J. Involvement of salicylic acid in the establishment of the Rhizobium melioti-alfalfa symbiosis. Molecular Plant-Microbe Interactions, v.11, n.2, p.153-155, 1998.

MAUCH, F.; MAUCH-MANI, B.; BOLLER, T. Antifungal hydrolases in pea tissue: II. Inhibition of fungal growth by combinations of chitinase and b-1,3-glucanase. Plant Physiology, v.88, n.3, p.936-942, 1988.

OHASHI, Y.; MATSUOKA, M. Induction and secretion of pathogenesis-related proteins by salicylate or plant hormones in tobacco suspension cultures. Plant Cell Physiology, v.28, n.4, p.573-580, 1987.

PHILLIPS, J.M; HAYMAN, D.S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society, v.55, n.1, p.158-162, 1970.

POZO, M.J.; DUMAS-GAUDOT, E.; SLEZACK, S.; CORDIER, C.; ASSELIN, A; GIANINAZZI, S; GIANINAZZI-PEARSON, V; AZCON-AGUILAR, C; BAREA, J.M Induction of new chitinase isoforms in tomato roots during interactions with Glomus mosseae and/or Phytophthora nicotianae var. parasitica. Agronomie, v.16, n.10, p.689-697, 1996.

RAO, M.V.; PALIYATH, G.; ORMROD, D.P.; MURR, D.P.; WATKINS, C.B. Influence of salicylic acid on H2O2-metabolizing enzymes: salicylic acid-mediate damage requires H2O2. Plant Physiology, v.115, n.1, p.137-149, 1997.

RASKIN, I. Salicylic acid. In: DAVIES, J. (Ed.) Plant hormones: physiology, biochemistry and molecular biology. London: Kluwer Publishers, 1995. 781p. cap. C, p.188-205.

SPANU, P.; BOLLER, T.; LUDWIG, A.; WIEMKEN, A.; FACCIO, A.; BONFANTE-FASOLO, P. Chitinase in roots of mycorrhizal Allium porrum - regulation and localization. Planta, v.177, n.4, p.447-455, 1989.

SRIVASTAVA, M.K.; DWIVEDI, U.N. Salicylic acid modulates glutathione metabolism in pea seedling. Journal of Plant Physiology, v.153, n.3/4, p.409-414, 1998.

VÖGELI, U.; MEINS JUNIOR, F.; BOLLER, T. Co-ordinated regulation of chitinase and b-1,3-glucanase in bean leaves. Planta, v.174, n.3, p.364-372, 1988.

WIRTH, S.J.; WOLF, G.A. Dye-labeled substrates for the assay and detection of chitinase and lysozyme activity. Journal of Microbiological Methods, v.12, n.3/4, p.197-205, 1990.

YALPANI, N.; SILVERMAN, P.; WILSON, T.M.A.; KLEIER, D.A.; RASKIN, I. Salicylic acid is a systemic signal and an inducer of pathogenesis-related proteins in virus-infected tobacco. The Plant Cell, v.3, n.8, p.809-818, 1991.

Recebido em 03.12.98

Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    28 Abr 2000
  • Data do Fascículo
    Mar 2000

Histórico

  • Recebido
    03 Dez 1998
Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" USP/ESALQ - Scientia Agricola, Av. Pádua Dias, 11, 13418-900 Piracicaba SP Brazil, Phone: +55 19 3429-4401 / 3429-4486 - Piracicaba - SP - Brazil
E-mail: scientia@usp.br