Isolamento e caracterização de bactérias degradadoras do herbicida diuron

Isolation and characterization of diuron-degrading soil bacteria

Resumos

Solos provenientes de áreas cultivadas com cana-de-açúcar, e histórico de utilização do herbicida diuron, foram utilizados para isolamento e caracterização de linhagens bacterianas com potencial de degradar este herbicida. As linhagens foram isoladas de solos da rizosfera de cana-de-açúcar e de solos das entre linhas. Noventa e oito linhagens foram isoladas, das quais 27 foram selecionadas para avaliação do crescimento em meio mineral sólido suplementado com diuron nas concentrações de 5, 10 e 20 mig mL-1. Neste experimento, 5 linhagens apresentaram um crescimento exponencial entre 0-48 horas (EMBRAPA-CNPMA D12-12, D12-14 e D16-12) e entre 0-110 horas (EMBRAPA-CNPMA D11-9 e D12-18), similar ao controle. A linhagem EMBRAPA-CNPMA D12-12 identificada como Acinetobacter baumannii, foi selecionada para estudo de cinética de crescimento em meio mineral, com e sem fonte de nitrogênio, com e sem glicose (0,5%) e suplementado com diuron nas concentrações 20, 50 e 100 mig mL-1, apresentando variação em função da fonte de N, da presença da glicose e da concentração do diuron.

Acinetobacter baumannii; biodegradação; herbicidas; curva de crescimento

Soil samples collected in sugarcane fields with a history of use of the herbicide diuron were employed to isolate and characterize bacterial strains with potential to degrade diuron. Strains were isolated from rhizosphere soil and from soil between plant rows. A total of 98 strains were isolated, of which 27 were selected for further evaluation of pesticide degradation potential at the concentrations of 5, 10 and 20 mug mL-1 in mineral agar media. Acinetobacter baumannii strain D12-12 was chosen to study the kinetics of growth in a mineral medium, with and without N, or with and without glucose (0.5%) and supplemented with diuron at either 20, 50 or 100 mug mL-1. In the first experiment, five strains presented exponential growth between 0-48 hours (D12-12, D12-14 e D16-12) or between 0-110 hours (D11-9 e D12-18). Growth of the strain D12-12 was found to vary dependly on the concentration of nitrogen, glucose and diuron.

Acinetobacter baumannii; biodegradation; herbicide; diuron; growth curve

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE BACTÉRIAS DEGRADADORAS DO HERBICIDA DIURON

Milton Ricardo de Abreu Roque^1,3*; Itamar Soares de Melo²

¹Pós-Graduando do Depto. de Microbiologia e Bioquímica, ICB/UNESP, C.P. 199 - CEP: 13506-900 - Rio Claro, SP.

²Embrapa Meio Ambiente, C.P. 69 - CEP: 13820-000 - Jaguariúna, SP.

³Bolsista FAPESP.

*Autor correspondente <[e-mail]>

RESUMO: Solos provenientes de áreas cultivadas com cana-de-açúcar, e histórico de utilização do herbicida diuron, foram utilizados para isolamento e caracterização de linhagens bacterianas com potencial de degradar este herbicida. As linhagens foram isoladas de solos da rizosfera de cana-de-açúcar e de solos das entre linhas. Noventa e oito linhagens foram isoladas, das quais 27 foram selecionadas para avaliação do crescimento em meio mineral sólido suplementado com diuron nas concentrações de 5, 10 e 20 mg mL^-1. Neste experimento, 5 linhagens apresentaram um crescimento exponencial entre 0–48 horas (EMBRAPA-CNPMA D12-12, D12-14 e D16-12) e entre 0–110 horas (EMBRAPA-CNPMA D11-9 e D12-18), similar ao controle. A linhagem EMBRAPA-CNPMA D12-12 identificada como Acinetobacter baumannii, foi selecionada para estudo de cinética de crescimento em meio mineral, com e sem fonte de nitrogênio, com e sem glicose (0,5%) e suplementado com diuron nas concentrações 20, 50 e 100 mg mL^-1, apresentando variação em função da fonte de N, da presença da glicose e da concentração do diuron.

Palavras-chave:Acinetobacter baumannii, biodegradação, herbicidas, curva de crescimento

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF DIURON-DEGRADING SOIL BACTERIA

ABSTRACT: Soil samples collected in sugarcane fields with a history of use of the herbicide diuron were employed to isolate and characterize bacterial strains with potential to degrade diuron. Strains were isolated from rhizosphere soil and from soil between plant rows. A total of 98 strains were isolated, of which 27 were selected for further evaluation of pesticide degradation potential at the concentrations of 5, 10 and 20 mg mL^-1 in mineral agar media. Acinetobacter baumannii strain D12-12 was chosen to study the kinetics of growth in a mineral medium, with and without N, or with and without glucose (0.5%) and supplemented with diuron at either 20, 50 or 100 mg mL^-1. In the first experiment, five strains presented exponential growth between 0-48 hours (D12-12, D12-14 e D16-12) or between 0–110 hours (D11-9 e D12-18). Growth of the strain D12-12 was found to vary dependly on the concentration of nitrogen, glucose and diuron.

Key words:Acinetobacter baumannii, biodegradation, herbicide, diuron, growth curve

INTRODUÇÃO

O diuron [3-(3,4-diclorofenil)-1,1-dimetiluréia], pertencente ao grupo químico das feniluréias, é recomendado para aplicação em diversas culturas no Brasil, sendo intensivamente aplicado na cultura de cana-de-açúcar (Musumeci et al., 1995). Apresenta alta persistência e adsorção ao solo, podendo contaminar solos agrícolas e o ambiente urbano. Segundo Nitschke & Schüssler (1998), em municípios da Alemanha, o diuron representa 80% do total de herbicidas encontrados nos efluentes de estação de tratamento de água.

Cripps & Roberts (1978) e Chakrabarty (1982) relataram a biodegradação e o comportamento do diuron no ambiente. Alfonso Hernandez et al. (1984) observaram que a quantidade de diuron degradado através de processos não biológicos no solo, varia entre 55 a 70% do ingrediente ativo durante 3 semanas após a aplicação. A taxa aumenta para 80 a 85% quando ocorre a participação de microrganismos. Musumeci et al. (1995), encontraram taxas de degradação diferenciadas para o solo e para a planta, correlacionando com aspectos da translocação do produto na planta. A degradação de diuron, sob condições anaeróbicas, após 18 dias foi de 85% (Stepp et al., 1985).

Outra característica do diuron é a toxicidade à organismos do solo e aquáticos, Nebeker & Schuytema (1998) estudaram o efeito crônico do diuron em peixes e invertebrados e constataram que a sobrevivência e reprodução de Daphnia pulex foi reduzida significativamente quando a concentração de diuron na água era de 7,7 mg L^-1. Nemes-Kósa & Cserháti (1995); Canna-Michaelidou & Nicolaou (1996) estudaram os efeitos tóxicos e genotóxicos do diuron em fungos e bactérias. A bactéria Acinetobacter baumannii demonstrou capacidade para crescer e utilizar o herbicida diclofopmethyl como fonte de carbono e energia (Smith-Greiner & Adkins, 1996). Dhakephalkar & Chopade (1994), estudaram a resistência múltipla a metais de 33 isolados clínicos e ambientais de A. baumannii.

Este trabalho teve como objetivos: 1. Isolar linhagens de bactérias, provenientes de solos cultivados com cana-de-açúcar, e com potencial de degradação do diuron; 2. estudar o crescimento e caracterizar as linhagens isoladas.

MATERIAL E MÉTODOS

Coleta de amostras de solo

Amostras de solos foram coletadas de regiões produtoras de cana-de-açúcar no Estado de São Paulo, com histórico de aplicações intensivas do diuron (TABELA 1), envolvendo os municípios de Mogi-Mirim, Iracemápolis, Holambra, Limeira e Conchal.

Para coleta de amostras da rizosfera, o sistema radicular de plantas de cana-de-açúcar foi retirado e acondicionado em sacos plásticos de polietileno, e, para a coleta de solo não rizosférico, amostras foram retiradas das entrelinhas de plantio.

ISOLAMENTO E CONTAGEM DE LINHAGENS BACTERIANAS

Solo das entrelinhas

As amostras de solo foram peneiradas (malha de diâmetro de 0,22 mm) e homogeneizadas. Em seguida, foram retiradas subamostras de 10 g, as quais foram adicionadas a Erlenmeyers contendo 90 mL de solução salina (0,85%). Após 15 minutos sob agitação, foram realizadas diluições em série. Alíquotas de 100 mL foram retiradas das diluições 10^-3, 10^-4, e 10^-5 e semeadas, em triplicatas, no meio de cultura mínimo (MM) (contendo os seguintes produtos por litro: K₂HPO₄ (0,5 g); (NH₄)₂SO₄ (0,5g); MgSO₄.7h₂O (0,5 g); FeCl₂.1H₂O (10 mg); CaCl₂(10 mg); MnCl₂ (0,1 mg); ZnSO₄ (0,01 mg); solução de vitaminas (2,0 mL)) suplementado com diuron (200 mg mL^-1) + TTC (cloreto de trifeniltetrazólio 2,5 mg L^-1) e com glicose + TTC (2,5 mg L^-1). Após 48 horas de incubação a 28 °C, foi realizada a contagem, em unidades formadoras de colônias por grama de solo (UFC g^-1 de solo).

Solo rizosférico

Amostras de solo aderido às raízes foram cuidadosamente separadas destas, peneiradas e deixadas para secar por 30 min. a temperatura ambiente. Subamostras de 10 g foram transferidas para Erlenmeyer contendo 90 mL de solução salina. Após permanência por 15 minutos sob agitação, os frascos foram deixados por 2 minutos em ultra-som para desagregação de partículas de solo aderidas às raízes. Os procedimentos posteriores foram realizados conforme descrito para o solo das entrelinhas.

CRESCIMENTO DE LINHAGENS BACTERIANAS COM POTENCIAL DE DEGRADAÇÃO DO DIURON

Meio de cultura sólido

Neste experimento a seleção de bactérias resistentes e com potencial para utilizar o diuron como fonte de carbono, foi realizada através de testes de crescimento em meio mineral J.E. sólido (K₂HPO₄=0,5 g; (NH₄)₂SO₄=0,5 g; MgSO₄.7H₂O=0,5 g; FeCl₂.1H₂O=10 mg; CaCl₂=10 mg; MnCl₂=0,1 mg; ZnSO₄=0,01 mg; ágar=15,0 g, por litro de água destilada, Jones & Edington, 1968) + Diuron (20 mg mL^-1). A avaliação foi realizada após 96 horas. As linhagens bacterianas que apresentaram melhor crescimento, em meio com diuron como única fonte de carbono, foram selecionadas para estudo de cinética de crescimento. Deste modo, 17 linhagens foram submetidas a avaliação de crescimento em meio mineral M9, contendo por litro: Na₂HPO₄=6,0 g; KH₂PO₄=3,0 g; NaCl=0,5 g; MgSO₄.7H₂O 0,1M=10 mL; CaCl₂ 1M=10 mL; ágar=15,0 g) + diuron nas concentrações de 5 mg mL^-1, 10 mg mL^-1 e 20 mg mL^-1, por um período de 7 dias de incubação, à temperatura de 28°C.

Meio de cultura líquido

As linhagens EMBRAPA-CNPMA D11-9, D12-12, D12-14, D12-18 e D16-12, foram selecionadas para os primeiros testes de crescimento em meio de cultura líquido. Foram cultivadas em meio LB (triptona=10 g; extrato de levedura=5 g; NaCl=5 g por litro de água destilada), tubos de 10 mL, por 24 horas. Após este período, 100 mL foram inoculados em meio mineral J.E. acrescido de 20 mg mL^-1 de diuron, por 24 horas. Após o pré-cultivo, 1 mL do inóculo de cada linhagem foi introduzido em 100 mL de meio mineral J.E. suplementado com diuron (20 mg mL^-1). As avaliações de crescimento foram realizadas pela absorbância em espectrofotômetro Beckman DU-8B, (560 nm), nos intervalos de 48, 110 e 134 horas, após a inoculação. As linhagens EMBRAPA-CNPMA D11-9, D12-12 e D16-12, foram inoculadas também em meio LB, utilizado como crescimento controle.

Utilização de fonte de carbono e nitrogênio

A linhagem EMBRAPA-CNPMA D12-12, foi utilizada para verificar a influência da fonte de carbono e de nitrogênio no crescimento bacteriano, em meio de cultura mineral J.E. suplementado ou não com uma fonte extra de carbono (glicose) e com ou sem fonte de nitrogênio. O experimento foi avaliado nos intervalos de 0 - 6 - 24 - 48 - 120 - 168 - 216 horas. A produção do inóculo e montagem foi desenvolvida de acordo com o descrito no item anterior. Em cada intervalo o crescimento foi avaliado através da leitura da absorbância (560 nm) realizadas em espectrofotômetro Beckman DU-8B.

Os meios de cultura utilizados, são descritos a seguir:

1. Meio mineral J.E.+ diuron nas concentrações 20, 50 e 100 mg mL^-1.

2. Meio mineral J.E. (- NH₄NO₃) + diuron (0 (sem adiçãodo herbicida), 20, 50, 100 mg mL^-1) + glicose (0,5%)

3. Meio mineral J.E. + diuron (0, 20, 50, e 100 mg mL^-1) + glicose (0,5%)

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Isolamento e contagem de linhagens bacterianas

A contagem de células viáveis, apresentando coloração rosa devido a presença de TTC e expressa em unidades formadoras de colônias, por grama de solo (UFC g^-1 de solo) ou de raízes (UFC g^-1 de raízes) foi realizada após 72 horas de incubação, em meio mínimo suplementado com diuron + TTC e glicose + TTC (TABELA 2). As amostras que apresentaram um maior número de bactérias são na maioria provenientes de solos rizosféricos (TABELA 2).

A comunidade microbiana da rizosfera pode estar relacionada com a capacidade de degradar compostos xenobióticos. Hsu & Bartha (1979) sugeriram que raízes de plantas podem acelerar a mineralização de pesticidas, por aumentarem a atividade da comunidade ou por selecionarem organismos com capacidade para transformar a molécula alvo.

A biodegradação de tricloroetileno (TCE) foi maior em solo da rizosfera, quando comparado com o solo não rizosférico (Walton & Anderson, 1990). Os autores verificaram que, o solo da rizosfera de plantas presentes em uma área contaminada com TCE, apresentou uma evolução de ¹⁴CO₂ 3 vezes maior que o solo da mesma área sem vegetação.

Crescimento das linhagens em meio de cultura sólido

A seleção das linhagens bacterianas baseou-se em observações macroscópicas de pleno crescimento em meio de cultura M9 e J.E. suplementado com diuron, e características morfológicas, escolhendo colônias diferentes, evitando-se purificar colônias com crescimento lento e irregular (TABELAS 3 e 4).

Na avaliação de crescimento, as linhagens bacterianas EMBRAPA-CNPMA D12-12 e D12-14 apresentaram nos dois meios de cultura mineral (J.E. e M9) e nas diversas dosagens de diuron, um ótimo crescimento (TABELAS 3 e 4). As linhagens EMBRAPA-CNPMA D11-9, D12-18 e D16-12 cresceram bem em meio mineral J.E. (TABELA 3), o que não foi observado quando o meio M9 foi utilizado (TABELA 4).

Crescimento das linhagens em meio de cultura líquido

Baseado nas avaliações iniciais, em meio mineral contendo diuron, as linhagens EMBRAPA-CNPMA D11-9, D12-12, D12-14, D12-18 e D16-12 foram selecionadas para avaliação do crescimento em meio de cultura líquido.

A biodegradação do diuron e a avaliação do crescimento, para o fungo Rhizoctonia solani, foi obtida por Vroumsia et al. (1996). Os autores observaram que o tempo de estabilização do crescimento foi de 120 horas, semelhante ao encontrado neste trabalho para as linhagens bacterianas EMBRAPA-CNPMA D11-9, D12-12, D12-14, D12-18 e D16-12 (Figura 1). A presença de uma fonte de carbono mais facilmente disponível (Meio LB), não alterou a fase inicial de crescimento (Figura 2).

Utilização de fonte de carbono e nitrogênio

A linhagem EMBRAPA-CNPMA D12-12 apresentou uma fase de adaptação de 6 horas a partir da qual ocorreu crescimento até 24 horas, observou-se uma diminuição no crescimento entre 48-120 horas, independente da concentração de diuron (Figura 3), no meio de cultura 1 (meio mineral suplementado com diuron como fonte de carbono). O melhor crescimento da bactéria foi obtido no meio suplementado com diuron e NH₄NO₃.

O crescimento da linhagem EMBRAPA-CNPMA D12-12 no meio de cultura suplementado com o diuron nas concentrações de 50 e 100 mg mL^-1 e glicose aumentou no intervalo de 6 a 24 horas, após este período ocorreu uma diminuição que permaneceu até a última avaliação com 216 horas (Figura 4). Na ausência do diuron (meio 2/0) a linhagem não cresceu, mesmo na presença da glicose. No meio de cultura 3 (diuron + glicose + NH₄NO₃, Figura 5), a linhagem manteve a tendência do meio de cultura 2 apresentado na Figura 4, mas somente o meio 3/100 (Figura 5) apresentou crescimento no intervalo entre 6-24 horas.

Shelton et al. (1996), estudaram o metabolismo de 12 herbicidas por Streptomyces, onde a degradação do diuron foi comparada com e sem fonte de nitrogênio (NH₄⁺). Os autores constataram uma baixa taxa de biodegradação do produto (19%), sendo esta aumentada na presença de nitrogênio (55%), após 7 dias de incubação. Estes dados corroboram com os apresentados neste experimento, onde o diuron como fonte de carbono foi importante para o metabolismo bacteriano.

Para compreender a forma de metabolismo e os mecanismos envolvidos na utilização de compostos xenobióticos por microrganismos, se faz necessário um estudo aprofundado do crescimento das linhagens bacterianas, e a utilização do composto alvo como fonte de N ou carbono. Neste trabalho, pôde-se estudar a cinética de crescimento de Acinetobacter baumannii EMBRAPA-CNPMA D12-12, degradadora do diuron (Roque et al., 1998) e verificar a importância da fonte de nitrogênio e de carbono para a biodegradação. Os melhores resultados foram observados na presença de NH₄NO₃; a glicose como fonte de carbono não estimulou o crescimento, sugerindo uma atividade de repressão catabólica na presença de glicose. E, principalmente, a presença do diuron , com ou sem outra fonte de N ou C, foi o fator seletivo para a ocorrência do crescimento da linhagem EMBRAPA-CNPMA D12-12. Esta característica pode estar relacionada com o local de isolamento da bactéria (solo rizosférico) e com a aplicação do diuron, segundo Sandmann & Loos (1984), a rizosfera de cana-de-açúcar é rica em exsudatos análogos de moléculas xenobióticas e, a utilização intensiva destas pode promover uma seleção dos microrganismos com mecanismos enzimáticos capazes de biodegradar o composto.

Identificação das Bactérias

Procedeu-se a identificação ao nível de espécie, com a classificação taxonômica sendo realizada na Fundação de Pesquisas Tropicais André Tosello. As linhagens EMBRAPA-CNPMA D12-12, D12-18 e D16-12 foram identificadas como Acinetobacter baumannii.

Recebido em 20.04.99

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  02 Fev 2001
• Data do Fascículo
  Dez 2000

Histórico

• Recebido
  20 Abr 1999