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Avaliação do extrato da Zeyheria tuberculosa na perspectiva de um produto para cicatrização de feridas 1 1 Artigo extraído da dissertação de mestrado “Avaliação da Atividade Antimicrobiana e de Citotoxicidade in vitro e in vivo do extrato etanólico bruto do caule da Zeyheria tuberculosa (Vell) Bur. (Bignoniaceae): Perspectiva de um suplemento para Cicatrização de Feridas”, apresentada à Faculdade de Nutrição, Universidade Federal de Alagoas, Maceió, AL, Brasil. Apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), processo nº 474023/2010-9.

Resumos

OBJETIVOS:

avaliar as atividades antimicrobiana, citotóxica e cicatrizante do extrato etanólico do caule da Z. tuberculosa por via tópica e/ou ingestão oral.

MÉTODO:

ensaios antimicrobianos in vitro pelo método de difusão em disco, teste de toxicidade da Artemia salina e ensaios in vivo com ratos Wistar. Nesses foram coletados dados clínicos, histológicos e bioquímicos para avaliação do processo de cicatrização.

RESULTADOS:

ensaios antimicrobianos in vitro mostraram atividade frente à Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, com halos de inibição de 18, 14 e 10mm, respectivamente. A melhor concentração inibitória mínima foi 62,5µg/mL para S. aureus, sendo essa bactéria escolhida para os ensaios in vivo. Animais tratados com as pomadas do extrato da Z. tuberculosa apresentaram melhores resultados na redução do diâmetro da ferida, dado confirmado pela presença de reepitelização nos cortes histológicos.

CONCLUSÃO:

o extrato mostrou-se promissor para a continuação de estudos que identifiquem os princípios ativos responsáveis pela atividade farmacológica e seu mecanismo de ação no processo de cicatrização de feridas, a fim de desenvolver um produto que possa ser utilizado de forma alternativa no reparo de feridas cutâneas infectadas.

Cicatrização; Bioensaios; Extratos Vegetais; Testes de Sensibilidade Microbiana


OBJECTIVES:

to evaluate the antimicrobial, cytotoxic and healing activities of the ethanolic extract of the stems of Z. tuberculosa via topical use and/or oral ingestion.

METHOD:

antimicrobial assays in vitro using the disk diffusion method, the Artemia salina toxicity test, and in vivo assays with Wistar rats. From these was collected clinical, histological and biochemical data for evaluating the healing process.

RESULTS:

in vitro antimicrobial testing showed activity in relation to Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis, with zones of inhibition of 18, 14 and 10 mm, respectively. The best minimum inhibitory concentration was 62.5 µg/ml for S. aureus, this bacteria being chosen for the in vitro assays. Animals treated with the ointments with the extract of Z. tuberculosa showed the best results in the reduction of the wound diameter, data confirmed by the presence of re-epithelialization in the histological samples.

CONCLUSION:

the extract was shown to be promising for the continuation of studies which may identify the active ingredients responsible for the pharmacological activity and its mechanism of action in the process of wound healing, so as to develop a product which may be used as an alternate means in the repair of infected cutaneous wounds.

Wound Healing; Biological Assay; Vegetal Extracts; Microbial Sensitivity Tests


OBJETIVOS:

evaluar las actividades antimicrobianas, citotóxicas y cicatrizantes del extracto etanólico del tallo de la Z. tuberculosa por vía tópica y/o ingestión oral.

MÉTODO:

ensayos antimicrobianos in vitro por el método de difusión en disco, prueba de toxicidad de la Artemia salina y ensayos in vivo con ratones Wistar. En estos fueron recolectados datos clínicos, histológicos y bioquímicos para evaluación del proceso de cicatrización.

RESULTADOS:

los ensayos antimicrobianos in vitro mostraron actividad frente a la Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis, con halos de inhibición de 18, 14 y 10 mm, respectivamente. La mejor concentración inhibitoria mínima fue 62,5 µg/mL para S. aureus, siendo esta bacteria escogida para los ensayos in vivo. Animales tratados con las pomadas del extracto de la Z. tuberculosa presentaron mejores resultados en la reducción del diámetro de la herida, dato confirmado por la presencia de reepitelización en los cortes histológicos.

CONCLUSIÓN:

el extracto se mostró promisor para la continuación de estudios que identifiquen los principios activos responsables por la actividad farmacológica y su mecanismo de acción en el proceso de cicatrización de heridas, con la finalidad de desarrollar un producto que pueda ser utilizado de forma alternativa en la reparación de heridas cutáneas infectadas.

Cicatrización de Heridas; Bioensayo; Extractos de Plantas; Pruebas de Sensibilidad Microbiana


Introdução

O processo de cicatrização de feridas envolve uma cascata de eventos complexos, envolvendo as fases: inflamatória, proliferativa e de remodelagem. Essas fases se sobrepõem de forma contínua e temporal. O sucesso do tratamento está diretamente relacionado à escolha da substância correta para atuar em cada uma dessas etapas. Porém, quando há infecção no leito da ferida é necessário debelar o processo infeccioso para prosseguir com a terapêutica( 11. Mendonça RJ, Coutinho-Netto J. Cellular aspects of wound healing. An Bras Dermatol. 2009;84(3):257-62. ).

Apesar da hegemonia alopática e do predomínio de substâncias sintéticas para uso local e sistêmico no tratamento de feridas, observa-se crescente interesse por alternativas naturalistas que promovam a cicatrização das lesões. Se antes o uso terapêutico de plantas medicinais no cuidado situava-se à margem das instituições de saúde, hoje ultrapassa essas barreiras para legitimar-se nesse meio( 22. Alvim NAT, Ferreira MA, Cabral IE,Almeida AJ Filho. The use of medicinal plants as a therapeutical resource: from the influences of the professional formation to the ethical and legal implications of its applicability as an extension of nursing care practice. Rev. Latino-Am. Enfermagem. 2006;14(3):316-23. ).

O Brasil está entre os países que apresentam a chamada megadiversidade, possuindo, aproximadamente, 120.000 espécies vegetais. No entanto, somente 10% dessas espécies foram estudadas do ponto de vista fitoquímico e biológico( 33. Pagano MC, Maria SM. Effect of Phosphorus Fertilization on Arbuscular Mycorrhizal Colonization ofZeyheria tuberculosa a Native Species in Brazil's Forest. Middle-East J Sci Res. 2010;6(6):604-11. ). As plantas da família Bignoniaceae, na qual a espécie Zeyheria tuberculosa (Z. tuberculosa) está inserida, são consideradas importantes por apresentarem em seus constituintes princípios bioativos e diversas atividades farmacológicas, inclusive na medicina tradicional para o tratamento de doenças como câncer, picada de cobra, doenças de pele, distúrbios gastrointestinais, distúrbios do trato respiratório, afecções ginecológicas, distúrbios hepáticos, epilepsia, cólera, dor, problemas urinários, malária, problemas cardíacos e doenças sexualmente transmissíveis( 33. Pagano MC, Maria SM. Effect of Phosphorus Fertilization on Arbuscular Mycorrhizal Colonization ofZeyheria tuberculosa a Native Species in Brazil's Forest. Middle-East J Sci Res. 2010;6(6):604-11. - 44. Rahmatullah M, Rahman MA, Haque MZ,Mollik AH, MiajeeEU, Begum R, et al. A survey of medicinal plants used by folk medicinal practitioners of station purbo para village of Jamalpur Sadar Upazila in Jamalpur district, Bangladesh. Am-Eurasian J Sustain Agric. 2010;4:122-35. ).

A perspectiva de utilização do extrato de caule da Z. tuberculosa partiu de um estudo( 55. Bastos MLA, Lima MRF, Conserva LM, Andrade VS,Rocha EM, LemosRP. Studies on the antimicrobial activity and brine shrimp toxicity of Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bur. (Bignoniaceae) extracts and their main constituents. . Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2009;8:1-16. ) em que se comprovou a atividade antimicrobiana frente ao Staphylococcus aureus e à Candida albicans, em bioensaios in vitro. Nessa pesquisa, também foram isolados e identificados quatro flavonoides, dos quais três foram descritos pela primeira vez para esse gênero. Os flavonoides são compostos encontrados em alguns alimentos, cascas do caule de árvores, caule, raízes, talos e flores que possuem inúmeras atividades farmacológicas como antioxidante, antimicrobiano, anti-inflamatório, analgésico, vasodilatador, cicatrizante e regenerativa de cartilagens e ossos( 55. Bastos MLA, Lima MRF, Conserva LM, Andrade VS,Rocha EM, LemosRP. Studies on the antimicrobial activity and brine shrimp toxicity of Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bur. (Bignoniaceae) extracts and their main constituents. . Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2009;8:1-16. - 66. Vieira AP, Santos NR, Borges JHS,Vicenzi MPA, SchmitzWO. Flavonoid action in second intention healing in surgically-induced clean wounds in Wistar rats. Semina Cienc Biol Saude. 2008;29(1):65-74. ). Com o objetivo de ampliar as possibilidades de recursos terapêuticos, para o tratamento de feridas cutâneas, a partir da pesquisa experimental, a proposta deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana in vitro e cicatrizante in vivo do extrato etanólico bruto do caule da Z. tuberculosa, por via tópica e/ou por via oral.

Método

Planta e preparação dos extratos

A espécie vegetal Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bur. (Bignoniaceae) foi coletada pelo grupo de pesquisa e identificada pelo Instituto do Meio Ambiente do Estado de Alagoas (IMA), onde a exsicata foi depositada sob número 23.819.

Para o preparo do extrato, o caule foi secado em temperatura ambiente, triturado e colocado em etanol a 90%. Após 15 dias, o solvente foi evaporado em um evaporador rotatório, sob vácuo, à temperatura máxima de 45°C, até volume constante. Esse processo de rotaevaporação aconteceu por três séries até a obtenção de um resíduo claro, o qual permaneceu exposto em capela de exaustão até volatização de todo solvente contido e obtenção do extrato bruto concentrado.

Avaliação da atividade antimicrobiana in vitro e determinação da concentração inibitória mínima

A atividade antimicrobiana do extrato do caule foi testada em triplicata, pelo método de difusão em disco( 77. Ayres MCC, Brandão MS, Vieira-Junior GM, Menor JCAS,Silva HB, SoaresMJS, et al. Antibacterial activity of useful plants and chemical constituents of the roots of Copernicia prunifera. Braz J Pharmacogn. 2008; 18(1):90-7. ), utilizando-se cepas bacterianas e fúngicas padronizadas e distribuídas pelo American Type Cell Collection (ATCC). As cepas bacterianas testadas foram Streptococcus pyogenes (ATCC 19615), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Proteus mirabilis (ATCC 49565), Klebsiella pneumoniae (ATCC 31488) e Escherichia coli (ATCC 14942). Como cepa fúngica, testou-se a Candida albicans (ATCC 10231). Com a amostra que apresentou atividade e foi escolhida para continuação do estudo, determinou-se a Concentração Inibitória Mínima (CIM), a qual é definida a partir de diluições seriadas do extrato ativo. Os experimentos foram realizados em triplicata.

Toxicidade frente à Artemia salina Leach

O bioensaio da Artemia salina foi realizado de acordo com a literatura( 55. Bastos MLA, Lima MRF, Conserva LM, Andrade VS,Rocha EM, LemosRP. Studies on the antimicrobial activity and brine shrimp toxicity of Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bur. (Bignoniaceae) extracts and their main constituents. . Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2009;8:1-16. ). A Artemia salina Leach (TAS) é um microcustáceo que pode ser utilizado laboratorialmente em bioensaios preliminares, para determinar a toxicidade de extratos e produtos de origem natural com potencial ativo biológico. O teste é realizado com larvas de segundo instar (náuplios), sendo considerado tóxico o extrato que induz a mortalidade maior ou igual a 30%.

Animais e grupos experimentais

Os ensaios in vivo foram realizados com 24 ratos (Rattus novergicus albinus - linhagem Wistar), adultos, machos, respeitando-se os Princípios Éticos em Experimentação Animal. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Alagoas (nº009880/2009-77).

Os ratos foram pesados e separados pelo método probabilístico de escolhas aleatórias em seis grupos (n=4), identificados a partir da terapêutica: Controle Positivo (CP); Controle Negativo (CN); Extrato Tópico (ET); Extrato Tópico e Oral (ETO); Extrato Oral (EO) e Branco (B). Os animais foram mantidos em gaiolas de polietileno, um animal em cada gaiola, forradas com serragem, em fotoperíodo de 12 horas de claro e escuro, ruídos mínimos, temperatura ambiente 21±1°C, mantida por ar condicionado. A alimentação foi com ração comercial (Labina(r), Purina, Brasil), com monitoramento da ingestão e água ad libitum.

Pomadas para uso tópico

As pomadas utilizadas neste experimento foram manipuladas por um farmacêutico e todas foram oriundas de uma base não iônica sem conservantes. Para o CP agregou-se gentamicina 0,1% à referida base, ficando na concentração-padrão para uso em humanos. Nos grupos ET e ETO acrescentaram-se 5% do extrato à base não iônica e para os grupos CN e EO foi utilizado apenas a base não iônica.

Extrato para uso oral

Com o extrato etanólico bruto do caule da Z. tuberculosa foi preparada uma tintura, na concentração de 1mg/mL, valor determinado a partir dos resultados da CIM e do TAS, para ser adicionada à dieta dos animais dos grupos ETO e EO que receberam o extrato por via oral.

A cada pélete de ração desses grupos foi acrescido 1mL de tintura e, após 24 horas de evaporação do etanol, em estufa à temperatura de 25ºC, era oferecido aos animais diariamente, com monitoramento da ingestão.

Ensaios biológicos para avaliação da atividade cicatrizante e antimicrobiana in vivo

Cada animal foi submetido à verificação do peso corpóreo para o monitoramento e cálculo da anestesia. Utilizou-se thiopental sódico, 40mg/kg de peso, via intraperitoneal. Em seguida, procedeu-se à verificação da temperatura por via retal, epilação do dorso, antissepsia da pele, com clorexidina degermante a 2%, e, com um punch metálico, foram realizadas quatro lesões excisivas paravertebrais de 12mm cada, a partir da linha mediana dorsal, até o nível do tecido aponeurótico, conforme Figura 1.

Figura 1
Lesões no dorso do animal no dia da cirurgia (D0)

Após a realização das excisões, cada lesão recebeu 0,25µL de uma suspensão contendo 1,5 x 106UFC/mL de S. aureus, para infectar o tecido aponeurótico superficialmente. Em seguida, as lesões foram cobertas com gaze e ataduras estéreis, aguardando-se 24 horas para realização de cultura com swab, das quatro lesões e início da terapêutica.

Os animais foram avaliados a cada 24 horas por 14 dias, para a observação clínica das lesões, quanto à presença de: efeitos adversos, irritação perilesional, retração cicatricial e realização dos curativos, de acordo com tratamento do grupo. Todos os dados foram registrados em protocolos pré-estabelecidos.

Nos 3º, 7º, 11º e 14º Dias de Pós-Operatório (DPO), realizou-se a medição da área da lesão com paquímetro digital, retirando-se fragmento de uma das lesões para avaliação histopatológica. No último dia do experimento, realizou-se anestesia e eutanásia de todos os animais com toracotomia e punção cardíaca, retirando-se 4mL de sangue, para análise de glicose, colesterol e triglicerídeos, além do fígado para avaliação microscópica de hepatotoxicidade do extrato.

Análise histológica

Todo o material retirado para exame microscópico foi numerado, sem a identificação do grupo ao qual pertencia, sendo fixados com solução de formol a 10%. As amostras foram desidratadas e diafanizadas em álcool e xilol, incluídas e emblocadas, em parafina aquecida. Após endurecimento, os blocos foram levados à microtomia, para obtenção das secções de 5µm, sendo coletadas em lâminas de vidro e coradas com corante Hematoxilina Eosina (HE).

A análise do material tomou como referência as fases inflamatória, proliferativa e de remodelação, as quais integram o processo de cicatrização. Para análise dos resultados, elaborou-se a Tabela 1 com escores baseados na literatura( 55. Bastos MLA, Lima MRF, Conserva LM, Andrade VS,Rocha EM, LemosRP. Studies on the antimicrobial activity and brine shrimp toxicity of Zeyheria tuberculosa (Vell.) Bur. (Bignoniaceae) extracts and their main constituents. . Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2009;8:1-16. , 88. Medeiros AC, Ramos AMO, Dantas Filho AM, Azevedo RCF,Araujo FLFB. Topic treatment of rat burns with hyaluronic acid. Acta Cir Bras. [Internet]. 1999 [acesso 8 jun 2012];14(4). Disponível em:http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0102-86501999000400010&lng=en&nrm=iso
Disponível em:http://www.scielo.b...
). A intensidade das variáveis (1+ a 5+) foi multiplicada por fatores positivos ou negativos, baseados na sua importância para a cicatrização. A soma desses produtos correspondeu ao escore total para cada animal, o qual, posteriormente, foi multiplicado por 4 (n).

Tabela 1
Escores utilizados para avaliação do exame histopatológico

Testes estatísticos

Os dados foram analisados no programa GraphPad InStat(r). As variáveis numéricas foram avaliadas pelo teste da Anova com dois fatores de interação entre si, com pós-teste de Tukey, para análise do efeito entre os grupos. Para os dados não paramétricos utilizou-se o teste de Mann-Whitney. O nível de significância estabelecido foi de 5% (p<0,05).

Resultados

Avaliação da atividade antimicrobiana e determinação da CIM

O extrato bruto do caule da Z. tuberculosa não demonstrou atividade para o fungo testado, porém, foi ativo contra as bactérias S. pyogenes, S. aureus e S. epidermidis, conforme mostrado na Tabela 2. O S. aureus foi o microrganismo escolhido para continuação dos testes, por ser importante na ocorrência de infecção hospitalar, principalmente em infecções tegumentares, além de apresentar um halo de inibição com cerca de 50% do tamanho do controle positivo( 909. Vitorino FilhoRNL, Batista MCS, Verçosa BLA, Silva SMMS,Bonfim JM, BrandãoAAC, et al. Avaliação do uso de pomada à base de sementes de jaqueira (Artocarpus heterophyllus Lam) na terapêutica tópica de feridas. J Basic Appl Pharm Sci. 2007;28(3):279-86. - 1010. Moura JP, Pimenta FC, Hayashida M, Cruz EDA,Canini SRMS, GirE. Colonization of Nursing Professionals byStaphylococcus aureus. Rev. Latino-Am. Enfermagem. 2011;19(2):325-31. ). A CIM do extrato para esse microrganismo foi de 62,5µg/mL.

Tabela 2
Resultado das difusões em discos com o extrato bruto do caule da Z. tuberculosa, para cepas bacterianas e fúngica

Toxicidade frente à Artemia salina (TAS)

Após a determinação da CIM procedeu-se o TAS. Segundo os critérios determinados nesta pesquisa, o extrato mostrou-se atóxico nas concentrações entre 100 e 10µg/mL. Os valores expressos na CIM (62,5µg/mL) e no TAS deste estudo estão em consonância para utilização segura nos animais deste estudo, sendo legitimado pela ausência de mortalidade entre os animais durante o experimento.

Avaliação do processo de cicatrização in vivo

Durante o experimento, os animais foram monitorados quanto à temperatura, peso e observação macroscópica das lesões, incluindo a medição do diâmetro das lesões. Quanto à temperatura, no Dia da Cirurgia (D0) todos os animais estavam com temperatura dentro da normalidade entre 36,2 e 37ºC. Do 3º ao 7º DPO, somente os animais dos grupos ET e CN apresentaram aumento da temperatura. A média de temperatura dos animais variou entre 36,2 e 38ºC, não mostrando diferença significativa entre os grupos (p=0,1116).

Os animais de todos os grupos apresentaram oscilação de peso durante os 14 dias de experimento. A média de peso máxima foi de 265,1 e a mínima de 208,4 gramas. Essa diferença mostrou-se significativa entre o grupo CN e ETO e o grupo CN e EO. No entanto, os grupos ETO, EO e CP apresentaram padrão semelhante.

Observou-se que, no pré-operatório, os animais mantinham uma ingestão diária de ração de 24g/dia, em média. Porém, a partir da realização das lesões no dorso houve oscilação, ficando a média em 18,5g/dia por animal.

Na avaliação do diâmetro da lesão foi observada contração da ferida a partir do 3º DPO, porém, os grupos CN e ET não tiveram essa característica. A partir do 7º DPO observou-se diminuição no diâmetro, que se acentuou no 11º e 14º dias. Os grupos ETO e EO tiveram melhor resposta em termos de contração da ferida. A maior média ao longo do experimento foi observada no grupo ET com 7,46mm e a menor foi no ETO com 5,21mm. O teste de Tukey mostrou diferença significativa entre CN e ETO, ET e ETO, bem como entre os grupos ET e EO.

O estudo macroscópico permitiu observar diferenças entre os grupos, quanto à cor da lesão. O aspecto da lesão, em relação à cor, reflete clinicamente o desenvolvimento do processo de cicatrização. A coloração amarelada indica infecção. Esses dados atribuem que os grupos tratados com a Z. tuberculosa tiveram uma quantidade menor de animais com essa característica, mostrando a atividade antimicrobiana do extrato, quer seja por via tópica e/ou por via oral, sendo que os escores obtidos no estudo histológico corroboraram esses dados.

A partir do 11º dia foi observada coloração vermelha ou rosa em 100% dos animais dos grupos CP, ET, ETO, EO e em 75% daqueles do grupo CN, indicando que iniciaram as fases de granulação e reepitelização. Nenhum animal apresentou coloração marrom que é indício de morte celular e necrose.

Os sinais flogísticos de inflamação como rubor perilesional ou hiperemia, edema e presença de exsudato não foram observados macroscopicamente em nenhum dos grupos, evidenciando que o extrato utilizado na pesquisa não provoca irritação na pele perilesional, nem na lesão cutânea. Os escores obtidos no estudo histológico também corroboraram esses dados.

Ainda, macroscopicamente, no que se refere à ocorrência de tecido de granulação, foi observado que no 3º DPO os animais do grupo ET apresentaram 100% de granulação, naqueles dos grupos CP e ETO 75% e os do grupo EO 50%. Esses achados confirmam que o grupo ET foi o que obteve melhor resposta e que, também, foi legitimada pelos escores do estudo histopatológico.

Avaliação histopatológica das lesões

Os dados histológicos foram coletados de acordo com as fases de cicatrização e organizados de acordo com os escores para quantificação. Na Tabela 3 é possível observar que as maiores médias nos escores foram obtidas pelos grupos que receberam o extrato, quer por via tópica e/ou por via oral. Essa diferença mostrou-se estatisticamente significativa entre os grupos CN e ET.

Tabela 3
Escores do estudo histopatológico das feridas infectadas pelo S. aureus

A análise das lesões dos grupos ET, ETO e EO, tratados com o extrato da Z. tuberculosa, evidenciaram achados importantes no processo de cicatrização visualizado na Figura 2. No 3º dia observou-se inflamação aguda com presença de macrófagos (2A); no 7º dia pôde-se identificar o tecido de granulação, com formação de neovascularização, fibras de colágeno e início de epitelização (2B); no 11º dia veem-se em destaque as fibras colágenas (2C).

Figura 2
(A) Fotomicrografia de ferida cutânea do extrato tópico, 3º dia pós-cirúrgico (1 macrófago, 2 inflamação aguda); (B) fotomicrografia de ferida cutânea do extrato tópico e oral, 7º dia pós-cirúrgico (3 epitelização, 4 neovascularização, 5 fibras de colágeno, 6 tecido de granulação) e (C) fotomicrografia de ferida cutânea do extrato oral 11º pós-cirúrgico (7 fibras de colágeno) (Aumento 10x, HE)

A análise histológica do fígado mostrou ausência de hepatotoxicidade em todos os grupos estudados. Na avaliação bioquímica, os dados não foram expostos por apresentarem parâmetros semelhantes de colesterol, triglicerídeo e glicose entre todos os animais do experimento, não sendo possível estabelecer correlação entre esses achados e a utilização do extrato da Z. tuberculosa.

Discussão

A terapêutica de feridas deve ser uma constante preocupação para o enfermeiro, pois ainda é um desafio cuidar de lesões cutâneas com os recursos atuais existentes. Apesar dos avanços tecnológicos, poucos têm acesso, devido ao alto custo e à limitação aos grandes centros urbanos( 1111. Lima ACB, Guerra DM. Avaliação do custo do tratamento de úlceras por pressão em pacientes hospitalizados usando curativos industrializados. Ciênc Saúde Coletiva. 2011;16(1):267-77. ). Estudos mostram que a utilização de plantas torna-se uma necessidade para a ampliação do arsenal terapêutico nessa área e na redução dos recursos dispensados para o tratamento( 1212. Majewska I, Gendaszewska-Darmach E. Proangiogenic activity of plant extracts in accelerating wound healing - a new face of old phytomedicines. Acta Biochim Pol. 2011;58(4):449-60. ). No presente estudo, o extrato etanólico bruto da Z. tuberculosa mostrou atividade antimicrobiana in vitro para S. aureus, atóxico pelo teste com a Artemia salina e in vivo atuou como cicatrizante de feridas excisas infectadas em ratos, sendo esses dados promissores para a continuação de estudos que possam elucidar o mecanismo de ação do extrato, uma vez que esse patógeno é responsável pela maioria das infecções do sistema tegumentar, e resistente a grande parte dos antimicrobianos utilizados na clínica( 1010. Moura JP, Pimenta FC, Hayashida M, Cruz EDA,Canini SRMS, GirE. Colonization of Nursing Professionals byStaphylococcus aureus. Rev. Latino-Am. Enfermagem. 2011;19(2):325-31. ).

No experimento in vivo, a temperatura dos animais sofreu pouca alteração, não chegando a ultrapassar 38ºC. Mesmo com infecção local, comprovada por cultura das lesões, os animais não tiveram repercussões sistêmicas. A elevação observada se deve ao próprio mecanismo de cicatrização, que leva ao aumento da vascularização pela resposta inflamatória local, aumentando, assim, a temperatura corporal( 1313. Carvalho LHJúnior, Santos RL, Mendonça CJA, Campos CT, Andrade MAP. Evalution of skin temperature, reactive c protein, and hemosedimentation speed variation in uncomplicated primary knee total arthroplasty. Acta Ortop Bras. 2006;14(3):161-4. ).

A aferição do peso é um parâmetro nutricional importante em vários estudos experimentais, estando relacionado a alterações cicatriciais( 1414. Ono MCC. Influência de dieta imunomoduladora na cicatrização cutânea em ratos [dissertação de mestrado]. Santa Catarina (PA):Universidade Federal do Paraná; 2009. ). A diferença de peso pode estar diretamente relacionada à diminuição na ingestão diária de ração. Como também pela manipulação diária, com curativos e biopsias realizadas no 3º, 7º, 11º e 14º dias.

A associação da perda de peso ao próprio processo inflamatório foi descrito em estudo afirmando que a inflamação produz citocinas inflamatórias e Fator de Necrose Tumoral (FNT), que agem como mediadores da inflamação e da imunidade( 66. Vieira AP, Santos NR, Borges JHS,Vicenzi MPA, SchmitzWO. Flavonoid action in second intention healing in surgically-induced clean wounds in Wistar rats. Semina Cienc Biol Saude. 2008;29(1):65-74. ). Com os níveis séricos de FNT elevados, há estimulação na produção de uma proteína chamada leptina, cuja elevação está relacionada com a sensação de saciedade. Níveis aumentados dessa proteína induzem o organismo ao gasto energético e à uma diminuição no consumo de alimento, causando falta de apetite e, consequentemente, perda de peso.

A coloração, como parâmetro de avaliação das condições das feridas, demonstrou que essas apresentaram evolução clínica dentro do previsto para cada etapa da cicatrização. Nos grupos tratados, houve predomínio da coloração rósea, que é característica da epitelização, sendo essa a fase final do reparo tecidual. Esses dados legitimaram os achados quando foram utilizados o creme de barbatimão e ipê-roxo em feridas em ratos( 1515. Coelho JM, Antoniolli AB, Silva DN,Carvalho TMMB,Pontes ERJC,Odashiro AN. Effects of silver sulfadiazine, ipê roxo (Tabebuia avellanedae) extract and barbatimão (stryphnodendron adstringens) extract on cutaneous wound healing in rats. Rev Col Bras Cir. 2010;37(1):45-51. ) e diferiram do estudo com gel e o extrato glicólico da folha da goiabeira (Psidium guajava L.) não se conseguindo observar diferença significativa entre os grupos tratados e o que utilizou solução salina( 1616. Okamoto MKH. Estudo das atividades cicatrizante e antimicrobiana do extrato glicólico e gel de Psidium guajava L. e estudo da estabilidade do gel [tese de doutorado] . São Paulo (SP): Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo; 2010. ).

De forma macroscópica, o fechamento total das lesões não ocorreu, em todos os grupos, ao longo dos 14 dias de experimento. Porém, houve redução significativa do diâmetro dos animais tratados, dado confirmado pela presença de reepitelização nos cortes histológicos. Em animais de pele menos aderida aos planos profundos (como os ratos), a contração pode chegar de 80 a 90% de fechamento das lesões cutâneas( 1414. Ono MCC. Influência de dieta imunomoduladora na cicatrização cutânea em ratos [dissertação de mestrado]. Santa Catarina (PA):Universidade Federal do Paraná; 2009. ).

A análise histopatológica permite inferir que os grupos tratados com o extrato da Z. tuberculosa obtiveram os melhores resultados, quando comparados com os grupos controle positivo e negativo. Isso se deve à menor reação inflamatória dos grupos tratados com o extrato. Certo grau de inflamação é necessário, contudo, uma reação inflamatória elevada é prejudicial, pois pode haver comprometimento da microcirculação e ainda inibir a formação de fibroblastos( 1717. Lucena PLH, Ribas Filho JM, Mazza M, Czeczko NG,Dietz UA, Correa NetoMA, et al. Evaluation of the aroreira (Schinus terebinthifolius Raddi) in the healing process of surgical incision in the bladder of rats. Acta Cir Bras. 2006;21(2):46-51. ). A literatura também apresenta resultados semelhantes com a avaliação dos efeitos do tratamento tópico do creme à base de óleo de pequi (Caryocar coriaceum Wittm)( 1818. Batista JS, Silva AE, Rodrigues CMF, Costa KMFM,Oliveira AF, PaivaES, et al. Avaliação da atividade cicatrizante do óleo de pequi (caryocar coriaceum wittm) em feridas cutâneas produzidas experimentalmente em ratos. Arq Inst Biol. 2010;77(3):441-7. ) e com óleos essenciais de algumas espécies de Juniperus, planta tradicional na medicina popular da Turquia( 1919. Tumem I, Suntar I, Keles H, Küpeli AE. A therapeutic approach for wound healing by using essential oils of cupressus and juniperus species growing in Turkey. Evid Based Complement Alternat Med. [Internet]. 2012 [acesso 9 dez 2012]; 2012.Disponível em: http://www.hindawi.com/journals/ecam/2012/728281/abs/ doi:10.1155/2012/728281
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).

Os valores bioquímicos de animais em experimentação podem sofrer alterações, devido às condições ambientais e ao estresse induzido pelo próprio procedimento( 2020. Dantas JA, Ambiel CR, Cuman RKN,Baroni S, AmadorCAB. Valores de referência de alguns parâmetros fisiológicos de ratos do Biotério Central da Universidade Estadual de Maringá, Estado do Paraná. Acta Sci Health Sci. 2006;28(2):165-70. ). Os resultados de triglicerídeo, colesterol e glicose dos animais em estudo tiveram resultados semelhantes aos apresentados na literatura.

Conclusão

O extrato etanólico bruto da Z. tuberculosa possui ação antimicrobiana in vitro para Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus aureus. Os grupos tratados com o extrato tiveram resposta semelhante ao controle positivo no processo de cicatrização. Histologicamente, os animais tratados por via tópica tiveram quantidade maior de células para o fechamento das lesões. Esta pesquisa valida estudos anteriores com esse extrato e avança por demonstrar a potencial atividade cicatrizante da Z. tuberculosa. Isso estimula a continuação de estudos, visando identificar os princípios ativos responsáveis pela atividade farmacológica e seu mecanismo de ação no processo de cicatrização de feridas. Apontando para o desenvolvimento de um produto que possa ser utilizado de forma alternativa no reparo de feridas cutâneas infectadas.

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  • Errata


Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    Jan-Feb 2014

Histórico

  • Recebido
    14 Fev 2013
  • Aceito
    22 Ago 2013
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