Avaliação da influência da nulidade dos genótipos GSTT1 e GSTM1 na carcinogênese em cabeça e pescoço

Evaluation of the influence of GSTT1 AND GSTM1 null genotypes in head and neck carcinogenesis

ARTIGO ORIGINAL

Avaliação da influência da nulidade dos genótipos GSTT1 e GSTM1 na carcinogênese em cabeça e pescoço

Evaluation of the influence of GSTT1 AND GSTM1 null genotypes in head and neck carcinogenesis

Eny Maria Goloni-Bertollo^*; Joice Matos Biselli; Léa Carolina de Lima Corrêa; José Victor Maníglia; Andréa Regina Baptista Rossit; Mariângela Torreglosa Ruiz; Érika Cristina Pavarino-Bertelli

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar a influência dos genótipos nulos dos genes GSTT1 e GSTM1 na carcinogênese em cabeça e pescoço.

MÉTODOS: Foram avaliadas as freqüências dos genótipos nulos GSTT1 e GSTM1 pela técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) multiplex em 45 pacientes com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço e 45 indivíduos sem história de doença neoplásica. Ambos os grupos foram compostos por indivíduos fumantes pareados por sexo, idade e etnia.

RESULTADOS: O genótipo GSTT1 nulo foi encontrado em 24,4% dos pacientes e em 17,8% dos indivíduos controle

(P = 0,606), enquanto 44,4% dos pacientes e 48,9% dos indivíduos controle revelou genótipo GSTM1 nulo (P = 0,832). Não foi observada correlação entre os genótipos nulos GSTT1 e GSTM1 e os sítios primários de tumor.

CONCLUSÃO: Em nosso estudo não foi possível estabelecer a influência da nulidade dos genótipos GSTT1 e GSTM1 na carcinogênese em cabeça e pescoço.

Unitermos: Neoplasmas de cabeça e pescoço. Carcinoma de células escamosas. Polimorfismo. Tabaco. Glutationa transferase.

SUMMARY

BACKGROUND: To evaluate the influence of GSTM1 and GSTT1 null genotypes in head and neck carcinogenesis.

METHODS: The frequencies of GSTM1 and GSTT1 null genotypes were evaluated by multiplex polymerase chain reaction (PCR) in 45 patients with head and neck squamous cell carcinoma and in 45 control group individuals. Both groups were composed of smokers paired by gender, age and race.

RESULTS: The GSTT1 null genotype was found in 24.4% of the patients and 17.7% of the control group (P= 0.606), while 44.4% of the patients and 48.8% of the control group were bearers of the GSTM1 null genotype (P=0.832). No associations between GSTT1 and GSTMI null genotypes and primary tumor sites were found.

CONCLUSION: In our study, it was impossible to establish the influence of the GSTT1 and GSTM1 null genotypes in head and neck carcinogenesis.

Key words: Head and neck neoplasms. Squamous cell carcinoma. Polymorphism. Tobacco. Glutathione transferase.

INTRODUÇÃO

As neoplasias epiteliais de cabeça e pescoço são responsáveis por uma grande mortalidade em todo o mundo, constituindo a sexta causa de morte por câncer¹. O tipo histológico mais freqüente, o carcinoma de células escamosas (espinocelular), presente em mais de 90% dos casos ^2-4, é associado com o consumo de álcool e tabaco^5-8. Sabe-se que a fumaça do cigarro é uma mistura complexa de mais de 4000 substâncias, entre as quais pelo menos 40 são carcinogênicas, iniciadoras ou promotoras de tumores em animais⁹. Os níveis de seus produtos eletrofílicos lançados na circulação sangüínea dependem da atuação de enzimas envolvidas no biometabolismo, que compreende a ativação (Fase I) e detoxificação (Fase II) de compostos químicos^,9-10. Polimorfismos em genes que codificam essas enzimas podem alterar sua expressão ou função, alterando o biometabolismo de compostos carcinógenos¹¹.

Vários genes polimórficos que codificam enzimas envolvidas na biotransformação de carcinógenos têm sido associados ao desenvolvimento de câncer^12-19. Dois genes em particular, GSTT1 e GSTM1, que codificam enzimas de fase II pertencentes à família das glutationa S-transferases (GSTs), parecem relevantes para a suscetibilidade ao carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, pois atuam na detoxificação de metabólitos reativos de substâncias carcinógenas da fumaça do tabaco^{12,14,11,17,20,10,19}.

O gene GSTM1 é polimórfico na população humana com um alelo apresentando atividade nula (GSTM1) devido a uma grande deleção gênica, e dois outros funcionais (GSTM1A e GSTM1B). O gene GSTT1 é também polimórfico na população humana, podendo apresentar genótipo nulo por deleção^21,22. Indivíduos que apresentam genótipo nulo desses genes em homozigose agrupam-se no fenótipo conjugador negativo, uma vez que ocorre perda completa da atividade enzimática^23,24, enquanto os que apresentam pelo menos um alelo funcional agrupam-se no fenótipo conjugador positivo²⁵.

Desse modo, a variabilidade individual em genes relacionados aos processos de ativação e detoxificação metabólica parece crucial na suscetibilidade ao câncer de cabeça e pescoço. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência dos genótipos nulos dos genes GSTT1 e GSTM1 na carcinogênese em cabeça e pescoço.

MÉTODOS

Trata-se de um estudo caso-controle, realizado na Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, SP. Foram incluídos 45 indivíduos com carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (93,3% do sexo masculino; média de idade 57,6 ± 8,8 anos; 84,4% caucasóides) procedentes do Serviço de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço do Hospital de Base / Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto e do Instituto Arnaldo Vieira de Carvalho, SP. Todos os casos foram diagnosticados e confirmados patologicamente, e o sítio primário de tumor mais representativo foi a cavidade oral (40% dos casos). O grupo controle foi constituído por 45 indivíduos sem história de doença neoplásica (84,4% do sexo masculino; média de idade 53,9 ± 11,0 anos; 97,8% caucasóides), pareado por sexo, idade e etnia. Em relação à etnia, negros, pardos e orientais foram considerados não-caucasóides. Todos os indivíduos (pacientes e controles) eram tabagistas. Os indivíduos foram incluídos no estudo após a obtenção do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e todas as informações necessárias foram obtidas por meio de questionário padronizado para coleta de dados e mantidas em sigilo. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (CEP-FAMERP) e pelo Conselho Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP).

O DNA genômico foi extraído a partir de 5mL de sangue periférico, segundo a técnica de Abdel-Rahman e col²⁶. A amostra de sangue periférico foi colhida em tubo contendo anticoagulante (EDTA) e os linfócitos foram isolados com auxílio de Ficoll-Paque Plus. O DNA genômico foi obtido adicionando aos linfócitos isolados SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), proteinase K e RNAse A. Após purificação com NaCl, o DNA foi precipitado com etanol e armazenado a – 20ºC em tampão Tris-EDTA para posterior análise.

A análise para os genes GSTT1 e GSTM1 foi realizada simultaneamente pela reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex, segundo Abdel-Rahman e col²⁷. A amplificação da seqüência do DNA de interesse foi obtida por 35 ciclos que compreenderam etapas de desnaturação do DNA a 94ºC por 2 minutos, anelamento das seqüências iniciadoras da reação (primers) a 59ºC por 1 minuto e extensão das cadeias de DNA pela adição dos nucleotídeos a 72ºC por 1 minuto. Uma seqüência do exon 7 do gene CYP1A1 foi coamplificada como um controle interno de amplificação. Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio, sendo que o genótipo nulo (ambos alelos com deleção) para os genes GSTT1 e GSTM1 foi identificado pela ausência dos fragmentos de amplificação de 480 pares de base (pb) e 219 pb, respectivamente. A presença do fragmento de 312 pb corresponde à seqüência amplificada do gene CYP1A1 e revela o sucesso da reação de amplificação.

Para a análise estatística das freqüências dos genótipos obtidos, utilizou-se o teste Exato de Fisher, com nível de significância de 5%.

RESULTADOS

Freqüência dos polimorfismos: o genótipo GSTT1 nulo [-] foi encontrado em 24,4% (11 de 45) dos pacientes e em 17,8% (8 de 45) dos indivíduos controle (P = 0,606), e 20 (44,4%) dos 45 pacientes e 22 (48,9%) dos indivíduos controle revelaram genótipo GSTM1 nulo [-] (P = 0,832). O genótipo nulo combinado para os genes GSTT1 e GSTM1 foi observado em 8,9% (4 de 45) dos pacientes e em 6,7% (3 de 45) dos controle (P = 1,0). A combinação genotípica mais freqüente considerando a presença de um genótipo desfavorável (GST nulo) foi GSTT1 [+] / GSTM1 [-] em 35,6% (16 de 45) dos pacientes e 42,2% (19 de 45) dos controle (P = 0,757) (Tabela 1).

Os genótipos foram agrupados por sítio do tumor (Tabela 2) e não foi observada correlação com os genótipos nulos GSTT1 e GSTM1.

DISCUSSÃO

A disponibilidade de informações sobre os polimorfismos GSTT1 e GSTM1 na população brasileira é escassa. Rossit et al.²⁸, em um estudo realizado na população brasileira proveniente dos estados do Pará e São Paulo, mostraram freqüências de 18% e 47,3% para os genótipos nulos dos genes GSTT1 e GSTM1, respectivamente. Em nosso estudo, freqüências similares foram observadas para estes genótipos (24,4% e 17,8% para GSTT1 [-] para pacientes e controle, respectivamente, e 44,4% e 48,9% para GSTM1 para pacientes e controle, respectivamente).

Os estudos dos polimorfismos GSTT1 e GSTM1 realizados em carcinomas de cabeça e pescoço são contraditórios. Vários autores demonstram uma associação com o genótipo nulo [-] GSTM1^{14,13,19,29, 30,31}, enquanto outros não^5,15,32. Para o genótipo nulo [-] GSTT1 também foi demonstrada uma relação em alguns estudos^14,19,33,34 e ausência desta em outros^{5,15,28,29,31}. A combinação destes genótipos nulos e risco aumentado para este tipo de carcinoma também já foi observada^13,31. Além disso, o tempo e a quantidade de exposição a carcinógenos (álcool e tabaco) podem influenciar na interação destes genótipos ao desenvolvimento deste tipo de neoplasia^11,35, e esses dados não foram considerados em nosso estudo.

O estudo de Konig-Greger et al.³⁶ mostrou que a atividade da enzima GSTM1 encontrava-se significantemente reduzida em pacientes com carcinoma de cabeça e pescoço em relação aos controle, mas não foi dependente do genótipo desfavorável GSTM1, o que pode sugerir a participação de outras enzimas em sua regulação.

Curiosamente, Evans et al.¹² encontraram que o genótipo positivo [+] GSTT1 está associado ao risco de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço entre os tabagistas (OR = 1,6; CI 95% = 1,1-2,5) e sugerem que o genótipo nulo [-] GSTT1 pode proteger o indivíduo do desenvolvimento deste tipo de câncer. Embora usualmente as GSTs sejam consideradas enzimas de detoxificação, para alguns substratos químicos em particular, como por exemplo o diclorometano (DCM), a conjugação da glutationa com a enzima GSTT1 pode resultar em ativação de um componente eletrofílico com conseqüente potencial mutagênico^37,38.. Embora o DCM não esteja associado com tabaco, podem existir outros bioprodutos do tabaco que ganhem função carcinogênica pela ativação mediada da enzima GSTT1. Dois outros estudos também mostraram risco aumentado de doença coronária e vascular periférica em tabagistas com genótipo GSTT1 [+]^39,40.

CONCLUSÃO

Em nosso estudo não foi possível estabelecer a influência da nulidade dos genótipos GSTT1 e GSTM1 na carcinogênese em cabeça e pescoço.

Conflito de interesse: não há

Artigo recebido: 18/05/2005

Aceito para publicação: 19/05/2006

Trabalho realizado na Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP e no departamento de Biologia da Unidade de Pesquisa em Genética e Biologia Molecular, UPGEM São José do Rio Preto, SP

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Correspondência: Av. Brigadeiro Faria Lima, 516 Cep: 15090-000, São José do Rio Preto, SP

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Dez 2006
• Data do Fascículo
  Out 2006

Histórico

• Aceito
  19 Maio 2006
• Recebido
  18 Maio 2005