Histomorfometria da mama de ratas tratadas com estrogênio e/ou progestagênio

Resumos

OBJECTIVE: To evaluate the breast histomorphometric changes in rats treated with estrogen and/or progestogen for a short period of time. METHODS: Forty oophorectomized rats were divided into four groups: GC, vehicle; GE, treated with estradiol benzoate (37.6 mg/animal); GP, treated with medroxyprogesterone acetate (11.2 mg/animal) and GEP, treated with estradiol benzoate (37.6 mg/animal) plus medroxyprogesterone acetate (11.28 mg/animal). In GE group, estradiol was administered subcutaneously for seven days; in GEP group, estradiol was administered once in a day for the first seven days and the progestogen over the next 23 days both subcutaneously. Twenty-four hours after the last hormone administration, the animals were killed upon deep anesthesia and the first inguinal breasts were removed, fixed in 10% formaldehyde and processed to be included in paraffin, with the sections being stained by hematoxylin-eosin. Morphology and the area occupied by mammary parenchyma were assessed, with the data undergoing analysis of variance followed by the Kruskal-Wallis test (p < 0.05). RESULTS: The control group breasts were found atrophic and, in GE and GEP group animals, typical alveoli with secretion inside are present; in progestogen-treated animals (GP), alveoli formed by large cells occupying almost the entire alveolar lumen are noted. Morphometric analysis showed a larger mammary parenchyma area in hormone-treated animals (GE = GP > GEP > GC; p < 0.05). CONCLUSION: Estradiol and progestogen had a proliferative effect on mammary parenchyma. However, prior estradiol administration changes the progestogen action on rat mammary tissue.

Breast; rats; estradiol; medroxyprogesterone 17-acetate; hormone replacement therapy

ARTIGO ORIGINAL

Histomorfometria da mama de ratas tratadas com estrogênio e/ou progestagênio

Sueli Maria Preda dos Santos Torres^I; Ricardo Santos Simões^II; Maria Cândida Pinheiro Baracat^III; Regina Célia Teixeira Gomes^IV; José Maria Soares Júnior^V; Adriana Aparecida Ferraz Carbonel^IV; Edmund Chada Baracat^VI

^IProfessora do Centro Universitário Lusíada - UNILUS; Mestrado pelo Departamento de Morfologia e Genética da Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina - UNIFESP- EPM; Professora do Centro Universitário Lusíada - UNILUS, São Paulo, SP

^IIMédico-assistente do Hospital Universitário da Universidade de São Paulo - HU-USP; Doutorando da Disciplina de Ginecologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - FMUSP; Médico-assistente do Hospital Universitário da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP

^IIIAluna de Iniciação Científica da Disciplina de Histologia e Biologia Estrutural da UNIFESP - EPM, São Paulo, SP

^IVMestrado em Ciências da Saúde; Doutoranda do Departamento de Morfologia e Genética da UNIFESP - EPM, São Paulo, SP

^VProfessor Associado e Livre-docente do Departamento de Ginecologia da UNIFESP-EPM, São Paulo, SP

^VIProfessor Titular da Disciplina de Ginecologia da FMUSP, São Paulo, SP

^{Correspondência para}

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar as alterações histomorfométricas nas mamas de ratas tratadas com estrogênio e/ou progestagênio por curto período de tempo.

MÉTODOS: Foram divididas em quatro grupos 40 ratas ooforectomizadas: GC-recebeu veículo; GE-recebeu benzoato de estradiol (37,6 µg/animal); GP-recebeu acetato de medroxiprogesterona (11,28 mg/animal) e, GEP-recebeu benzoato de estradiol (37,6 µg/animal) e acetato de medroxiprogesterona (11,28 mg/animal). No grupo GE, o estradiol foi administrado durante sete dias, por via subcutânea. Já no grupo EP o estradiol foi administrado nos primeiros sete dias e o progestagênio por mais 23 dias, por via subcutânea. Vinte e quatro horas após a última administração dos hormônios, os animais foram anestesiados e o primeiro par de mamas inguinais removido, imerso em formaldeído a 10% e processado para inclusão em parafina, sendo os cortes corados pela Hematoxilina-Eosina. Foram avaliadas a morfologia e a área ocupada pelo parênquima mamário, sendo os dados submetidos à análise de variância complementado pelo teste de Kruskal-Wallis (p < 0,05).

RESULTADOS: As mamas no grupo-controle apresentaram-se atrofiadas, sendo que, nos animais dos grupos GE e GEP, nota-se a presença de alvéolos típicos contendo secreção no seu interior, já nos animais tratados somente com progestagênio (GP) notam-se alvéolos formados por células volumosas que ocupam praticamente todo o lúmen alveolar. A morfometria mostrou haver maior área de parênquima mamário nos animais tratados com hormônios (GE = GP > GEP > GC; p < 0,05)

CONCLUSÃO: O estradiol e o progestagênio apresentaram efeito proliferativo no parênquima mamário. No entanto, a administração prévia de estradiol modifica a ação do progestagênio no tecido mamário da rata.

Unitermos: Mama; ratos; estradiol; 17-Acetato de medroxiprogesterona; terapia de reposição hormonal.

Introdução

A passagem do período reprodutivo para o não reprodutivo nas mulheres, conhecido como climatério, é marcada por importantes alterações endócrinas, somáticas e psíquicas, devido à diminuição da produção de hormônios ovarianos. Esse período tem como marco a menopausa, isto é, a data da última menstruação por mais de 12 meses^1,2.

Para a maioria das mulheres, nessa fase podem ocorrer sintomas como as ondas de calor, sintomas neuropsíquicos e secura vaginal, dentre outros^3,4.

A terapia hormonal (TH) substitutiva pode proporcionar diversos benefícios para as mulheres, sobretudo na pósmenopausa, mostrando-se eficaz para aliviar os principais sintomas resultantes do hipoestrogenismo^5-7.

Contudo, há relatos de ocorrência de efeitos adversos a longo prazo com o emprego da terapia estroprogestativa, em especial quanto ao aumento do risco de câncer mamário⁸. De fato, vários estudos epidemiológicos têm relatado risco aumentado de câncer de mama, sendo o risco maior com o uso de estrogênios associados aos progestagênios do que com estrogênios isolados⁹.

A mama é uma estrutura que apresenta respostas variáveis aos hormônios esteroides. Sua interação hormonal é complexa; os esteroides sexuais podem atuar por via autócrina, parácrina e endócrina. Sob ação desses hormônios esteroides, o tecido mamário atinge seu desenvolvimento máximo^10,11. A ação dos hormônios nos órgãos-alvo é decorrente da sua ligação com os receptores intracelulares, modulando a expressão dos genes e, consequentemente, a síntese de proteínas específicas¹².

Há evidências de que os estrogênios estimulam o crescimento ductal^13,14. No entanto, para alguns, os estrogênios produzem atrofia do epitélio mamário¹⁵. A adição de progestagênios à terapia estrogênica não reduz o risco de câncer de mama. Há evidências de que essa associação poderia aumentar a proliferação celular epitelial da mama¹⁶.

Contudo, questiona-se se o tratamento agudo com estrogênios ou progestagênios isolados ou associados altera o padrão de proliferação mamária. Portanto, este trabalho tem como objetivo avaliar os efeitos histomorfológicos e morfométricos da terapia com estrogênios e/ou progestagênios no tecido mamário de ratas adultas castradas.

Métodos

Foram utilizadas 40 ratas da linhagem EPM-1 Wistar (Rattus norvegicus albinus), adultas, com 90 dias de idade, virgens, fornecidas pelo Centro de Desenvolvimento de Modelos de Experimentação (CEDEME) da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM). Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP/EPM (parecer nº 0820/07).

Os animais foram mantidos confinados em gaiolas plásticas, no biotério da Disciplina de Histologia e Biologia Estrutural (UNIFESP/EPM), com temperatura ambiente controlada a 22ºC e iluminação artificial, obtida com lâmpadas fluorescentes, sendo o fotoperíodo de 12 horas claro (7 h - 19 h) e 12 horas escuro (19 h - 7 h), com alimentação e água adlibitum.

Após um período de sete dias, todos os animais foram submetidos à ooforectomia bilateral e, após 30 dias, divididos aleatoriamente em quatro grupos constituídos por 10 ratas cada, a saber: GC - animais que receberam óleo de milho (veículo); GE - animais que receberam benzoato de estradiol (37,6 µg/animal), por via subcutânea, durante sete dias consecutivos; GP - animais que receberam acetato de medroxiprogesterona (11,28 mg/animal), por via subcutânea, durante 23 dias consecutivos; GEP - animais que receberam benzoato de estradiol (37,6 µg/animal) durante sete dias e, em seguida, acetato de medroxiprogesterona (11,28 mg/animal), por mais 23 dias consecutivos. Os hormônios foram administrados em doses análogas às usadas em mulheres pós-menopáusicas¹⁷.

Vinte e quatro horas após a última administração, todos os animais foram anestesiados com mistura de xilazina (20 mg/kg) e cetamina (100 mg/kg), por via intraperitoneal e removidas as mamas do primeiro par da região inguinal. Em seguida, as mamas foram imersas em formaldeído a 10% e após fixação (24 horas) processados para inclusão em parafina segundo os métodos histológicos de rotina. Dos blocos foram obtidos cortes seriados de 4 µm (micrótomo LEICA - RM 2145) que foram corados pela hematoxilina e eosina para posterior análise histomorfológica e morfométrica. Para a análise morfométrica, foi determinada a área ocupada pelo tecido mamário e pelo adiposo. Foi utilizado sistema de captura de imagens, constituído por microscópio de luz (Carl Zeiss), adaptado a uma câmera de alta resolução (AxioCam - MRC da Carl Zeiss) e monitor de vídeo colorido (Samsung). As imagens obtidas foram avaliadas pelo programa de análise de imagens AxionVision REL 4.6 da Carl Zeiss. Para tanto, foi delimitada a área ocupada pelo parênquima mamário e pelo tecido adiposo em uma área de 380.10³ µm² em cada corte. Foram avaliados quatro cortes semisseriados em cada animal do experimento, sendo avaliada uma área total 152 x 10 ⁵ µm² em cada grupo de estudo.

Para a análise dos resultados obtidos, utilizou-se a análise de variância (ANOVA) e o teste Kruskal-Wallis. As análises foram efetuadas empregando-se o programa de computador Prizma® (Califórnia, Estados Unidos da América) e Excel® (Microsoft). Em todos os testes estatísticos foram utilizados níveis de significância igual a 5% (α < 0,05).

Resultados

A) Histomorfológicos: a mama dos animais pertencentes ao grupo-controle (GC) mostrou grande concentração de tecido adiposo e parênquima escasso onde foi possível identificar raros ductos e alvéolos rudimentares (Figura 1A). No interior destes últimos, podem-se identificar macrófagos contendo pigmento amarelado no seu interior. Já no grupo tratado com estradiol (GE), observou-se parênquima bem mais desenvolvido, com a presença de ductos e alvéolos bem dilatados, a maioria apresentando material eosinófilo (secreção) em seu interior (Figura 1B).

No grupo medicado com progesterona isoladamente (GP), notamos no parênquima mamário inúmeras figuras de mitose, sendo que as células achavam-se dispostas em arranjos irregulares. Os ductos apresentavam-se revestidos por epitélio cilíndrico simples ou estratificado, sendo rodeados por tecido conectivo denso. Já os alvéolos estavam revestidos por epitélio cúbico simples, cujos núcleos esféricos encontravam-se deslocados para a região basal, e com citoplasma eosinófilo. Não foi identificada a presença de secreção no interior dos ductos e/ou dos alvéolos (Figura 1C).

No grupo tratado com estradiol e medroxiprogesterona (GEP), o aspecto histológico era muito parecido com o do grupo tratado apenas com estrogênio, ou seja, achavam-se constituídas por ductos e alvéolos dilatados contendo secreção no seu interior. Nesse grupo (GEP), notamos que os alvéolos possuíam menor tamanho e a secreção presente no lúmem dos alvéolos era mais rarefeita (Figura 1D).

B) Morfometria: os dados obtidos com relação à área dos parênquimas mamários das ratas pertencentes aos vários grupos de estudo estão expressos na Tabela 1.

Discussão

As informações quanto aos riscos e benefícios da reposição hormonal na pós-menopausa geram dúvidas e inseguranças. Apesar das pesquisas quantitativas sobre os sinais e sintomas, os aspectos psicossociais e do uso do tratamento hormonal, há poucas informações sobre o significado pessoal e a visão da experiência de mulheres brasileiras sobre esses temas.

O presente trabalho tentou reproduzir os efeitos dessa terapia hormonal usando doses de estrogênio e de progestagênio equivalentes às habitualmente utilizadas na reposição hormonal em mulheres na pós-menopausa. Para tanto, foi realizado um cálculo halométrico, equacionando a dose de acordo com o peso e o metabolismo animal dos ratos¹⁷.

Com as dosagens hormonais utilizadas, nossos resultados mostraram haver menor área de parênquima mamário e de proliferação nos animais ooforectomizados e que não receberam hormônios. No entanto, foi detectada maior quantidade de parênquima mamário nos animais tratados com estradiol ou medroxiprogesterona isoladamente com relação ao grupo que recebeu, no início, estradiol e, posteriormente, medroxiprogesterona.

Nos animais que receberam estradiol (por todo o período do experimento ou nos primeiros dias do tratamento hormonal), notamos a presença de alvéolos contendo secreção no seu interior. Tal fato decorreria da liberação de prolactina pela hipófise sob ação estrogênica; haveria ainda inibição da secreção de gonadotrofinas^18-20.

De fato, nossos resultados corroboram estudos de biópsias de mamas de mulheres na pós-menopausa, que demonstraram haver maior proliferação no epitélio em usuárias da TH, quando comparadas a um grupo de não usuárias de hormônios^21,22. Nesses mesmos estudos, verificou-se que a maioria das alterações localizava-se na unidade ductolobular terminal, onde se desenvolve a maior parte dos tumores de mama.

Estudos experimentais também comprovaram alterações proliferativas nas mamas de camundongas tratadas com 17-betaestradiol²³. Sabe-se que parte das pacientes refere sintomas relacionados à glândula mamária na fase pré-menstrual, como mastalgia, aumento de volume da consistência das mamas à palpação, resultantes da ação dos estrogênios. Esses fenômenos devem-se, provavelmente, ao estímulo trófico que ocorre no tecido fibroglandular atrófico da pós-menopausa²⁴. As mulheres na pré-menopausa têm tendência a apresentar maior quantidade de tecido ductoglandular e fibroso nas mamas, comparativamente ao tecido adiposo. Essa relação se inverte com o transcorrer do tempo, chegando a uma substituição por tecido adiposo quase que completa na pós-menopausa²⁵.

Em nosso experimento, o que chamou a atenção foi o fato de a mama de ratas ter comportamento morfológico diferente nos animais que receberam no início estradiol e posteriormente medroxiprogesterona, diferentemente dos animais tratados somente com medroxiprogesterona. O progestagênio isoladamente induziu ao aumento do parênquima mamário, sem, no entanto, a formação de alvéolos típicos. Já nos animais previamente tratados com estradiol, esse comportamento foi bem diferente, pois os alvéolos mostraram-se mais regulares. Esses dados estão em consonância com os obtidos com as técnicas de biologia molecular e proteômica, que mostram a necessidade de haver uma ativação sequencial na sinalização hormonal sobre o epitélio mamário para a progressão da morfogênese, ou seja, da formação dos alvéolos mamários²⁶.

No que diz respeito à associação dos hormônios sexuais e câncer de mama antes da menopausa, sua pesquisa é extremamente difícil e acha-se prejudicada pela grande flutuação dos níveis hormonais que ocorre durante o ciclo menstrual. Não se demonstrou claramente haver relação entre o risco de câncer de mama e os níveis de estrogênio em mulheres pré-menopáusicas, possivelmente porque estão constantemente acima do limite necessário para estimular o crescimento do câncer de mama²⁷. Já a relação de reposição hormonal, em mulheres na pósmenopausa, em curto prazo, com o desenvolvimento do câncer de mama é incerta com base em vários estudos com resultados inconsistentes. Entre os estudos que indicam aumento do risco, o risco é essencialmente limitado a longo prazo (> 5-10 anos), e o risco é relativamente pequeno (RR 1,2-1,5)²⁸.

Assim, novas pesquisas nessa linha devem ser realizadas com a finalidade de esclarecer a relação do câncer de mama com a dose e a duração do tratamento hormonal na pós-menopausa.

Conclusão

O estradiol e a medroxiprogesterona apresentam efeito proliferativo no parênquima mamário; no entanto, a administração prévia de estradiol modifica a ação do progestagênio no tecido mamário de ratas adultas.

Agradecimentos

Ao Professor Associado Manuel de Jesus Simes do Departamanento de Morfologia e Genética da Universidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM).

Artigo recebido: 29/09/2010

Aceito para publicação: 25/01/2011

Suporte Financeiro: CAPES e CNPq

Conflito de interesses: Não há.

Trabalho realizado no Departamento de Ginecologia da UNIFESP e no Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da FMUSP, São Paulo, SP

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Maio 2011
• Data do Fascículo
  Abr 2011

Histórico

• Recebido
  29 Set 2010
• Aceito
  25 Jan 2011