Diagnóstico laboratorial de micoses superficiais e cutâneas: comparação dos métodos do hidróxido de potássio e do calcofluor white

Laboratory diagnosis of superficial and cutaneous mycosis: a comparison of the potassium hydroxide and calcofluor white methods

INVESTIGAÇÃO CLÍNICA, LABORATORIAL E TERAPÊUTICA

Diagnóstico laboratorial de micoses superficiais e cutâneas: comparação dos métodos do hidróxido de potássio e do calcofluor white^*

Laboratory diagnosis of superficial and cutaneous mycosis: a comparison of the potassium hydroxide and calcofluor white methods^*

Keith Werneck Brasil^I; Rosângela Lameira Pinheiro^II; Ida Chapaval Pimentel^III

^IBióloga/UFPR; Micologista pela Universidade de Buenos Aires

^IIMestre em Educação e Saúde/UFPR; Bióloga Micologista do Hospital de Clínicas da UFPR

^IIIDoutora em Processos Biotecnológicos; professora adjunta da UFPR/Departamento de Patologia Básica

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTOS: As micoses superficiais e cutâneas têm surgido com grande prevalência no Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná.

OBJETIVOS: Avaliar o método do calcofluor white (CFW) mediante comparação com o método do hidróxido de potássio (KOH).

MÉTODOS: Foram analisadas 74 amostras de raspados de pele, unha, couro cabeludo e cabelo de 62 pacientes de ambos os sexos em diferentes idades. O material foi coletado nos Ambulatórios de Dermatologia, Dermatopediatria e Pronto Atendimento do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná, entre outubro de 1995 e março de 1996. Os espécimes foram analisados por ambos os métodos e comparados no presente trabalho. Os resultados obtidos foram submetidos à análise estatística do Qui-quadrado.

RESULTADOS: Os resultados obtidos indicaram o CFW tão efetivo quanto o KOH. O hidróxido de potássio apresentou 38 (51%) resultados positivos e 36 (49%) negativos. O calcofluor white foi positivo em 35 (47%) amostras e negativo em 39 (53%).

CONCLUSÃO: Os dados revelaram igual eficácia entre os métodos avaliados; no entanto, o método do calcofluor white necessita de um laboratório equipado com microscópio de imunofluorescência.

Palavras-chave: corantes fluorescentes; diagnóstico; métodos; micoses; Microscopia de fluorescência.

SUMMARY

BACKGROUND: Superficial and cutaneous mycosis have appeared with great prevalence at the Clinical Hospital of the Parana State Federal University.

OBJECTIVES: To evaluate the calcofluor white method (CFW) in comparison with the potassium hydroxide method (KOH).

METHODS: 74 samples of skin, nail, scalp and hair scrapings were analyzed in 62 male and female patients of different ages. The material was collected at the Dermatology, and Dermatopediatric Clinics and Emergency Department of the Federal University of Parana State Clinical Hospital from October 1995 to March 1996. The specimens were analysed by both methods, and compared in this study. The results were submitted to Qui-square statistical analysis.

RESULTS: The results obtained indicated CFW was as effective as KOH. Potassium hydroxide showed 38 (51%) positive and 36 (49%) negative results. Calcofluor white showed positive results in 35 (47%) samples and negative results in 39 (53%) samples.

CONCLUSION: The data revealed equal efficiency in the two methods evaluated. On the hand, the calcofluor white method requires a laboratory equipped with an immunofluorescence microscope.

Key words: fluorescent dyes; diagnostic; methods; mycoses; Microscopy, fluorescence.

INTRODUÇÃO

As micoses superficiais e cutâneas têm surgido com grande prevalência nos ambulatórios de Dermatologia, Dermatopediatria e no Pronto Atendimento do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná.

O exame micológico direto de espécimes com suspeita de micose fornece resultados anteriores às culturas, que podem levar dias ou semanas.¹ Essas informações, em conjunto com a anamnese, auxiliam o clínico a instituir o tratamento adequado e precocemente. O hidróxido de potássio (KOH) é um reativo que clarifica e digere o material clínico; no entanto, a presença de elementos fúngicos requer tempo e experiência,¹ pois não há contraste entre restos celulares e elementos fúngicos (Figura 1). O calcofluor white (CFW) é um agente clareador amplamente utilizado nas indústrias têxteis e de papel, que se liga naturalmente à celulose e à quitina.^1-5 Desde 1984 vem sendo empregado em laboratórios de patologia e microbiologia clínica como uma coloração não específica para fungos em amostras clínicas.⁴ O CFW quando adicionado ao KOH em partes iguais cria uma solução que clarifica debris celulares e cora os elementos fúngicos quando observados em microscópio de fluorescência, facilitando a interpretação dos resultados⁷ (Figura 2). Esse método é considerado rápido, de fácil leitura, e um dos mais específicos e sensíveis.^1-5 O uso desse fluorocromo não se restringe ao diagnóstico de micoses superficiais e cutâneas; ele vem sendo amplamente utilizado em estudos de micoses sistêmicas e oportunísticas,⁸ bem como marcador no estudo de biologia molecular de fungos.⁹

MATERIAL E MÉTODOS

Foram analisadas 74 amostras de raspado de pele, unha, couro cabeludo e cabelo em 62 pacientes de ambos os sexos em diferentes idades. O material foi coletado nos Ambulatórios de Dermatologia, Dermatopediatria e Pronto Atendimento do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná. As 74 amostras que foram analisadas no Laboratório de Micologia do referido hospital representaram o número total de espécimes enviados ao Laboratório com suspeita de micoses superficiais e cutâneas no período de outubro de 95 a março de 96. Os pacientes ainda não estavam em tratamento. Pequenas porções de cabelos e ou escamas foram suspensas em uma gota de KOH 40% em lâmina para microscopia e cobertas por lamínula. As lâminas foram observadas em microscópio ótico (Olympus CBA, lâmpada alógena 6V e 10W), sob o aumento de 20 e 40 vezes após aproximadamente 15 minutos de seu preparo (tempo necessário para o clareamento dos restos celulares). A solução de calcofluor white foi feita com a diluição de 0,1g de CFW M2R (C.I. 40622; Sigma Chemical) e 0,05g de azul de Evans (Sigma) em 100ml de água destilada; o azul de Evans age como um corante de contraste para o CFW. Uma pequena porção da amostra clínica foi misturada a uma gota de KOH 40% e uma gota de CFW em lâmina para microscopia em seguida cobertas com lamínula. Após um período de 10 a 20 minutos as lâminas foram observadas em microscópio de imunofluorescência (Olympus CBA, luz ultravioleta, filtro 490nm, barreira 530). Os resultados positivos foram definidos pela presença de estruturas fúngicas, como células leveduriformes, hifas, pseudo-hifas e artroconídios. Em microscopia de fluorescência as estruturas fúngicas aparecem em coloração verde-maçã.

Os dados obtidos pelos exames laboratoriais foram quantificados em porcentagem e comparados pelo teste do Qui-quadrado (c² = S (d ²/esp); Karl Pearson),¹⁰ estabelecendo um nível de significância de 5%.

RESULTADOS

Entre as 74 amostras analisadas por ambos métodos 38 (51%) apresentaram resultados positivos e 36 (49%) negativos para o KOH; para o CFW 35 (47%) positivos e 39 (53%) negativos.

Não ocorre diferença estatisticamente significante entre as técnicas comparadas em relação aos resultados positivos ou negativos (Qui-quadrado 0,24, 1gl, p=0,05) (Tabela 1), pois o valor do qui-quadrado calculado (0,24) é menor (não significativo) do que o valor do qui-quadrado tabelado (3,84) para o grau de liberdade 1 no nível de probabilidade de 5% (0,05).

DISCUSSÃO

A identificação de estruturas fúngicas em amostras com suspeita de micose é técnica que requer considerável experiência.⁵ O exame micológico direto é comumente realizado com hidróxido de potássio. Lamentavelmente resultados falso-negativos podem ocorrer.^3,4 Não há contraste entre o fungo e debris celulares.² As amostras podem conter uma quantidade pequena de estruturas fúngicas, fato esse que dificulta ao examinador observar essas estruturas e distingui-las dos artefatos⁴ produzidos pela ação do KOH em materiais proteináceos.¹ Honig⁴ reporta que ocorre uma diminuição de resultados falso-negativos quando o exame de KOH é realizado por um profissional com experiência.

O calcofluor white vem sendo estudado no diagnóstico laboratorial de micoses e considerado método simples, rápido, altamente sensível e específico. As preparações são lidas mais rapidamente e com baixo risco de erro.^1-2,5-6 O CFW facilita a identificação de estruturas fúngicas, mesmo quando em pequenas quantidades,^11,12 e exige menos experiência do observador.^1,4

Em 1984 Hageage e Harrington desenvolveram estudo sobre o uso do CFW em micologia clínica. Adicionaram CFW ao KOH 10% em exames a fresco e em exames histopatológicos de amostras com suspeita de micose. Concluíram que o calcofluor white é o método mais simples e rápido para detecção de fungos em espécimes clínicos.

Monheit,⁸ em pesquisa realizada sobre a detecção de fungos em tecidos usando calcofluor white e microscópio de fluorescência, conclui que o calcofluor é tão efetivo quanto os outros métodos comumente utilizados, tais como Gomori Methenamine Silver (GMS), Periodic Acid-Schiff (PAS) e Hematoxilin-Eosin (HE).

Haldane e Robart¹ em 1990 analisaram 207 amostras de micoses superficiais. Nesse trabalho para dermatófitos, o calcofluor teve sensibilidade de 92% e especificidade de 95%. O hidróxido de potássio teve sensibilidade de 88% e especificidade de 95%. Os autores concluem que o CFW e o KOH são similarmente efetivos na detecção de dermatófitos com valores preditivos similares de positividade e negatividade. Os autores sugerem que sejam realizadas mais investigações sobre a identificação de leveduras com o CFW, pois ocorreram casos de resultados falso-positivos. Esses resultados de microscopia falso-positivos podem ocorrer pela presença de artefatos, pela distribuição desigual de fungos na amostra ou se o fungo presente não for viável ou cultivável. A aplicação do calcofluor white seria vantajosa em laboratórios com rotatividade de profissionais, onde não há possibilidade de se adquirir e manter experiência com o hidróxido de potássio. Os autores sugerem que para micoses superficiais o calcofluor white seja reservado para fungos filamentosos ou fungos que possam ser identificados morfologicamente. Honig⁴ confirma os resultados de Haldane e Robart em estudo com calcofluor white no diagnóstico de tinea capitis, obtendo como resultados positivos 76% e negativos 10% para o teste do CFW em culturas positivas. O autor conclui que a técnica do calcofluor white exige um laboratório equipado com microscópio de fluorescência, equipamento que normalmente não consta em laboratórios de microbiologia.

Em recente pesquisa bibliográfica pode-se verificar que o calcofluor white continua a ser estudado, porém com enfoque em infecções fúngicas sistêmicas e oportunísticas. Outros trabalhos vêm sendo realizados com o CFW como marcador molecular, no estudo da estrutura de parede dos fungos.⁹

Essas pesquisas encorajaram a realização do presente trabalho a fim de avaliar o uso do calcofluor white no diagnóstico laboratorial de micoses superficiais e cutâneas no referido laboratório.

Nesta pesquisa o CFW mostrou-se igualmente efetivo ao KOH com valores positivos e negativos muito próximos. Esse resultado corrobora os trabalhos referidos.

CONCLUSÃO

Os autores concluem que os métodos avaliados são igualmente efetivos. A experiência do observador com o método do hidróxido de potássio fez com que o calcofluor se mostrasse igual ao KOH, não havendo vantagens em se adotar essa técnica na rotina do laboratório.

Adicionalmente, para a maioria dos laboratórios de micologia do país, a implantação do método do CFW seria desvantajosa devido à necessidade da obtenção de um microscópio de fluorescência.

Recebido em 17.01.2003

Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 04.07.2003

* Trabalho realizado no Hospital de Clínicas - Universidade Federal do Paraná

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• 3. Sparks AQH, Werret GF, Stokes CR, Gruffydd-Jones TJ. Improved sensitivity in the diagnosis of dermatophytosis by fluorescence microscopy whith calcofluor white.Vet Rec 1994; 134: 307-8.
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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Nov 2003
• Data do Fascículo
  Out 2003

Histórico

• Aceito
  04 Jul 2003
• Recebido
  17 Jan 2003