Expressão das citoceratinas em dermatoses infecto- parasitárias associadas à hiperplasia epidérmica

Resumos

BACKGROUND: Cytokeratins (K) are the major structural proteins of epithelial cells and they display the greatest heterogeneity of all intermediate filament proteins. The study of many isolated cytokeratins by immunomarcation enables the structural verification of the cytoskeleton in many neoplastic and inflammatory diseases. OBJECTIVE: To verify the immunohistochemical pattern of cytokeratin expression in infectious and parasitic diseases associated with squamous hyperplasia. METHODS: Histological sections obtained from formalin-fixed and paraffin-embedded tissue from cromomycosis, paracoccidioidomycosis, leishmaniasis and condylomata acuminata lesions were marked with the DEK10, LL025, LL002 and AE1 antibodies by the immunoperoxidase technique (avidina-botina). RESULTS: Different degrees of epidermal hyperplasia were observed predominantly or exclusively in the following four diseases: absence of immunoreactivity to DE-K10 in areas of intense epidermal hyperplasia and delayed K10 immunohistochemical staining in areas of moderate to discreet/absent hyperplasia; superbasal expression pattern for K16, regardless of the degree of hyperplasia as well as superbasal epitops discharging for LL002 (C14) and AE1 (C10, 14, 16, 19). CONCLUSIONS: The modifications indicate that regardless of the nature of the etiologic agent and degree of hyperplasia, changes in keratinocyte differentiation and proliferation may occur.

epidermis; hyperplasia; keratin

INVESTIGAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA, LABORATORIAL E TERAPÊUTICA

Expressão das citoceratinas em dermatoses infecto- parasitárias associadas à hiperplasia epidérmica^*

Maria Christina Marques Nogueira-Castañon^I; Tullia Cuzzi Maya^II; René Garrido Neves^III

^IProfesssora Adjunta - Departamento de Morfologia , UFJF, MG

^IIProfessora Adjunta, Departamento de Patologia, UFRJ, RJ

^IIIProfessor Titular, UFRJ, RJ

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTOS: As citoceratinas(C) são as proteínas estruturais mais importantes das células epiteliais e exibem a maior heterogeneidade dentre todas as proteínas dos filamentos intermediários. Seu estudo através de imunomarcação possibilita a análise estrutural do citoesqueleto em vários afecções neoplásicas e inflamatórias.

OBJETIVOS: Verificar o padrão imuno-histoquímico da expressão das citoceratinas na epiderme de doenças infecto-parasitárias associadas à hiperplasia escamosa.

MÉTODOS: Cortes histológicos obtidos de tecidos pré-fixados e incluidos em parafina à partir de lesões de cromomicose, paracoccidioidomicose, leishmaniose e condiloma acuminado foram marcados com os anticorpos DEK10, LL025, LL002 e AE1 pela técnica de imunoperoxidase (avidina-biotina).

RESULTADOS: A análise de áreas com intensidade variável de hiperplasia epidérmica presentes nos fragmentos mostrou exclusivamente e/ou predominantemente nas quatro doenças: ausência de expressão da C10 nas áreas de hiperplasia intensa e retardo da expressão nas áreas de hiperplasia moderada e/ou ausente; padrão suprabasal de marcação para a C16 independentemente do grau de hiperplasia como também, liberação de epítopos suprabasais para os marcadores LL002 (C14) e AE1 (C10,14,16,19).

CONCLUSÕES: As modificações indicam que, independentemente da natureza do agente etiológico e do grau de hiperplasia presente, ocorrem alterações na diferenciação e proliferação do ceratinócito.

Descritores: epiderme; hiperplasia; queratina.

INTRODUÇÃO

As citoceratinas (C) são proteínas presentes em todas as células epiteliais. Sua associação conduz à formação de um arcabouço de filamentos intermediários que constitui o principal componente do citoesqueleto epitelial.1 Classificadas como tipo I (ácida) ou tipo II (neutro-básica), são geralmente co-expressas em pares, em que os filamentos de queratina são heteropolímeros de quantidades equimolares de uma proteína ácida (tipo I) e uma básica (tipo II).^2,3

A produção pertinente de anticorpos monoclonais anticitoceratinas vem crescendo, e sua caracterização bioquímica e o estudo de padrões de revelação imuno-histoquímica em tecidos humanos normais sugerem que elas representem uma significante contribuição para aplicação em patologia diagnóstica e no campo da investigação.^4-7

Na epiderme humana normal os ceratinócitos seguem um padrão de maturação durante sua migração da camada basal até a camada córnea, o qual é acompanhado por mudanças na síntese das citoceratinas. Assim, encontramos as citoqueratinas 5 e 14 no compartimento basal e as citoqueratinas 1 e 10 no compartimento suprabasal, constituindo um padrão característico do epitélio escamoso ceratinizante.^8,9,10

Em muitas doenças cutâneas o padrão de expressão da citoceratinas na epiderme está alterado. Naquelas caracterizadas por hiperproliferação epidérmica, como, por exemplo, a psoríase, alguns tumores epidérmicos, assim como úlceras cutâneas em fase de cicatrização, o padrão de diferenciação do ceratinócito está interrompido e/ou substituído por um padrão modificado alternativo.¹¹ As alterações incluem o aparecimento precoce de certos marcadores de diferenciação terminal, retardo na síntese de outros e a expressão de citoceratinas que não são encontradas na epiderme sadia, como, por exemplo, a C6 e C16.^12-15

No presente estudo, a expressão de citoceratinas individuais foi investigada na epiderme de dermatoses infecto-parasitárias que freqüentemente se associam a alterações morfológicas epiteliais hiperplasiantes (como a leishmaniose tegumentar americana, a paracoccidioidomicose, a cromomicose e o condiloma acuminado), com o objetivo de buscar subsídios para o melhor entendimento da diferenciação e maturação epidérmica nessas doenças.

MATERIAL E MÉTODOS

Realizou-se um estudo retrospectivo de fragmentos de lesões cutâneas de leishmaniose, paracoccidioidomicose, cromomicose e condiloma acuminado (10 casos de cada doença) prefixados em formol a 10%, embebidos e emblocados em parafina. Cortes histológicos de quatro micra de espessura foram colocados em lâminas filmadas com 3-aminopropyltriethoxy-silano (segundo orientações do fabricante, Sigma A-3648), desparafinizados em xilol, re-hidratados em soluções de álcool, e água. A inibição da peroxidase endógena foi feita com banhos sucessivos de solução de peróxido de hidrogênio. Inicialmente o material foi incubado com soro normal de cavalo para os anticorpos monoclonais AE1, LL002 E DEK-10, e albumina bovina para o anticorpo monoclonal LL025, com o objetivo de diminuir, por bloqueio, as ligações inespecíficas, evitando, assim, a presença de coloração de fundo durante a revelação. Os anticorpos primários utilizados, todos monoclonais, suas especificidades, diluições, tempo e temperatura de incubação, necessidade ou não de pré-tratamento, fontes comerciais e referências bibliográficas, são apresentados no quadro 1.

Para os anticorpos AE1, LL002 e LL025, procedeu-se à recuperação antigênica mediante incubação em solução de tampão citrato (Merk 244 e 6586) e aquecimento em forno de microondas (Shap RH-4A33 operando na freqüência de 2,45GHZ, no nível máximo de energia, aproximadamente 750W) por dois ciclos de cinco minutos para os marcadores AE1 e LL002 e seis minutos para o marcador LL025. A seguir o material foi incubado com anticorpo biotinilado (Vectastain ABC kit-mouse IGg-1), uma gota de solução/estoque em 10ml de Dako TBS, durante 30 minutos, a 37ºC em câmara úmida, e com complexo avidina-biotina conjugado à peroxidase (Vectastain ABC kit) por 30 minutos, em câmara úmida. O produto da reação foi revelado com DAB (diamino-benzidina), e os cortes foram contracorados com hematoxilina de Harris, desidratados e montados em meio sintético. A diluição dos anticorpos primário e secundário foi feita em tampão Tris-HCl 0,05M pH 7,6 em BSA (albumina sérica bovina, Sigma Immunochemical A2153) a 5% com azida sódica 0,015M. Como controles positivos para os anticorpos DEK10, AE1, LL002, foram utilizados cortes histológicos de pele normal da região axilar. Para o anticorpo monoclonal LL025, foram utilizados cortes histológicos de carcinoma basocelular, como recomendado pelo fabricante comercial, e introduziram-se outras doenças cutâneas sabidamente relacionadas com hiperproliferação celular, como a psoríase, líquen plano e ceratoacantoma, as quais mostram forte expressão da C16, conforme as consultas referenciadas.^16,17 A omissão do anticorpo primário foi utilizada como controle negativo da reação.

RESULTADOS

Os 40 casos analisados apresentaram variações da espessura epidérmica ao longo do fragmento examinado, sendo registrados: hiperplasia intensa (pseudoepiteliomatosa); hiperplasia moderada (regular); hiperplasia discreta ou ausente (epiderme com espessura habitual); hiperplasia intensa associada à hiperplasia moderada; hiperplasia discreta ou ausente associada à hiperplasia moderada; hiperplasia discreta ou ausente associada à hiperplasia moderada e intensa.

Com a utilização de controle negativo e controle positivo, observou-se coloração acastanhada no citoplasma de células epiteliais. O padrão de marcação nessa amostra (quando positivo) foi também citoplasmático com todos os anticorpos utilizados. Os resultados obtidos estão referidos no quadro 2.

Nas amostras de cromomicose, paracoccidioidomicose e leishmaniose a expressão da C10 foi negativa nas áreas de hiperplasia intensa. Porém, nos locais de hiperplasia moderada, houve predomínio de positividade suprabasal associado a retardo da expressão (Figura 1) e, padrão de epiderme normal nas áreas de hiperplasia discreta ou ausente. A C16 foi abrangentemente positiva na epiderme de toda a amostra, independente do grau de hiperplasia (Figura 2). A C14 apresentou, independente do grau de hiperplasia, expressão intensa e uniforme em toda a espessura epidérmica (Figuras 3, 4, 5 e 6). O anticorpo monoclonal AE1, que na epiderme normal imunorreage seletivamente com epítopos das células basais, apresentou um padrão suprabasal em todos os casos, independente do grau de hiperplasia (Figura 7). Contudo, ocorreram variações de positividade e intensidade da reação no compartimento basal, dependendo do grau de hiperplasia presente.

No condiloma acuminado a C10 foi predominantemente positiva nas áreas de hiperplasia intensa e moderada, porém, com retardo na expressão e variações de intensidade da reação. Em áreas de hiperplasia discreta ou ausente o padrão foi de epiderme normal. A C16 mostrou predomínio de positividade nas áreas de hiperplasia intensa e moderada, porém, nesta última, ocorreu intensidade mais fraca da reação. Já nas áreas de hiperplasia discreta ou ausente, foi negativa. A C14 mostrou intensa positividade de toda a espessura epidérmica nas áreas de hiperplasia intensa (Figura 8), o mesmo ocorrendo nas áreas de hiperplasia moderada, porém com intensidade mais fraca. O anticorpo AE1 apresentou imunorreatividade predominantemente positiva e intensa em toda a espessura epidérmica nas áreas de hiperplasia intensa e padrão de epiderme normal nas áreas de hiperplasia moderada e discreta ou ausente.

DISCUSSÃO

Os resultados demonstraram uma clara evidência de mudanças na expressão das citoceratinas com os anticorpos monoclonais empregados em todas as doenças examinadas, como também uma relação entre a expressão das citoceratinas e os variados graus de hiperplasia epidérmica presentes.

A ocorrência de modificações epidérmicas na expressão da C10, que é considerada um dos marcadores moleculares de diferenciação terminal de ceratinócito,¹² indica e reforça evidências anteriores de que tais modificações representam a presença de alterações na ceratinização, mesmo em fases iniciais da lesão, quando ainda não existe uma exuberante hiperplasia epitelial.^19,20

O anticorpo monoclonal LL025 monoespecífico para a C16, intimamente relacionada ao estado de hiperproliferação do ceratinócito,12 um antígeno ausente na epiderme interfolicular normal, apresentou abrangente positividade em toda a amostra, independente do grau de hiperplasia observado, e até mesmo em áreas de epiderme de espessura normal.

É descrito que em doenças cutâneas hiperproliferativas e após traumatismos experimentais um aumento na expressão da C16 antecipa a proliferação epidérmica, seguido por uma diminuição da expressão da C10.^21,22 Isso também foi demonstrado neste estudo nas áreas de epiderme praticamente normal ou pelo menos dentro dos limites da normalidade, como também em áreas de hiperplasia discreta. Portanto, a expressão da C16 sustenta e reforça o ponto de vista de que o ceratinócito responde a um suposto estímulo com um padrão alternativo de diferenciação. Porém, não parece uma alteração doença-específica, porque mudanças idênticas são induzidas nos ceratinócitos normais quando migração e mitose se fazem necessárias.²³

Os resultados deste estudo demonstram explicitamente que, mesmo antes da evidência morfológica de hiperplasia epitelial, já se observam alterações dos filamentos intermediários de citoceratinas. Esses achados estão em pleno acordo com a literatura, ou seja, a expressão da C16 não é uma conseqüência da hiperproliferação, mas indica que a mesma foi desencadeada ou já está estabelecida.^22,23

O anticorpo monoclonal LL002, que imunorreage com a C14, não revelou, em nenhum caso, o padrão de marcação restrita (células basais positivas e parabasais eventualmente positivas) observado na epiderme normal.24 Todos os casos mostraram marcação intensa e uniforme de toda a espessura da epiderme independente do grau de hiperplasia, o que também é descrito em estados de hiperproliferação durante a regeneração epidérmica, ou seja, positividade pan-epidérmica.²⁴

Esse fato, em associação com a positivade da C16 e a ausência ou retardo da C10, reforça a proposta de que a C14 e a C16 parecem ser outros polipeptídeos de citoceratina que substituem a C10 na camada suprabasal da epiderme em regeneração. Supõe-se que essas mudanças sejam um reflexo da imaturidade e falta de diferenciação da epiderme durante a fase proliferativa da cicatrização de úlceras, podendo os achados estar relacionados com a proliferação e imaturidade da epiderme neoformada, uma vez que as C13 e C 18 (normais nas células suprabasais da epiderme fetal) também se apresentam positivas.²¹

O anticorpo monoclonal AE1 exibiu também um padrão de marcação diferente do observado no material controle, com reação citoplasmática positiva e intensa no compartimento suprabasal de todos os casos, independentemente do grau de hiperplasia. Contudo, observaram-se, na camada basal, variações na positividade e intensidade da reação dependendo do grau de hiperplasia presente.

Esses resultados demonstram que não só os ceratinócitos basais na epiderme comprometida, mas também os suprabasais, expressam um padrão de diferenciação alterado para o anticorpo monoclonal AE1.

Estudos anteriores focalizando a imunorreatividade do marcador molecular AE1 em diversas doenças, mediante técnicas de imunofluorescência e peroxidase-antiperoxidase em secções histológicas congeladas de pele humana normal e anormal, demostraram que na pele normal e na ictiose vulgar, doença epidérmica não proliferativa, esse anticorpo reagiu com as células basais epidérmicas. Padrões de imunorreatividade muito diferentes foram observados em várias outras doenças epidérmicas, como psoríase, verruga vulgar, ceratose seborréica, ceratose actínica, assim como em certas neoplasias epidérmicas, como o carcinoma basocelular e epidermóide, além da doença de Bowen, as quais apresentaram positividade suprabasal para esse anticorpo com certas variações de intensidade da reação.^25,26

Embora as bases bioquímicas para o entendimento desses padrões de reatividade ainda careçam de uma elucidação, os resultados aqui apresentados demonstram evidências de que a expressão das citoceratinas pode ser afetada por vários estados evolutivos de doença.

CONCLUSÕES

A expressão alterada das citoceratinas epidérmicas em doenças inflamatórias de natureza infecto-parasitária como a cromomicose, paracoccidioidomicose, leishmaniose e o condiloma acuminado refletem a ocorrência de modificações na diferenciação e proliferação dos ceratinócitos, independentemente da natureza do estímulo (fungo, protozoário ou vírus).

A positividade encontrada para a C16, um marcador de ceratinócito hiperproliferante, associada ao retardo na expressão da C10, um marcador de diferenciação terminal do ceratinócito, é indicadora de que houve uma mudança no perfil de expressão das citoceratinas epidérmicas, o qual foi substituído por um padrão de hiperproliferação celular tanto nas áreas morfologicamente definidas como hiperplásicas como também naquelas sem evidência morfológica de aumento da atividade mitótica. Existe, portanto, uma reciprocidade entre marcadores de ceratinização terminal e marcadores de hiperproliferação. Quando a C16 é positiva, geralmente ocorre retardo na expressão da C10, isto é, há uma mudança de expressão dos ceratinócitos suprabasais, os quais deixam de encenar o padrão imunocitológico de citoceratinas associadas com a diferenciação terminal (C1, C10) e uma substituição por citoceratinas relacionadas com a hiperproliferação celular (C6, C16).

Mesmo na ausência de hiperplasia, ou seja, epiderme com espessura normal seja área perilesional ou epiderme suprajacente ao processo inflamatório, ocorreram alterações do padrão de expressão das citoceratinas, principalmente as C16 e C10, predizendo um padrão de hiperproliferação mais precoce do que as alterações morfológicas futuras, quer dizer, essas alterações seriam mais a "causa" do que a "conseqüência" do estado de hiperproliferação.

A mudança no padrão de expressão das citoceratinas é um indicador imunocitológico de que algum fator indutivo, provavelmente presente no tecido conjuntivo dérmico e/ou no infiltrado inflamatório desencadeado pelo parasita, primariamente atua no nível do citoesqueleto, o que secundariamente irá se manifestar com o aspecto de hiperproliferação celular (hiperplasia).

Recebido em 07.07.2004

Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 27.08.2004

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Trabalho realizado no Curso de Pós-Graduação em Dermatologia, HUCFF/Universidade Federal do Rio de Janeiro, RJ.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Mar 2005
• Data do Fascículo
  Dez 2004

Histórico

• Aceito
  27 Ago 2004
• Recebido
  07 Jul 2004