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Anais Brasileiros de Dermatologia

Print version ISSN 0365-0596

An. Bras. Dermatol. vol.80 no.4 Rio de Janeiro July/Aug. 2005

http://dx.doi.org/10.1590/S0365-05962005000400005 

INVESTIGAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA, LABORATORIAL E TERAPÊUTICA

 

Desenvolvimento de preparado antigênico Mitsuda-símile e sua avaliação em pacientes multibacilares Mitsuda-negativos*

 

 

Ruy Noronha MirandaI; Luiz Carlos PereiraII; Sérgio Fonseca TarléIII; Rogério A. NascimentoIV; Sandra L. de MelloV; Lismary A. F. MesquitaVI; Ivone T. DechandtVII

IProf. Emérito da Universidade Federal do Paraná - UFPR, Dermatologista e Hansenologista, Pesquisador Titular - Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil
IIProf. Titular de Dermatologia PUC-PR. Diretor de Ensino e Pesquisa da Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil
IIIProf. Adjunto de Dermatologia, PUC-PR, Hansenologista, Diretor de Assistência Médico-Social da Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil
IVDermatologista (in memoriam)
VDermatologista Cirúrgica, Preceptora da Residência Médica na Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil
VIPatologista da Santa Casa de Curitiba - Curitiba (PR), Brasil
VIIBacharel em Ciências Contábeis, Diretora-presidente da Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

FUNDAMENTOS: A hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, manifesta-se por forma clínica denominada paucibacilar, benigna, Mitsuda-positiva, imunocompetente, e por outra forma, denominada multibacilar, grave, Mitsuda-negativa, imunodeficiente. Doentes multibacilares, eliminadores de bacilos, são considerados os mantenedores da endemia hansênica.
OBJETIVOS: Os autores testaram cultura de micobactérias, obtida em laboratório, em pacientes Mitsuda-negativos, em busca de possível viragem imunológica.
MÉTODOS:Com a cultura de micobactérias, foi preparado antígeno mitsudina-símile, que foi testado em 28 hansenianos Mitsuda-negativos, os quais, após avaliação desse teste, foram submetidos a novo teste de Mitsuda. Outros 28 Mitsuda-negativos receberam a inoculação de placebo e, posteriormente, foram avaliados por meio de novo teste de Mitsuda.
RESULTADOS: Nos pacientes inoculados com a mitsudina experimental houve respostas favoráveis: em 25 deles reações macroscópicas positivas, em quatro das quais, com granuloma tuberculóide. Avaliados por meio de novo teste de Mitsuda, quatro deles responderam com típicas reações Mitsuda-positivas, com granuloma tuberculóide. Nos pacientes testados com placebo, as respostas foram negativas; a um novo teste de Mitsuda, houve uma resposta positiva.
CONCLUSÕES: Em hansenianos Mitsuda-negativos, testados com mitsudina experimental, foram constatadas 14,29% de respostas favoráveis, com reações de Mitsuda-símiles provocadas por essa mitsudina; testados os pacientes, novamente, com o antígeno de Mitsuda, foram constatadas 14,81% de respostas favoráveis, com reações positivas.

Palavras-chave: Antígeno de Mitsuda; Hanseníase; Imunidade celular


 

 

INTRODUÇÃO

Hanseníase é doença infecciosa crônica que afeta globalmente cerca de 550.000 indivíduos por ano.1 Causada pela bactéria Mycobacterium leprae (M. leprae), atinge primariamente a pele e o sistema nervoso periférico.2 A Organização Mundial da Saúde (OMS) lançou, em meados da década de 1980, uma campanha mundial cujo objetivo era eliminar a hanseníase como problema de saúde pública (incidência < 1/10.000 habitantes) até o ano 2000. No entanto, em 2004, a doença ainda persiste em diversos países, com elevada prevalência, desde 1996.1 Como não existe reservatório natural conhecido de importância biológica para o M. leprae e o tratamento atual, fornecido gratuitamente pela OMS a todos os pacientes, é bastante eficaz na cura da doença, a origem desses novos casos permanece obscura. O Brasil, com 40.000 hansenianos, é o segundo país do mundo em número de doentes, só superado pela Índia.1

A manifestação clínica da hanseníase é bastante heterogênea. Segundo o critério clássico de classificação das formas clínicas da doença proposto por Ridley e Jopling,3 o paciente afetado pode apresentar um espectro de manifestações que varia entre as formas polares tuberculóide - mais branda e localizada - e virchoviana - sistêmica e mais grave. A hanseníase tuberculóide caracteriza-se por presença de poucas lesões de pele, raros bacilos detectáveis em biópsia de pele e nervos, e presença de forte resposta imunológica celular tipo Th1 antiM. leprae. Pacientes com hanseníase virchoviana apresentam numerosas lesões de pele, com presença abundante de bacilos e anergia a antígenos do M. leprae.3 As formas tuberculóide e virchoviana da doença correspondem aos tipos de hanseníase paucibacilar e multibacilar, respectivamente, preconizados pela OMS para fins de orientação terapêutica.

Uma característica que distingue o M. leprae de todas as outras bactérias patogênicas à espécie humana é sua inabilidade de crescer em meios de cultura artificiais. Essa característica pode ser analisada hoje sob a luz de dados recentes que indicam marcante redução evolutiva do genoma do M. leprae.4 Comparativamente, enquanto o genoma do M. tuberculosis contém mais de 4.000 genes, o do M. leprae contém apenas 1.600 seqüências abertas de leitura (open reading frames, ORFs) previstas. Essa comparação sugere que o M. leprae perdeu cerca de 2.000 genes desde que divergiu evolutivamente a partir de uma micobactéria ancestral comum, resultando em um parasita intracelular obrigatório altamente especializado. A perda de função de genes envolvidos em vias metabólicas crucias oferece uma tentadora explicação para a impossibilidade de cultivo desse microorganismo.

Miranda e cols. obtiveram o crescimento de microorganismos ácido-álcool-resistentes pela semeadura de linfa cutânea de hansenianos multibacilares em um meio de cultura original.5 Admite-se que uma cultura de microorganismos é sugestiva de M. leprae se provocar, em testes cutâneos, respostas idênticas às provocadas pela mitsudina standard na reação clássica de Mitsuda,6 isto é, respostas positivas nos pacientes paucibacilares (TT) hiperérgicos e negativas nos multibacilares (LL) anérgicos. A utilização de uma mitsudina bacilar experimental tipo Dharmendra,7 denominada C12-004 e preparada a partir das culturas obtidas por Miranda e cols., provocou forte resposta positiva em pacientes miltibacilares não reagentes ao teste de Mitsuda.8 Esse resultado sugere que a bactéria cultivada não era M. leprae. De fato, tipagens das culturas obtidas por Miranda e cols., realizadas no Instituto Adolpho Lutz de São Paulo e em Biomanguinhos, no Rio de Janeiro, concluíram que a micobactéria cultivada era da espécie M. kansasii, conforme laudos oficiais expedidos.

Estudos anteriores utilizaram diferentes preparações antigênicas na indução de resposta imune em pacientes hansenianos anérgicos.6,9,10 As observações dos autores sugerem que uma mitsudina-símile preparada a partir do microorganismo cultivado poderia ser eficiente na indução de resposta imune ao antígeno de Mistuda. Para testar essa hipótese, foi preparada e inoculada em pacientes hansenianos anérgicos a mitsudina-símile C12-004, sendo seus efeitos de indução de imunidade avaliados por meio de subseqüente teste de Mitsuda.

 

MATERIAIS E MÉTODOS

1. Pacientes

Cinqüenta e seis indivíduos adultos, de ambos os sexos, sem doenças intercorrentes ou gravidez, portadores de hanseníase e Mitsuda-negativos, em diversas fases de tratamento, foram sendo recrutados randomicamente entre os pacientes em tratamento ambulatorial na Fundação Pró-Hansen. O diagnóstico da doença foi efetuado por experientes hansenologistas com base em critérios clínicos, bacteriológicos, histopatológicos e imunológicos (reação de Mitsuda). A classificação dos tipos clínicos da hanseníase foi feita com base nos critérios descritos por Ridley e Jopling.3 Os pacientes foram reunidos em dois grupos de 28 indivíduos; o primeiro, denominado "experimental", foi submetido à inoculação intradérmica da mitsudina experimental C12-004; o segundo grupo, denominado "controle", foi inoculado com um placebo. Todos os indivíduos recrutados foram instruídos sobre o projeto de pesquisa, sem saber a qual grupo pertenciam, instados a participar do mesmo e, uma vez concordantes, assinaram um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). A execução do projeto foi autorizada pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Fundação Pró-Hansen.

2. Cultura de micobactérias

Conforme descrito,5 a cultura de micobactérias utilizada no projeto foi obtida em plasma humano de pessoa sadia, no desempenho de uma técnica original. O plasma contido em 20ml de sangue venoso do doador, separado dos elementos figurados do sangue pelo repouso ou centrifugação, foi semeado com linfa bacilífera de paciente multibacilar e mantido em estufa a 34°C, até que, em caso de positividade, houvesse formação do sedimento brancacento, da massa bacilar em crescimento, por volta do quadragésimo quinto dia de incubação. A análise óptica desse sedimento mostrou ser de microorganismos com todos os caracteres morfológicos e tintoriais das micobactérias. O importante é que a análise seqüencial desse sedimento não o reconheceu como Mycobacterium leprae, mas, sim, M. kansasii. O repique de sigla 191/39FYA foi selecionado para o preparo da mitsudina experimental, que recebeu o rótulo de C12-004. Essa cultura foi validada mediante o crescimento de seus repiques, em meio caldo-plasma.

3. Preparo da mitsudina C12-004

A mitsudina experimental utilizada neste trabalho foi obtida segundo tecnologia do Centro de Produção e Pesquisa em Imunobiológicos (CPPI) da Secretaria de Saúde do Paraná, que é credenciado para a produção e o fornecimento do antígeno de Mitsuda e que realizou todas as provas de qualidade da mesma. O conteúdo da cultura 191/39FYA foi transferido para um balão de Erlenmeyer contendo 100ml de meio caldo-plasma, no qual foi homogeneizado por agitação. Quatro alíquotas de 10ml dessa suspensão bacteriana foram distribuídas em tubos de centrifugação e centrifugadas até a separação dos microorganismos. O líquido sobrenadante foi decantado e descartado; o sedimento foi suspenso e lavado em soro fisiológico, e novamente obtido por centrifugação. Esse procedimento foi realizado mais uma vez, e, em seguida, o sedimento foi suspenso em 100ml de solução fisiológica fenicada a 0,5% para a contagem de bacilos, que revelou ser 17x106 de microorganismos por mililitro. A suspensão foi envasada em frascos tipo penicilina, autoclavados a 120°C durante 20 minutos, sendo submetida às provas de qualificação: dosagem de componentes químicos, esterilidade, inocuidade, reatividade cutânea, teste de necrose na cobaia e pH, todas satisfatórias e emitidas em laudos oficiais. O placebo, participante da experiência, uma solução fisiológica, também foi submetido às provas mencionadas.

4. Mitsudina standard

A mitsudina standard utilizada neste estudo foi fornecida gentilmente pelo CPPI do Estado do Paraná.

5. Inoculação dos pacientes

Todos os indivíduos do grupo experimental, constatada a negatividade da reação de Mitsuda, foram inoculados intradermicamente na face anterior do antebraço direito com 0,1ml da mitsudina C12-004. Os indivíduos do grupo controle foram inoculados com 0,1ml da solução fisiológica. A leitura dos resultados das inoculações, em ambos os grupos, foi realizada conforme o cronograma da investigação, sendo consideradas positivas macroscopicamente aquelas que responderam com a formação de um tubérculo com 3mm ou mais de diâmetro, biopsiado para confirmação histopatológica. Depois de feita a biópsia excisional das respostas macroscópicas, todos os pacientes, como também os do grupo controle, foram submetidos a um novo teste de Mitsuda.

6. Análise estatística

Diferenças entre a proporção de indivíduos dos grupos experimental e controle que apresentaram resposta positiva à inoculação intradérmica com mitsudina standard posterior à exposição à mitsudina experimental C12-004 foram estimadas utilizando-se o Teste Exato de Fisher.

 

RESULTADOS

Os resultados obtidos nos 28 pacientes do grupo experimental estão apresentados na tabela 1. Vinte e cinco pacientes (89,28%) apresentaram reação macroscópica positiva à mitsudina experimental C12-004 (Figura 1); quatro (pacientes 6, 13, 24 e 27), ou 14,29%, apresentaram imagens histopatológicas tuberculóides Mitsuda-símiles (Figura 2); oito, pacientes (1, 5, 7, 10, 11, 14, 15 e 25) apresentaram respostas histopatológicas contendo células epitelióides ou gigantes (componentes da reação de Mitsuda positiva; figuras 3 e 4); em 11 pacientes (5, 6, 12, 13, 14, 15, 18, 21, 24, 26 e 27) verificou-se ausência de microorganismos na amostra histopatológica. Na seqüência, 27 pacientes do grupo experimental foram submetidos a nova prova de Mitsuda. Desses, quatro (14, 81%) responderam com reações de Mitsuda positivas (Figura 5); em outros dois pacientes (01 e 13), que também exibiram resposta macroscópica positiva, a análise histopatológica não mostrou a formação de granuloma tuberculóide, e, por isso, foram consideradas falsas reações de Mitsuda (Figura 6). Alguns pacientes que responderam macroscopicamente à inoculação da Mitsudina C12-004 mostraram respostas histopatológicas discordantes: virchowiana (LL), paciente 04 (Figura 7); indeterminada (I), paciente 12 (Figura 8) (HE x 400).11

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Os pacientes do grupo controle, inoculados com o placebo, não forneceram respostas positivas à inoculação. Quando submetidos a subseqüente teste de Mitsuda, apenas um deles apresentou resposta macroscópica positiva, que não foi analisada histopatologicamente. Não foi constatada diferença estatística significativa quando comparados os números de indivíduos de ambos os grupos que apresentaram reação de Mitsuda positiva posterior à inoculação da mitsudina C12-004 ou do placebo (P = 0,351).

O permanente acompanhamento clínico dos pacientes, durante a execução da pesquisa, não evidenciou modificações significativas no curso próprio da doença. Todos os pacientes prosseguiram com o tratamento poliquimioterápico (PQT). Os surtos reacionais da hanseníase, tipos I e II, manifestaram-se como é próprio dessa doença, durante o curso do Projeto, na população do grupo experimental (48,14%) e na do grupo controle (51,85%).

 

DISCUSSÃO

A intradermorreação de Mitsuda é teste usado na avaliação do tipo de resposta imune contra M. leprae apresentado por um indivíduo.2 O resultado da reação de Mitsuda em pessoas sadias tem valor preditivo quanto ao tipo de manifestação clínica da doença a ser apresentada pelo paciente. Reação de Mitsuda positiva indica intensa resposta imune celular, tipo Th1, e está associada a baixo risco de desenvolvimento da forma virchoviana da doença. Por outro lado, uma reação de Mitsuda negativa indica resposta imune predominantemente humoral, tipo Th2, e alto risco de manifestação da forma sistêmica, multibacilar da hanseníase.12,13 Nesse contexto, considera-se válido procurar induzir imunidade celular específica contra o Mycobacterium leprae no hanseniano anérgico (multibacilar, LL). A indução da positividade do teste de Mitsuda tem sido obtida pela exposição do doente anérgico a antígenos que não o M. leprae. Na presente investigação, uma mitsudina experimental (C12-004) foi elaborada a partir de cultura de Mycobacterium kansasii, obtida de lesões cutâneas de portador de hanseníase multibacilar. A obtenção de cultura de micobactéria que não o M. leprae a partir de lesão de paciente hanseniano multibacilar assemelha-se a achados de outros autores, conforme descrito por Cochrane14 e, mais recentemente, por Chakrabarty.6 A mitsudina C12-004, quando inoculada intradermicamente em pacientes anérgicos, promoveu resposta imune celular específica em 14,29% da população estudada. Esse resultado sugere capacidade de indução de imunidade celular com antígenos presentes na própria mitsudina C12-004. Foi evidenciada a viragem imunológica em quatro dos 27 pacientes submetidos a uma nova exposição a antígenos específicos do M. leprae, isto é, em 14,81% da população estudada, que apresentaram reação de Mitsuda clássica positiva. Apenas um paciente apresentou coincidência de resultados positivos obtidos com a mitsudina C12-004 e a mitsudina standard. Merecem atenção outros resultados da análise histopatológica obtidos com a inoculação da própria mitsudina experimental, quais sejam, resposta parcial tuberculóide em oito pacientes e ausência dos bacilos inoculados com a mitsudina experimental em 11 pacientes. As observações dos autores indicam ainda a ocorrência de duas falsas reações de Mitsuda, constatadas na prova final, caracterizadas pela não-correspondência de granuloma tuberculóide a uma resposta macroscópica positiva. Os 28 pacientes do grupo controle não mostraram qualquer resposta à inoculação do placebo. Quando testados por meio de um segundo teste de Mitsuda, apenas um paciente respondeu macroscopicamente, não tendo sido essa resposta avaliada em exame histopatológico. A ausência de significância estatística (P = 0.351) para a diferença entre o número de indivíduos que apresentaram reação de Mitsuda positiva (1/28) é provavelmente devida ao pequeno número da população testada e sugere a replicação dos resultados em uma amostra ampliada.

Não foi interrompido o tratamento específico dos doentes durante o curso dos experimentos. A ocorrência de surtos reacionais em 48,14% dos pacientes do grupo experimental e 51,85% do grupo controle obrigou-os ao uso de corticóides e talidomida, o que pode ter influído negativamente nos resultados, devido à ação imunomoderadora dessas drogas.

 

CONCLUSÕES

O desenvolvimento do presente projeto permitiu constatar que foi possível obter indícios de imunidade celular em hansenianos multibacilares, Mitsuda-negativos, por meio de injeção intradérmica de uma mitsudina bacilar preparada com cultura de micobactérias que não o Mycobacterium leprae.

A própria mitsudina experimental provocou reações positivas Mitsuda-símiles em quatro (14,29%) de 28 pacientes testados. Um posterior teste de Mitsuda clássico respondeu, em outros quatro de 27 (14,81%), com reações de Mitsuda positivas.

Admite-se que a porcentagem de respostas favoráveis poderia ser mais elevada se a concentração de microorganismos na mitsudina experimental fosse superior a 17 milhões de microorganismos por mililitro.

A presença de células epitelióides e gigantes nos exames histopatológicos de respostas macroscópicas à mitsudina experimental, consignadas como BT na tabela, em oito pacientes, foi interpretada como uma tentativa dos respectivos organismos em desenvolver imunidade celular. A não-coincidência do padrão das respostas histopatológicas aos dois antígenos, mitsudina experimental e standard, faz admitir que o estímulo antigênico difere entre os mesmos. As respostas em que não foram vistas as bactérias injetadas com a mitsudina experimental sugerem que os respectivos organismos adquiram a capacidade de lisar as bactérias.

A inoculação de placebo em 28 outros pacientes de um grupo chamado "controle", não produziu respostas, e uma segunda testagem com a mitsudina standard forneceu resposta macroscópica positiva em um paciente.

Não houve, nos dois grupos de pacientes, modificações apreciáveis no curso de suas doenças, sofrendo eles as costumeiras reações hansênicas nas freqüências conhecidas.

 

AGRADECIMENTOS

Os autores não poderiam ter realizado os trabalhos do presente Projeto sem o valioso apoio das seguintes entidades, às quais são imensamente gratos: à Diretoria da Fundação Pró-Hansen, na qual tiveram curso os trabalhos; ao CEP da Fundação Pró-Hansen, por ter autorizado a execução do Projeto e emitido os pareceres relativos a seus oito relatórios trimestrais; ao CPPI do Paraná, pelo fornecimento da mitsudina standard e o preparo da mitsudina C12-004; ao laboratório da Santa Casa de Curitiba, pela realização dos exames e fotografias histopatológicos; à Conep do MS, por ter acolhido todos os oito relatórios trimestrais referentes ao Projeto; aos pacientes submetidos às provas, por seu espírito de colaboração. Um especial agradecimento ao professor Marcelo Távora Mira, por ter procedido a revisão do texto.

 

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Endereço para correspondência
Fundação Pró-Hansen
Fernando Amaro, 1116
80050-020 - Curitiba - PR
Tel./Fax: (41) 3263-2757
E-mail: fprohansen@onda.com.br

Recebido em 18.11.2003.
Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 01.06.2005.

 

 

* Trabalho realizado na Fundação Pró-Hansen - Curitiba, Paraná (PR), Brasil.