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Anais Brasileiros de Dermatologia

On-line version ISSN 1806-4841

An. Bras. Dermatol. vol.81 no.5 Rio de Janeiro Sept./Oct. 2006

http://dx.doi.org/10.1590/S0365-05962006000500005 

INVESTIGAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA, LABORATORIAL E TERAPÊUTICA

 

Estudo genético do gene p16 pela técnica de PCR-SSCP e expressão de proteína p16 em melanomas de mucosa oral e melanomas cutâneos*

 

 

Ricardo HsiehI; Fabrício Bitu SousaII; Aline FirmianoIII; Fabio Daumas NunesIV; Marina Helena Cury Gallottini de MagalhãesIV; Mírian Nacagami SottoV

IMestrando em Dermatologia no Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - São Paulo (SP), Brasil. Bolsista CAPES
IIProfessor Doutor do Departamento de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Ceará - Fortaleza (CE), Brasil. Pós-Doutorado no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - São Paulo (SP), Brasil
IIIAluna de Iniciação Científica, Graduanda de Biomedicina. Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - São Paulo (SP), Brasil
IVProfessores-associados da Disciplina de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo - São Paulo (SP), Brasil
VProfessora-associada do Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - São Paulo (SP), Brasil

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

FUNDAMENTOS: A deleção e mutação do gene CDKN2a que codifica um inibidor específico da ciclina dependente de quinase 4, a proteína p16, têm sido implicadas na tumorigênese do melanoma cutâneo. Entretanto, pouco se conhece sobre essas alterações genéticas em melanomas de mucosa oral.
OBJETIVOS: Verificar a presença de alterações no gene p16 e sua expressão protéica em melanomas esporádicos orais e cutâneos.
MATERIAL E MÉTODOS: Avaliaram-se 36 espécimes de melanoma primário (sete orais e 29 cutâneos). Analisaram-se três exons do gene p16, pela técnica da reação em cadeia da polimerase/polimorfismo conformacional de fita simples do DNA.Verificou-se a expressão tecidual de proteína p16 por técnica imuno-histoquímica. Relacionaram-se os resultados com a espessura dos melanomas cutâneos.
RESULTADOS: Cinco dos sete melanomas orais e 17 dos 29 melanomas cutâneos apresentaram indício de alteração no gene p16. Alterações do exon 2 foram as mais freqüentes, sendo 19 casos nos produtos obtidos com o mesmo iniciador. Observou-se expressão tecidual de p16 em apenas um melanoma oral, em 10/13 (76,9%) casos de melanoma cutâneo de espessura até 1mm e em sete de oito (87,5%) casos de espessura superior a 1mm.
CONCLUSÃO: A freqüência de indícios de alteração na análise genética de p16 nos melanomas de mucosa oral foi de 71,42% e de 58,6% nos cutâneos. É possível sugerir a participação de alterações do gene p16 na patogenia do melanoma esporádico de mucosa oral. Não houve relação da sugestão de alteração genética do gene p16 e de sua expressão tecidual com a espessura dos melanomas cutâneos de diferentes subtipos histológicos.

Palavras-chave: Biologia molecular; Genes p16; Imuno-histoquímica; Melanoma


 

 

INTRODUÇÃO

O melanoma é o mais maligno dos tumores cutâneos e acomete indivíduos predominantemente na idade adulta, entre 30 e 60 anos de idade. A incidência de melanomas cutâneos, apesar dos avanços no campo da prevenção, tem aumentado.1 Nos Estados Unidos, a incidência desse tumor passou de 1:1.500 indivíduos, em 1953, para 1:100 indivíduos, em 1996.2

Cerca de 90% dos melanomas ocorrem na superfície cutânea, e quase 2% surgem nas superfícies mucosas. Os sítios mais comuns para melanomas mucosos são a região de cabeça e pescoço. Melanomas mucosos, em geral, ocorrem com incidência anual de quatro casos por 10 milhões de habitantes, enquanto melanomas orais têm incidência de 1,2 caso por 10 milhões de habitantes/ano.3

Os melanomas orais acometem indivíduos na sexta e sétima décadas de vida. Os sítios anatômicos mais comuns são palato duro, gengiva e mucosa alveolar,4 representando 0,5% das neoplasias da cavidade oral. As séries de melanomas bucais recentemente descritas têm números pequenos de casos, como a série de Garzino-Demo et al.,5 com 10 casos num período de 10 anos, e a de Buchner et al.,6 com cinco casos no total de 773 lesões melanocíticas solitárias bucais, num período de 19 anos.

A deleção e mutação do gene MTS1 (multiple tumor suppressor 1) localizado no cromossomo 9p21, que codifica um inibidor da ciclina dependente de quinase 4, p16, têm sido implicadas na tumorigênese do melanoma e de outras neoplasias.7 A perda de expressão de p16 tem sido relacionada com a progressão do melanoma familiar.8 Entretanto, a perda parcial ou incompleta de expressão de p16 é também verificada nos melanomas esporádicos.9

Pouco se conhece a respeito da tumorigênese dos melanomas mucosos da cavidade oral. Na tentativa de compreender os mecanismos peculiares dessa neoplasia, buscou-se verificar a existência de possíveis alterações do gene p16, por meio da técnica da reação em cadeia da polimerase/polimorfismo conformacional de fita simples do DNA (PCR-SSCP), e a expressão da proteína p16, pela análise imuno-histoquímica, e sua correlação com melanomas cutâneos.

 

CASUÍSTICA E MÉTODOS

Foram avaliados 36 espécimes de melanoma primário. Sete eram de lesões da cavidade oral (três do palato, três do palato com extensão para o rebordo alveolar e um do lábio inferior) e 29 de lesões cutâneas (seis casos de lentigo maligno melanoma de até 1mm de espessura, um caso de lentigo maligno melanoma de espessura superior a 1mm; cinco casos de melanoma de tipo extensivo superficial de até 1mm de espessura; seis casos de melanoma de tipo extensivo superficial de espessura superior a 1mm; quatro casos de melanoma acral lentiginoso com espessura de até 1mm e sete casos de melanoma acral lentiginoso de espessura superior a 1mm). Nenhum paciente apresentava antecedentes familiares de melanoma.

 

Análise genética de p16

Foram obtidos entre 10 e 20 cortes de 10mm dos espécimes embebidos em parafina, colhidos em lâminas de vidro previamente lavadas em álcool absoluto. Com o auxílio de lâmina de bisturi, o tecido tumoral foi microdissecado dos cortes não corados e visualizado com lupa estereoscópica. Como referência foram utilizados cortes seqüenciais, corados com hematoxilina e eosina, de forma a auxiliar no momento da microdissecção.10,11 O material dissecado, em condições estéreis, foi transportado para tubos Eppendorf para a extração do DNA. Para tanto, os cortes foram submetidos à desparafinização com xilol a 65ºC e lavagem em cadeia descendente de etanóis.

O material foi incubado em tampão de lise (Tris- HCl 1M pH 8,0; EDTA 0,5M pH8; NaCl 1M; SDS 10%) e proteinase K (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) na concentração de 500mg/mL. Os tubos foram mantidos em banho-maria de três a cinco dias a 55ºC, até a completa dissolução do corpo de fundo do tecido. Adicionouse proteinase K (10 a 30mL na concentração de 250mg/mL) em intervalos de 24 horas, e os tubos foram invertidos, pelo menos uma vez ao dia. Fez-se a inativação da enzima por meio de temperatura de 95ºC, durante 10 minutos.12,13

Foram adicionados aos tubos Eppendorf 200mL de acetato de amônio 4M (Synth, BR), para a precipitação da proteína. Fez-se agitação por 20 segundos, em velocidade máxima, em cuba com gelo, durante cinco minutos, e centrifugação a 15.000 x g, por três minutos. O sobrenadante, contendo o DNA, foi transferido para outro tubo de 1,5mL. Para a precipitação do DNA foram adicionados 600mL de isopropanol. Após homogeneização, fez-se centrifugação a 15.000 x g por cinco minutos. O corpo de fundo dos tubos foi lavado com etanol 70% e centrifugado a 16.000 x g, por um minuto. Removido o etanol 70%, o corpo de fundo do DNA foi dissolvido em 30-50mL de tampão TE (Tris-HCL 10mM, pH 7,4 e EDTA 1mM, pH 8) e mantido a 4oC até a quantificação e detecção da pureza em espectrofotômetro para utilização na PCR.

Obtidas as amostras de DNA dos casos avaliados, fez-se a quantificação espectrofotométrica (260/280nm) em espectrofotômetro (DU 640, Nucleic Acid and Protein Analyzer, Beckman, USA) utilizando 5mL do DNA e 995mL de solução de TRIS/EDTA. A integridade do material foi visualizada em gel de agarose 0,8% (massa/volume) contendo 5mL de brometo de etídio (GIBCO BRL, Life Technologies). Os DNAs foram diluídos para a concentração final de 100ng a partir do resultado obtido relativo à concentração do DNA, em cada caso.

A análise de possíveis alterações do gene p16 foi realizada pela técnica de PCR-SSCP.14

Os iniciadores (Quadro 1) foram desenhados com base em seqüência depositada no GeneBank (número de acesso AF527803) utilizando o programa GeneTool 1.0 (BioTools Incorporated, Alberta, Canadá), para amplificar no máximo 200 pares de bases (pb) dos exons 1, 2 e 3 do gene p16.

As reações de PCR foram realizadas em termociclador modelo PTC-100TM (Programmable Thermal Controller, MJ Research, Inc.). Submeteu-se o material durante dois minutos a 95ºC, seguidos por 35 ou 38 ciclos de um minuto a 94ºC, um minuto entre 60°C e 64ºC (conforme o iniciador, quadro 1) e 40 segundos a 72ºC, finalizando com uma extensão de 10 minutos a 72ºC. A amplificação de cada um dos casos foi verificada pela passagem de 10mL do produto da PCR em gel de agarose 1% (1g de NueSieve GTG agarose - FMC, BioProducts, Rockland, Manie USA; 1g de Seakem GTG agarose - FMC, BioProducts, Rockland, Manie USA; 100mL de TRIS-acetato/EDTA 10X, 4mL de brometo de etídio) contido em uma cuba de eletroforese (OWL Scientific Plastics, Inc., USA). Utilizaram-se 5mL de "Low DNA Mass Ladder" (Life Technologies, Gibco BRL, U.S.) para estimar a massa do exemplar de DNA dos casos e para comparar a intensidade das bandas.

Constatada a amplificação dos produtos de PCR em gel de agarose, foi realizada a eletroforese em gel de poliacrilamida (modificação do método de Maniatis et al.15). Foi utilizado gel na concentração de 8% (29,9ml de H2O mili-Q, 2,6mL TAE 10X, 5,2mL de glicerol 50%, 14,3mL de acrilamida 30%, 520mL APS 10% e 52mL Temed) obtendo-se uma faixa efetiva de separação de 60 a 400pb, abrangendo assim a faixa de tamanho dos fragmentos do estudo. O produto da PCR foi misturado a um tampão de corrida (formamida 98%, EDTA 10mM, bromofenolblue 0,05% e xilenocyanol 0,05%) e colocado a 95ºC durante 10 minutos para a desnaturação. Após seu resfriamento em gelo, a mistura foi aplicada nas canaletas do gel, montado na cuba de eletroforese. Em uma das canaletas foi aplicado o padrão de peso molecular (Low DNA Mass Ladder, Life Tecnologies) para a determinação do peso molecular do fragmento amplificado. A corrida foi feita em tampão TAE 1X, durante aproximadamente cinco horas, à temperatura ambiente (TA). Após o término da corrida, o gel foi corado pela prata e revelado para a visualização das bandas do DNA. Inicialmente fez-se uma fixação com solução de etanol 10% e ácido acético 0,75% durante 20 minutos. Em seguida, procedeu-se à impregnação pela prata 0,2% durante 30 minutos, lavagem em água miliq durante dois minutos, revelação em solução de NaOH 3% e formaldeído 0,3% por no mínimo 20 minutos. A reação foi finalizada com solução de ácido acético 10% durante 10 minutos, lavagem em água mili-Q durante 10 minutos e secagem em papel celofane. Todos os procedimentos foram realizados na ausência de luz, sob agitação à TA (método modificado de Bassan et al.16).

Em todas as reações de PCR foram utilizados controle positivo (caso de hiperplasia fibrosa inflamatória oral) e controle negativo, constituído por todos os reagentes presentes na reação e isento de DNA.

A observação e documentação das reações foi feita por transluminador de luz ultravioleta (UV – Fotodyne, INC) e câmera fotográfica Polaroid (DS 4 – Fischer Biotech), com filme Polaroid tipo 667. Em todos os géis foi colocado, para interpretação padrão, um marcador de pb (Low DNA Mass Ladder, Invitrogen).

Todos os géis foram "escaneados" e gravados em formato TIFF, RGB, 300 dpis (preto-e-branco) no programa AdobePhotoshop 5.0. Os resultados de cada caso foram comparados ao do espécime de hiperplasia fibrosa inflamatória oral. A análise foi realizada por três observadores e se estabeleceram padrões comparativos de análise (do 1 ao 14). Todos os procedimentos foram realizados em duplicata.

Demonstração de expressão de proteína p16

Fez-se a demonstração de possível expressão da proteína p16 por meio da técnica de imuno-histoquímica, com o anticorpo primário monoclonal p16INKa Ab-4, clone 16P04 Labvision (Fremont, CA, USA) diluído 1/40, precedida de exposição antigênica com tampão citrato pH 6,0 aquecido por microondas. Fez-se incubação com o anticorpo primário, durante uma noite, a 4ºC e revelação da reação com o sistema LSAB-DAKO. O cromógeno utilizado foi a 3,3'-diaminobenzidine com níquel (DAB/Niquel). Omitiu-se a contracoloração para facilitar a vizualização da reatividade nuclear. Como controle positivo da reação utilizaram-se fragmentos de nevo nevocelular.17,18 Como controle negativo da reação, o anticorpo primário foi substituído por solução salina tamponada com fosfato. A expressão de p16 foi considerada positiva quando mais de 10% das células neoplásicas exibiam imunomarcação nuclear ao exame de campos microscópicos de 400x.19

 

RESULTADOS

Os resultados da análise molecular do gene p16 em sete melanomas da cavidade oral e 29 tumores cutâneos estão relatados abaixo e no quadro 2. Não houve amplificação em dois dos espécimes de melanoma de cavidade oral.

Exon 1

Ao se analisarem os padrões de migração de bandas referentes aos produtos de PCR do iniciador p16F, observou-se um único padrão (padrão 10), semelhante ao controle. Com o iniciador p16G observaram-se quatro padrões de migração de bandas: padrão 11 (padrão normal semelhante ao controle) e padrões 12, 13 e 14 (padrões sugestivos de alterações). Os melanomas da mucosa oral exibiram padrão 13, e os tumores cutâneos, independentemente de sua espessura, demonstraram padrões 12, 13 e 14 de migração de bandas (Figura 1).

 

 

 

Exon 2

Três padrões de migração de bandas foram verificados com o iniciador p16C: o padrão 5 (padrão normal semelhante ao controle) e os padrões 6 e 7 (- padrões sugestivos de alterações). Melanomas mucosos e melanomas cutâneos extensivos superficiais demonstraram os padrões 6 e 7 de migração; os subtipos lentigo maligno e acral lentiginoso apresentaram apenas o padrão 6 de migração. Os padrões 8 e 9, referentes ao iniciadores p16D e p16E, respectivamente, foram semelhantes aos padrões exibidos pelo controle (Figura 2).

 

 

Exon 3

Com o iniciador p16A, o mesmo padrão de migração de bandas (semelhante ao controle – padrão 1) foi encontrado tanto nos tumores de mucosa oral quanto nos tumores cutâneos, não demonstrando assim qualquer indício de alteração dessa região do gene. Com o iniciador p16B foram observados três padrões de migração de bandas: padrão 2 (semelhante ao controle) e padrões 3 e 4 (padrões sugestivos de alteração). O padrão 3 foi observado nos casos de lentigo maligno melanoma de espessura menor ou igual a 1mm. O padrão 4 foi encontrado nos melanomas de tipo extensivo superficial, independente de sua espessura. Todos os tumores mucosos exibiram o padrão 2 de migração de bandas (Figura 3).

 

 

Demonstração de expressão de proteína p16

No controle positivo representado por nevo nevocelular, a expressão de p16 fez-se com padrão de marcação nuclear forte e, por vezes, marcação citoplasmática (Figura 4A). A imunomarcação citoplasmática não foi considerada positividade de expressão de p16 nos casos estudados.

 


 

Dos cinco melanomas mucosos apenas um (caso 30) exibiu imunomarcação nuclear em cerca de 30% das células neoplásicas (Figura 4B).

Dos 21 casos de melanoma cutâneo submetidos à imuno-histoquímica para demonstração da proteína p16, 17 apresentaram imunomarcação nuclear considerada positiva (i.e. acima de 10% de núcleos de células neoplásicas imunomarcados). Dos seis casos de lentigo melanoma de espessura de até 1mm, cinco apresentaram expressão de p16. O único caso de lentigo maligno melanoma de espessura superior a 1mm não exibiu imunomarcação positiva. Quatro em cinco casos de melanoma extensivo superficial delgado (de até 1mm de espessura) expressaram a proteína p16. Os quatro casos de melanoma extensivo superficial, com espessura superior a 1mm, marcaram-se pelo anticorpo p16. Um de dois casos de melanoma acral lentiginoso de até 1mm de espessura exibiu imunomarcação para p16 (Figura 4C), e todos os três casos de melanoma acral lentiginoso espesso (espessura superior a 1mm) expressaram a proteína p16 (Figura 4D).

Comparando-se, nos mesmos tumores, os resultados da expressão, ou ausência de expressão, de p16 (pela técnica imuno-histoquímica) com os indícios de alteração observados pela análise molecular (Quadro 1), observa-se que: três dos quatro casos de melanoma de mucosa oral com ausência de expressão de proteína p16, ao estudo imuno-histoquímico, apresentaram alteração na análise molecular do gene p16. O caso com presença de expressão tecidual de p16 apresentou indício de alteração na análise do exon 2 (p16C). Dos 17 espécimes de melanoma cutâneo com expressão de p16 evidenciada pela técnica imuno-histoquímica, 11 apresentaram indício de alteração de p16 pela análise molecular realizada. Seis casos com expressão de p16 não apresentaram indício de alteração do gene p16 à análise molecular. Dos quatro casos de melanoma cutâneo com ausência de expressão de p16, dois apresentaram indício de alteração à análise molecular (casos 14 e 16).

 

DISCUSSÃO

A análise molecular de p16 revelou que parte dos tumores analisados (71,42% dos melanomas mucosos e 58,6% dos cutâneos) apresentou indícios de alteração nos exons 1, 2 e 3 (ver Quadro 1). O exon 2 foi o que mais freqüentemente apresentou indício de alteração, tanto nos tumores cutâneos quanto nos tumores mucosos.

Cinco em sete (71,42%) melanomas mucosos estudados revelaram padrão sugestivo de alteração para o exon 2 (p16C), sendo quatro casos com padrão 6, e um com padrão 7. Um caso também apresentou indício de alteração para o exon 1 (p16G – padrão 13).

Os melanomas mucosos são muito raros e representam somente 0,5% das neoplasias da cavidade oral. As séries de melanomas orais, recentemente descritas, apresentam números pequenos de casos.5,6 Quanto ao estudo genético de p16 nesse tipo de melanoma, há somente o trabalho de Chang et al.,20 que realizaram o estudo genético de p16 numa linhagem de melanoma obtida de um único caso de melanoma primário de palato. Observaram ausência de transcrição de p16, pela análise mediante a técnica de RT-PCR, na linhagem celular obtida a partir do tumor primário. Os resultados obtidos da casuística aqui apresentada mostram que a freqüência de indícios de alteração na análise genética de p16, pela metodologia empregada, é alta (71,42%). Esse dado sugere a participação de possíveis alterações do gene p16 na patogenia do melanoma esporádico de mucosa oral.

Um dos sete espécimes de melanoma oral (caso 36) não apresentou amplificação para as seqüências analisadas. Talvez isso se deva ao fato de que foi utilizado material recuperado de espécimes submetidos às técnicas histológicas de rotina (fixado em formol e embebido em parafina) com a possibilidade de alguma interferência durante o processamento.

Entre os 29 melanomas cutâneos foram observados 14 casos com indício de alteração para o exon 2 (p16C), sendo 12 casos com padrão 6, e dois com padrão 7. Cinco em 29 casos de melanoma cutâneo exibiram indícios de alteração para o exon 3 (p16B), um com padrão 3 e quatro com padrão 4. Indícios de alteração para o exon 1 foram observados em 10/29 casos de melanomas cutâneos (cinco casos com padrão 12; três, com padrão 13; e dois, com padrão 14).

Quando se correlaciona o encontro de indício de alteração com o tipo histológico e microestadiamento dos melanomas cutâneos, verifica-se que quatro casos de lentigo maligno melanoma de até 1mm de espessura apresentaram indício de alteração (dois casos para o exon 2 e 1; um caso para o exon 3 e 1; e um caso para o exon 2). O único caso de lentigo maligno melanoma com mais de 1mm de espessura não apresentou indício de alteração à análise genética de p16. Dois casos de melanoma maligno de tipo extensivo superficial de até 1mm de espessura apresentaram indício de alteração com os exons 3, 2 e 1, assim como dois casos do mesmo tipo histológico com mais de 1mm de espessura. Neste último grupo, um caso apresentou indício de alteração de p16 com o exon 2. O grupo de melanoma de tipo acral lentiginoso apresentou indício de alteração à análise com o exon 2 e 1; sendo que um caso de até 1mm de espessura apresentou indício de alteração para o exon 2 e exon 1 e, um somente para o exon 1. Cinco casos acrais lentiginosos, com espessura superior a 1mm, apresentaram indício de alteração: quatro para o exon 2, e um para o exon 1.

Em resumo, a análise genética de p16 nos melanomas cutâneos revelou indício de alteração em quatro de seis (66%) casos de lentigo maligno melanoma de até 1mm de espessura; três de cinco (60%) casos de melanoma maligno de tipo extensivo superficial de até 1mm de espessura; três de seis (50%) casos de melanoma maligno de tipo extensivo superficial superior a 1mm de espessura; dois de quatro (50%) melanomas acrais lentiginosos de até 1mm de espessura e cinco de sete (71,4%) melanomas acrais lentiginosos de espessura superior a 1mm. A freqüência de encontro de indícios de alteração de p16 na totalidade dos casos de melanoma cutâneo estudados foi de 58,6% (17 de 29 casos).

Considerando-se a totalidade dos casos de melanoma estudados (n=36) verifica-se também a maior freqüência de indício de alteração do exon 2 de p16 (19 de 36 casos, freqüência de 52,77%), seguida pelo exon 1 (11 de 36 casos, freqüência de 30,55%) e exon 3 (cinco de 36 casos, freqüência de 13,88%). Lamperska et al.21 relatam que a maioria das mutações de p16 descritas no melanoma maligno é do exon 2.

A presente casuística é representada por melanomas malignos esporádicos, isto é, sem história de melanoma maligno familiar. O gene p16 é considerado o gene de susceptibilidade ao melanoma devido a sua freqüente inativação nos melanomas malignos familiares.7 Entretanto, a perda parcial ou incompleta de expressão de p16 é também verificada nos melanomas esporádicos.9 Outros autores, entretanto, referem que mutação do gene CDKN2A é pouco freqüente no melanoma maligno esporádico.22-24

Neste estudo não houve correlação entre as freqüências de indício de alteração de p16 com a espessura das lesões cutâneas. Os melanomas de até 1mm de espesssura dos diferentes tipos histológicos apresentaram freqüência de indícios de alteração de 60% (nove de 15 casos), e nos de espessura superior a 1mm esta foi de 50% (sete de 14 casos). Cachia et al.11 não observaram anomalias à análise de p16 pela técnica de PCR-SSCP ao comparar dois grupos de melanoma maligno primário (19 casos com espessura de até 0,75mm a 20 casos com espessura superior a 3mm). Concluíram que a mutação de p16 é rara tanto nos melanomas delgados como nos espessos. Esses autores realizaram microdissecção do tecido por técnica semelhante à aqui empregada. Ressaltam que a possibilidade de contaminação do material assim obtido, por tecido normal adjacente ao tumor, é inferior a 25% para os tumores delgados e inferior a 10% para os tumores mais espessos.

Optou-se por comparar melanomas de até 1mm e de espessura superior a 1mm, uma vez que essa medida do microestadiamento é considerada linha de corte para a conduta terapêutica, no que diz respeito às margens de segurança e pesquisa de linfonodo sentinela.25

A expressão de p16 observada com a técnica imuno-histoquímica demonstrou padrão de marcação nuclear e citoplasmática no controle positivo (nevo nevocelular). Esse padrão de expressão é relacionado com a proteína p16 selvagem.18 Entretanto, não se considerou a positividade citoplasmática para a análise semiquantitativa dos casos estudados. A expressão de p16 foi observada somente em um caso de melanoma oral (caso 30). Ao contrário, Tanaka et al.19 verificaram expressão tecidual de p16 em sete de 13 casos de melanoma oral.

Nos melanomas cutâneos não foram encontradas diferenças na expressão de proteína p16 entre os casos delgados (10 de 13 ou 76,9%) e os melanomas espessos (sete de oito ou 87,5%). Esses resultados estão de acordo com os de Ghiorzo et al.,18 que também não encontraram diferença de expressão de p16 ao comparar melanomas in situ, melanomas primários invasivos e metastáticos.

Observou-se em alguns casos de melanoma cutâneo imunomarcação citoplasmática, além da nuclear, pelo p16, semelhante aos achados de Radhi26 e Mihic-Probst et al.17 Em células normais ocorre expressão de p16 tanto nuclear como citoplasmática. A expressão somente nuclear estaria relacionada com provável mutação alélica do gene p16.18

Ao se compararem os resultados da expressão, ou ausência de expressão, de p16 com os indícios de alteração observados pela análise molecular, nos mesmos tumores, observa-se expressão de proteína p16 concomitante com evidências de alteração na análise molecular do gene p16 em 12 casos (um mucoso e 11 cutâneos). Por outro lado, verifica-se a ausência de expressão de proteína p16 em seis casos que apresentaram indício de alteração do gene p16 pela análise molecular (quatro mucosos e dois cutâneos). Seis casos com expressão de proteína p16 não apresentaram indícios de alteração do gene p16 à análise molecular.

A literatura refere que a perda de expressão do gene p16 é freqüente em neoplasias cutâneas malignas. 27 A falta de expressão de p16 seria evidência de mutação ou deleção do gene p16.28 A perda da expressão de p16 é mais freqüentemente observada em melanomas mais espessos e nas metástases.29,30 Nesta casuística verificou-se que, nos tumores mais espessos, a expressão de p16 foi observada em sete de oito casos, sendo que em quatro deles concomitante com indícios de alteração do gene p16 à análise molecular.

 

CONCLUSÃO

A freqüência de indícios de alteração na análise genética de p16 nos melanomas de mucosa oral foi de 71,4%. Nos melanomas cutâneos estudados foi de 58,6%. Pode-se sugerir a participação de alterações do gene p16 na patogenia do melanoma esporádico de mucosa oral. Não houve relação de sugestão de alteração de p16 com o nível de invasão dos melanomas cutâneos de diferentes subtipos histológicos. A expressão tecidual de p16 também não se correlacionou com a espessura das lesões. Foi observada em 10 de 13 (76,9%) casos de melanoma cutâneo de espessura até 1mm e em sete de oito (87,5%) casos de espessura superior a 1mm.

 

AGRADECIMENTO

Apoios: FAPESP - Processos 02/08881-1 e 03/09703-2; CNPq - Processo 504726/2003-0 e CAPES. Projeto de Pós-Doutorado, processo USP 3174104 (Sousa FB).

 

REFERÊNCIAS

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Endereço para correspondência:
Mírian N. Sotto
Alameda Itu, 1299 - apto. 61
01421-001 - São Paulo - SP - Brazil
Tel: (11) 3088-4894 / Fax: (11) 3088-5604
E-mail: mnsotto@usp.br

Recebido em 06.07.2005.
Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 29.08.2006.

 

 

Conflito de interesse declarado: Nenhum
* Trabalho realizado no Departamento de Dermatologia da Faculdade de Medicina e no Laboratório de Biologia Molecular da Disciplina de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia. Universidade de São Paulo - São Paulo (SP), Brasil.