Efeitos do uso crônico da dexametasona na cicatrização de feridas cutâneas em ratos

Effects of chronic use of dexamethasone on cutaneous wound healing in rats

INVESTIGAÇÃO CLíNICA, EPIDEMIOLÓGICA, LABORATORIAL E TERAPÊUTICA

Efeitos do uso crônico da dexametasona na cicatrização de feridas cutâneas em ratos^*

Effects of chronic use of dexamethasone on cutaneous wound healing in rats

Fernando Pundek Tenius^I; Maria de Lourdes Pessole Biondo-Simões^II; Sérgio Ossamu Ioshii^III

^IMestre em Princípios da Cirurgia pelo Instituto de Pesquisas Médicas (IPEM) Curitiba (PR) - Brasil. Membro titular da Sociedade Brasileira de Cirurgia Plástica - Curitiba (PR), Brasil

^IIDoutora em Cirurgia Experimental pela Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) Escola Paulista de Medicina (EPM), Professora de Técnica Cirúrgica e Cirurgia Experimental da Universidade Federal do Paraná (UFPR) - Paraná (PR), Brasil, e de Metodologia da Pesquisa da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR) - Paraná (PR), Brasil, Titular do Colégio Brasileiro de Cirurgiões (CBC) - São Paulo (SP), Brasil

^IIIDoutor em Patologia Experimental e Professor de Patologia da Universidade Federal do Paraná (UFPR) e Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUC-PR) - Paraná (PR), Brasil

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTOS: Acredita-se que os glicocorticóides prejudiquem a cicatrização, causando decréscimo da proliferação celular, da neovascularização e da produção de matriz.

OBJETIVO: Investigar os efeitos do uso crônico dos corticoesteróides na cicatrização de feridas cutâneas.

MÉTODOS: Após injeções de dexametasona (0,1mg/kg/dia) por 30 dias, fez-se incisão no dorso de ratos e estudou-se a cicatrização no terceiro, sétimo e 14o dias. A resistência da cicatriz, a densidade do colágeno e a reação inflamatória foram avaliadas pela histometria.

RESULTADOS: As cicatrizes do grupo tratado com dexametasona eram menos resistentes à tração em todos os tempos (p=0,008) e apresentavam menor densidade de colágeno. A do colágeno tipo III foi menor em todos os tempos estudados (p<0,0001), e a do colágeno tipo I foi menor apenas no 14º dia (p<0,0001). A infiltração de células inflamatórias foi menor no grupo tratado com dexametasona nas duas primeiras avaliações (p=0,001 e p=0,016), não sendo significativa a diferença no 14º dia (p=0,367).

CONCLUSÕES: Verificou-se diminuição da resistência da cicatriz e baixa densidade do colágeno total em todos os tempos estudados. No início do processo observou-se baixa densidade do colágeno tipo III e mais tarde também baixa densidade do colágeno tipo I. Nos tempos iniciais houve redução do número de células inflamatórias.

Palavras-chave: Cicatrização de feridas; Colágeno; Dexametasona

ABSTRACT

BACKGROUND: Glucocorticoids are believed to hinder healing process, causing decreased cell proliferation, neovascularization and matrix production.

OBJECTIVE: To investigate the effects of the chronic use of corticosteroids on skin wound healing.

METHODS: After daily injections of dexamethasone (0.1 mg/Kg) for 30 days, an excision was made in the dorsum of rats. Wound healing was evaluated at postoperative days 3, 7 and 14. Scar resistance, collagen density and inflammatory reaction were assessed by histometry.

RESULTS: The scars of the dexamethasone-treated group were less resistant to traction in all days (p=0.008) and presented lower collagen density. Collagen III density was affected at all times (p<0.0001) and collagen I density was lower only on day 14 (p<0.0001). The inflammatory cell infiltration was less intense in the dexamethasone-treated group in the first two evaluations (p=0.001 and p=0.016), but there was no significant difference on day 14, (p=0.367).

CONCLUSIONS: We observed decreased scar resistance and lower total collagen density in all periods studied. In the beginning of the process, low collagen III density was observed and later collagen type I density was also decreased. Reduced number of inflammatory cells was found in the first two evaluations.

Keywords: Collagen; Dexamethasone; Wound healing

INTRODUÇÃO

A medicina é ciência conhecida por apresentar resultados nem sempre previsíveis. Muito se tem feito para a obtenção de resultados mais precisos, buscando condição mais exata dentro de seu enorme espectro de variáveis.

O uso terapêutico de glicocorticóides, com exceção da terapia de reposição, é de certa forma empírico, sendo a dose ajustada de acordo com as necessidades de cada paciente. O uso contínuo, além dos problemas acarretados pela supressão do eixo hipotalâmico-hipofisário-adrenal, pode levar a outras complicações, como anormalidades hidroeletrolíticas, hipertensão arterial, hiperglicemia, suscetibilidade aumentada a infecções, osteoporose e outras, a par do hábito peculiar da superdosagem de esteróides, que compreendem a redistribuição do tecido adiposo, estrias, equimoses, acne e hirsutismo.

A cicatrização cutânea é processo complexo envolvendo inflamação, reepitelização, angiogênese, formação de tecido de granulação e deposição de matriz intersticial, eventos realizados por grande número de diferentes tipos de células, como queratinócitos, fibroblastos, células inflamatórias e endoteliais, influências célula a célula, interação entre células, matriz intersticial e fatores de crescimento de modo a reparar os tecidos danificados.¹

Acredita-se que os glicocorticóides prejudiquem a cicatrização, provavelmente causando decréscimo da proliferação celular, da neovascularização e da produção de matriz.^2,3 Em animais foi relatado retardo do afluxo de macrófagos, neutrófilos e fibroblastos. ⁴ Admite-se que os corticosteróides suprimam a fase inflamatória da cicatrização.⁵

Foi demonstrado que a transcrição do RNAm para o colágeno tipo I é diminuída pelos glicocorticóides. A expressão dos receptores para TGF-β1, TGF-β2 e para TGF-β tipo II é suprimida pelos glicocorticóides. ⁶ Foi relatada importante diminuição da concentração de hidroxiprolina com o uso da hidrocortisona em ratos (p<0,01). É possível que o uso crônico de corticóides possa influenciar a reepitelização, a neovascularização e a síntese do colágeno.⁷

Alguns autores descrevem que corticosteróides usados por longos períodos levam às alterações citadas acima, porém a administração feita de forma intermitente não teria influência na reparação tecidual.⁸ Afirma-se que o uso continuado atrasa o processo de cicatrização, o que não acontece com o uso de dose única no pós-operatório.⁹

Pacientes portadores de doenças crônicas fazem uso dessas substâncias por anos, quando não por toda a vida. Esse uso continuado poderia elevar o número de complicações pós-operatórias, como eventrações, deiscências de pele e mesmo de anastomoses.

O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do uso crônico da dexametasona no processo de reparação de feridas cutâneas de ratos, especialmente quanto à reação inflamatória, resistência e densidade de colágeno.

MÉTODOS

A realização do estudo obedeceu à Lei Federal 6.638 e às normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (Cobea).

Utilizaram-se 60 ratos machos (Rattus norvegicus albinus, Rodentia mammalia), da linhagem Wistar, PUC-PR, com idade de 90 dias e peso médio de 250 gramas, devidamente identificados. Os ratos ficaram alojados em grupos de cinco animais em caixas de polipropileno de dimensões padronizadas para a espécie. O ciclo claro/escuro e a umidade do ar foram os próprios do ambiente, e a temperatura variou entre 20 ± 2ºC. Todas as caixas ficaram a igual distância da fonte de luz, e os animais tiveram livre acesso à ração de padrão comercial e à água durante todo o experimento.

Dividiu-se a amostra em dois grupos de 30 animais. Ao primeiro grupo administrou-se, durante 30 dias, dexametasona 0,10mg/kg de peso corporal, por meio de injeções subcutâneas. Ao segundo grupo administrou-se solução salina 0,9% com iguais volume e via de administração do grupo anterior, sendo esse segundo o grupo controle. As injeções foram feitas diariamente e sempre no mesmo horário.

Após 30 dias, sob anestesia obtida por injeção intramuscular de 0,2 ml/kg de uma mistura de 1ml de quetamina e 1ml de xilazina, realizou-se a tricotomia da pele da região dorsal dos animais e anti-sepsia com polivinilpirrolidona-iodo. Fez-se uma incisão de 4cm de comprimento na região dorso-medial de cada animal, que se estendeu em profundidade até a fáscia muscular. Seguiu-se com a síntese da ferida com pontos simples de fio monofilamentar de náilon 4.0 separados entre si por 0,5cm. Recuperados da anestesia, devolveram-se os ratos a suas caixas de origem. No pós-operatório manteve-se a dexametasona ou a solução fisiológica em iguais dosagem e via de administração até o dia da avaliação.

Sortearam-se 10 ratos de cada grupo para eutanásia no terceiro, sétimo e 14º dias do pós-operatório, com dose letal do anestésico. Retirou-se um fragmento de pele com tela subcutânea que continha a cicatriz com margem de 2cm à direita, à esquerda, acima e abaixo, que foi dividido em quatro partes, cada uma de 1cm. O primeiro e o quarto segmentos, correspondentes às extremidades, foram desprezados, tendo-se utilizado os dois segmentos mediais para as avaliações.

Utilizou-se um dos segmentos para a medida da resistência. Acondicionaram-se os retalhos em frascos com solução fisiológica para manter a umidade e imediatamente após realizaram-se os ensaios em máquina de tração EMIC‚ no Laboratório de Análises Destrutivas da PUC-PR. Considerou-se força máxima a maior força ou carga aplicada ao corpo de prova, até sua ruptura. Aplicaram-se as forças sempre perpendicularmente à cicatriz, tentando afastar suas bordas, sendo a força medida em newtons.

O outro segmento do retalho, fixado em formalina tamponada a 10%, serviu para o estudo histopatológico, sendo analisado quanto à presença de reação inflamatória e densidade de colágeno. Para isso incluiu-se o retalho em parafina e fizeram-se cortes com quatro micrômetros de espessura, preparandose duas lâminas de cada peça, cada lâmina com três cortes, que foram submetidos à coloração pelas técnicas do Sirius-red (para avaliação do colágeno) e da hematoxilina-eosina (para avaliação geral do processo cicatricial).

Nos cortes corados pelo Sirus-red, analisados em microscópio de luz polarizada, reconheceu-se o colágeno tipo I, cujas fibras espessas adquirem tonalidades de laranja a vermelho, e o colágeno tipo III, cujas fibras finas e delicadas se coram de tons de verde.¹⁰ Leram-se quatro campos com ampliação de 200 vezes de cada corte e obteve-se uma média.

As imagens captadas por uma câmera Sony® CCD 101, transmitidas a um monitor colorido Trinitron Sony®, congeladas e digitalizadas através de placas oculus TCX, permitiram a análise pelo aplicativo Imagem Plus‚ 4.0 para Windows em microcomputador da linha Pentium®.

Nos cortes histológicos corados pela hematoxilina- eosina analisaram-se a reação inflamatória, sua qualidade e intensidade. A avaliação da qualidade da reação inflamatória se fez pelo tipo de células presentes nos campos examinados. Capturou-se a imagem dos campos escolhidos e neles se identificaram as células inflamatórias presentes. O predomínio de polimorfonucleares caracterizou a reação inflamatória aguda, de mononucleares a reação inflamatória crônica, e, quando não havia predomínio de nenhum desses tipos, caracterizou a reação inflamatória agudo-crônica. A contagem dessas células permitiu quantificar a intensidade da reação. Leram-se três campos em cada corte histológico e, neles, 100 pontos, com aumento de 400 vezes.

Os resultados descritivos do estudo foram expressos por médias e desvios padrões. Para a avaliação do efeito de grupo e do dia de avaliação sobre as variáveis do estudo, foi utilizada a análise de variância (Anova) com dois fatores (grupo e dia de avaliação). Para as comparações múltiplas foi usado o teste LSD, e para avaliação da homogeneidade das variâncias, o teste de Lèvene. Variáveis que não atingiram os pressupostos necessários ao uso da Anova sofreram previamente uma transformação logarítmica. Nos casos em que houve interação significativa entre os fatores, a análise foi feita dentro de grupos e dentro de dia, considerando-se o teste t de Student para a comparação dos grupos e a Anova para a comparação dos dias de avaliação. O nível de significância adotado foi de 0,05.

RESULTADOS

Não houve óbitos durante o experimento.

Nos dados da tensiometria, a análise entre grupo e dia mostrou não haver interação significativa entre esses fatores (p=0,207), ou seja, os resultados não dependem de combinações particulares de grupo e dia e podem, portanto, ser analisados de forma conjunta. Observou-se menor resistência à tração nas cicatrizes do grupo experimento nos três momentos estudados (p=0,008) (Tabela 1 e Gráfico 1).

A leitura da densidade do colágeno total permitiu verificar que existe interação significante entre os fatores grupo e dia de avaliação (p=0,018). Sendo assim, a análise foi feita considerando grupo e dia de avaliação separadamente. Nos três momentos avaliados a média dos percentuais das áreas ocupadas por colágeno foi maior no grupo controle (terceiro dia p=0,017, sétimo dia p=0,010 e 14º dia p<0,0001) (Tabela 2).

A análise dos percentuais de área ocupados por colágeno do tipo III mostrou que os resultados não dependem de combinações particulares de grupo e dia (p=0,126), e, portanto, foi possível avaliá- los de forma conjunta. Demonstrou-se que existiu diferença significante entre os grupos controle e experimento, nos três momentos de avaliação (p<0,0001), e, dessa forma, pôde-se verificar que havia mais colágeno III no grupo controle nos três tempos avaliados (Tabela 3).

Quando se analisou a densidade de colágeno tipo I, verificou-se que existia interação significante entre os fatores grupo e dia de avaliação (p<0,0001), e, dessa forma, a análise foi feita dois a dois dentro de tempo igual. Verificou-se que não houve diferença entre os grupos no terceiro dia (p=0,076) e no sétimo dia (p=0,200). Entretanto, no 14º dia a densidade era maior no grupo controle (p<0,0001) (Tabela 4). No gráfico 2 demonstra-se a densidade do colágeno nos três tempos estudados.

A média das células inflamatórias permitiu verificar que elas existiam em menor número no grupo experimento em todos os tempos, porém com significância no terceiro dia (p=0,001) e no sétimo dia (p=0,016) (Tabela 5 e Gráfico 3).

DISCUSSÃO

Pacientes que fazem uso crônico de corticóides, quando submetidos a procedimento cirúrgico, apresentam pele com comportamento distinto dos demais doentes e respondem ao processo regenerativo de forma diferente.

Não é a quantidade de colágeno, mas sua organização espacial, que proporciona resistência à ferida, e após o estabelecimento da cicatriz apenas 80% da resistência original da pele é recuperada. Em um estudo feito em cicatrizes de dorso de ratos, aos quais foi administrado dexametasona em doses crescentes (0,8, 5, 8 e 16mg/kg/dia) foi demonstrada menor resistência na avaliação feita do 10º dia e dose dependente.¹¹ Em outro, quando administrado 0,5mg/kg/dia de dexametasona a ratos, por período de sete dias, após o qual se fez um ferimento com síntese no dorso desses animais e se avaliou após 14 dias, encontrou-se significante diminuição da capacidade de suportar tração.¹² Quando utilizada a hidrocortisona, em dose equivalente a 1,5mg/kg de dexametasona, duas doses no pré-operatório com quatro horas e um dia de antecedência, e avaliação com sete e 14 dias, relatou-se perda de 11% da resistência em relação ao grupo controle no sétimo dia (p<0,01) e de 29% no 14º dia (p<0,01).⁷

Embora os resultados deste estudo não possam ser comparáveis aos dos autores acima citados, uma vez que a administração da dexametasona foi iniciada 30 dias antes de se induzir o processo de cicatrização, pôde-se verificar que a resistência das feridas do grupo controle foi, em todos os momentos, superior à do grupo experimento (p=0,008). Entretanto tanto o grupo controle quanto o grupo que recebeu dexametasona mostraram ganho gradativo de resistência. É interessante observar que, no 14º dia, a média de resistência obtida no grupo experimento foi de 4,469N, semelhante à encontrada no grupo controle no sétimo dia (4,799N) enquanto no grupo controle no 14º dia foi de 6,920N, ou seja, o grupo experimento precisou do dobro do tempo para alcançar a resistência do grupo controle.

Na literatura constata-se que esse efeito não é exclusivo na pele, tendo-se relatado perda de resistência em cicatrizes de traquéia de ratos,^7,13 em anastomoses intestinais de ratos, de coelhos e de cães.^14-16

Sabe-se que os esteróides e os retinóides exercem efeitos antagônicos sobre os fatores de crescimento e o depósito de colágeno na cicatrização de feridas.¹⁷ Estudo experimental, feito em ratos, demonstrou que os glicocorticóides influenciavam a síntese dos pró-colágenos tipo I e III de maneira semelhante, tanto na pele quanto nos pulmões.¹⁸ Van Story-Lewis e Tenenbaum¹⁹ observaram 43% de redução do gel de colágeno, em culturas de fibroblastos humanos, quando adicionaram a dexametasona às culturas e 80% quando adicionaram o cortisol.

Estudos demonstraram que os corticosteróides, entre eles a dexametasona, diminuíam a síntese do colágeno por redução do DNA e do RNA²⁰ e que fibroblastos, tanto da pele como do pulmão, diminuíam a síntese de RNAm para pro-α1(I) e pro- α2(I)α21-24.

Autio et al.²⁵ observaram a abolição da síntese de colágeno na pele de pacientes tratados com prednisolona. Para eles o uso sistêmico de glicocorticóides suprimia a síntese dos colágenos tipo I e III na derme, e, assim, sugeriram que isso fosse a causa da atrofia da pele.

A terapia com dexametasona levou à diminuição do RNAm para α1(I) e α1(III) colágenos na pele dos ratos. Essa diminuição baixou os níveis de tropocolágeno para ambos os tipos de colágeno, mais importante sobre o tipo III, sendo os níveis de metaloproteinases (Timps) e das colagenases também afetados. ²⁶ Além disso, a dexametasona inibiu a migração de células durante a cicatrização de feridas, devido à diminuição da expressão do gene alfa-SM actina.²⁷

Como na literatura, no estudo ora apresentado constatou-se significativa redução do colágeno tipo III no grupo experimento. O colágeno tipo I no grupo tratado com dexametasona revelou, nos dois primeiros tempos de avaliação, crescimento de densidade semelhante. No 14º dia, enquanto o grupo controle continuava a aumentar a densidade desse tipo de colágeno, no grupo experimento observou-se diminuição do colágeno tipo I e, em conseqüência, do colágeno total. Quando avaliados os grupos separadamente, verificou-se que o colágeno tipo III (por ser o colágeno que surge precocemente e, portanto, o tipo mais comum nas cicatrizes imaturas) aparece aumentado no início da avaliação, tanto no grupo controle quanto no grupo experimento, e vai sofrendo redução, que é estatisticamente significante. Já o colágeno do tipo I aparece com baixa concentração e vai aumentando gradativamente até o 14º dia. Porém no grupo experimento ocorre queda da concentração, o que não acontece no grupo controle. Isso resulta em alteração no colágeno total, no final do experimento.

A maioria dos autores afirma que a dexametasona diminui a estabilidade dos RNAs mensageiros para pro-α1(1) e pro-α2(1), e com isso deveria esperar-se uma curva de queda do colágeno tipo I. Isso foi verificado neste estudo, pois as cicatrizes do grupo controle apresentaram aumento gradativo do colágeno tipo I, e observou-se queda no grupo que recebeu dexametasona. Fassler et al.³ demonstraram que os glicocorticóides influenciavam negativamente a expressão do RNAm para o colágeno tipo I, o que explicaria a queda desse tipo de colágeno neste estudo.

O processo de cicatrização é controlado por uma extensa gama de fatores de crescimento, cujo entendimento não está bem elucidado. Segundo Centrella et al.,²⁸ os glicocorticóides afetam a expressão para os receptores dos TGF-β do tipo I e do tipo II, podendo alterar as respostas celulares a eles ligadas. Há registros de que sob o efeito da dexametasona existe forte baixa no RNAm para o TGF-β1 e para o TGF- β2, com diminuição da infiltração de células inflamatórias, da atividade dos neutrófilos e dos macrófagos.⁶ Descreveu-se, ainda, que a dexametasona tem efeito inibidor sobre a secreção de FDGF, fator de crescimento que estimula a proliferação de fibroblastos, e que induz o aparecimento de miofibroblastos.²⁹

Neste estudo verificou-se que a densidade de colágeno total, embora tenha sido sempre maior no grupo controle, foi maior nos tempos iniciais de avaliação devido às altas densidades do colágeno III. Apenas no 14º dia a maior densidade deveu-se ao colágeno tipo I. Esse tipo de colágeno oferece resistência à cicatriz; por isso, nesse tempo, a resistência das cicatrizes foi significantemente maior no grupo controle.

A redução da reação inflamatória é efeito já classicamente descrito na literatura; tanto, que os corticóides são também conhecidos como antiinflamatórios hormonais. Nguyen e Lim³⁰ mostraram o efeito dos corticóides sobre a função inflamatória em feridas cirúrgicas de ratos, com redução de pelo menos 50% da circulação de células inflamatórias no sítio pós-operatório no primeiro dia, seguido de queda da redução no terceiro e quinto dias. No presente estudo a medida das células inflamatórias esteve diminuída no grupo experimento em todos os momentos da avaliação e significativamente no terceiro e sétimo dias, caracterizando a ação da dexametasona na fase inflamatória da cicatrização. Convertido o número absoluto em percentual, é possível perceber que no terceiro dia, o número de células inflamatórias presentes no grupo experimento corresponde à diminuição de 60,31% em relação ao encontrado nos cortes histológicos do grupo controle. Neste estudo também se observou queda dessa redução no sétimo dia, correspondendo a 34,7% menos no grupo experimento em relação ao grupo controle.

CONCLUSÃO

A análise dos resultados permite concluir que, no rato, o uso prolongado de dexametasona sobre o processo de cicatrização leva: 1) à diminuição da resistência da cicatriz; 2) à baixa densidade do colágeno total em todos os tempos estudados, sendo no início do processo pela baixa densidade do colágeno tipo III e mais tarde pela baixa densidade do colágeno tipo I; e 3) à redução do número de células inflamatórias nos tempos iniciais.

AGRADECIMENTOS

Aos médicos residentes Gustavo Nogueira e Carlos Alberto Maeda, pela ativa participação na execução prática do estudo e à professora Márcia Olandoski, pelo inestimável trabalho de avaliação estatística.

Recebido em 08.06.2005.

Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 23.03.2007.

Conflito de interesse declarado: Nenhum.

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Trabalho realizado no Instituto de Pesquisas Médicas (IPEM) em parceria com a Pontifícia Universidade Católica do Paraná (PUCPR).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Jul 2007
• Data do Fascículo
  Abr 2007

Histórico

• Recebido
  08 Jun 2005
• Aceito
  23 Mar 2007