Inclusões de quitosana no subcutâneo de rato: avaliação clínica, histológica e morfométrica

Resumos

BACKGROUND: Chitosan is a polymer derivative from chitin applied in many medical specialties. OBJECTIVE:To evaluate the biocompatibility of chitosan membranes used as inclusion material into subcutaneous of rats. METHODS: Twenty male Wistar rats received chitosan membranes into the subcutaneous area of the dorsal medial region. The animals were randomly divided in four groups with 5 animals each, sacrificed on 7th (G1), 15th (G2), 30th (G3) and 60th (G4) postoperative day (PO). All animals were clinically evaluated daily and by photo-documentation at the sacrifice moment. The animals and the material were assessed for evidence of host response by histological and morphometric evaluation of the implants and the surrounding soft tissues. The material was fixed in 10% formalin and then the sections were stained with hematoxylin and eosin. RESULTS: None of animals presented side effects attributable to the implants. The histological evaluation showed smooth and homogeneous inclusions with no host cells inside and were encircled by a pseudocapsule of fibroblasts and inflammatory cells. The morphometric evaluation showed no statistical difference between different groups (P>0.05).

Biocompatible materials; Chitosan; Materials testing; Rats, Wistar

INVESTIGAÇÃO DERMATOLÓGICA

Inclusões de quitosana no subcutâneo de rato: avaliação clínica, histológica e morfométrica^*

Maila Karina Mattos de Brito^I; Silvana Artioli Schellini^II; Carlos Roberto Padovani^III; Claudia Helena Pellizzon^IV; Cypriano Galvão da T. Neto^V

^IMestre, Departamento de Oftalmologia, Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista (Unesp) - Botucatu (SP), Brasil

^IIProfessora titular, Departamento de Oftalmologia, Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista (Unesp) - Botucatu (SP), Brasil

^IIIProfessor titular, Departamento Bioestatística, Instituto de Biociências - Universidade Estadual Paulista (Unesp) - Rio Claro (SP), Brasil

^IVProfessora doutora, Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências - Universidade Estadual Paulista (Unesp) - Rio Claro (SP), Brasil ^VDoutorando. Departamento de Polímeros, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) - Natal (RN), Brasil

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RESUMO

FUNDAMENTOS: A quitosana é polímero derivado da quitina, com vários tipos de aplicação na área médica.

OBJETIVO: Avaliar a biocompatibilidade de membranas de quitosana no subcutâneo de ratos.

MÉTODOS: Foram utilizados 20 ratos "Wistar" machos, nos quais foram implantadas membranas de quitosana, na região mediana dorsal. Os animais foram sacrificados: sete, 15, 30 e 60 dias após a cirurgia, tendo sido avaliados clinicamente durante o período experimental e com fotodocumentação no momento do sacrifício. Após o sacrifício, as membranas e tecidos adjacentes foram removidos e preparados para exame histológico e morfométrico.

RESULTADOS: Nenhum animal apresentou efeitos adversos que pudessem ser atribuídos à implantação das membranas. O exame histológico mostrou que as inclusões são lisas e homogêneas e não são colonizadas por células do hospedeiro, sendo circundadas por pseudocápsula composta por fibroblastos e células inflamatórias. A morfometria da pseudocápsula revelou espessura semelhante durante todo o período experimental (P>0,05).

CONCLUSÃO: A quitosana pode ser opção para uso como implante não integrado. Novos estudos devem ser realizados para comprovar a biocompatibilidade a longo prazo.

Palavras-chave:Materiais biocompatíveis; Quitosana; Ratos Wistar; Teste de materiais

INTRODUÇÃO

A quitosana e polimero natural, derivado da quitina, material que participa da composicao do exoesqueleto de crustaceos, como camarao, lagosta e caranguejo, e de insetos, como formiga e besouro. ¹

Esse tipo de material vem sendo utilizado com sucesso na area medica e farmaceutica, empregado para a obtencao de produtos cosmeticos, no desenvolvimento de pele artificial para o tratamento de queimados, a fim de simular a permeabilidade de substancias ativas atraves da pele humana,^1-2na obtencao de curativos com a capacidade de deter hemorragias, ^3-4para prevenir infeccoes,⁵ no desenvolvimento de filmes com acao antimicrobiana para a conservacao de carnes, frutas e cereais, ^6-7 membranas para hemodialise, prevenindo a adsorcao de proteinas, a adesao de plaquetas e a formacao do trombo por mecanismo de repulsao eletrica, ja que as interacoes que levam a trombose ocorrem na interface sangue-biomaterial. ^3-4-7 Apesar da grande variedade de utilizacoes sugeridas, ainda pouco se conhece sobre a biocompatibilidade desse material.

Para ser utilizado na area biomedica, um polimero deve ser biocompativel, definido como material que nao produza reacao adversa e deve ter a habilidade de desencadear em um organismo resposta apropriada para uma aplicacao especifica.^8-9

No entanto, a biocompatibilidade de um material depende de diversos fatores inerentes ao organismo, como a especie, a heranca genetica e o local de implantacao ou acao, e ao material em si; e inerentes ao material que sao a sua forma, tamanho, rugosidade e quimica de superficie, composicao, morfologia, duracao do contato com o organismo e degradacao. Os polimeros naturais sao geralmente biodegradaveis e possuem excelente biocompatibilidade quando comparados aos polimeros sinteticos. ^10-12

O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a biocompatibilidade de membranas de quitosana, colocadas no subcutaneo de ratos.

MATERIAL E MÉTODOS

Este foi um estudo experimental, de carater intervencionista e randomizado, cujo protocolo foi aprovado para execucao pelo Comite de Etica e Experimentacao Animal da Faculdade de Medicina de Botucatu (2005/494).

O estudo foi desenvolvido na Faculdade de Medicina de Botucatu, tendo sido utilizados 20 ratos machos, da linhagem Wistar, procedente do Bioterio Central da Unesp. Os ratos foram divididos por sorteio em quatro momentos experimentais, contendo, cada um, cinco animais, sacrificados sete (G1), 15 (G2), 30 (G3) e 60 (G4) dias apos a inclusao.

Foram feitas as seguintes avaliacoes: 1) clinica: avaliacoes diarias, atentando-se para sinais inflamatorios ou infecciosos no local da implantacao e tambem para possiveis alteracoes de comportamento que pudessem sugerir algum efeito sistemico; 2) fotodocumentacao: feita no momento do sacrificio, pelo mesmo observador e guardando a mesma distancia do objeto a ser fotografado; 3) avaliacao histologica: apos o sacrificio, a regiao da implantacao foi removida e preparada para analise em microscopio de luz, atentando-se para a interface entre o hospedeiro e a inclusao e para o proprio material implantado; 4) avaliacao morfometrica: para quantificacao da pseudocapsula formada ao redor do implante, utilizando teste de Tukey.

Caracterizacao da quitosana utilizada: a quitosana foi fabricada pela Polymar Ltda, Brasil, com grau de desacetilacao em torno de 80%, com massa molar determinada pelo metodo de viscometria, utilizando a equacao de Mark-Howink-Sakurada. 13, 14 A quitosana foi dissolvida em solucao aquosa de acido acetico 2% (v/v), sob agitacao por 24 horas, para obtencao de uma solucao de polimero a 1,5% (m/v).15 Apos esse periodo a solucao foi filtrada, a fim de eliminar residuos solidos, colocada 24 horas em estufa a 50°C para evaporacao do solvente, seguida da adicao de solucao aquosa de NaOH 5% por duas horas para neutraliza-la, sendo, em seguida, lavada com agua destilada. Apos estiramento e secagem a temperatura ambiente, foram obtidas membranas com espessura media de 40µm, de 2 x 1cm de tamanho (medidor de camadas Digiderm da Mitutoyo).^13-15

Procedimento cirurgico para implantacao das membranas: os procedimentos foram feitos sob anestesia geral, por meio da injecao intraperitoneal de pentobarbital sodico 3% (1ml/kg de peso) e em condicoes de assepsia e antissepsia. Foram realizadas a tricotomia da regiao dorsal do rato e uma incisao longitudinal, de aproximadamente 1,5cm na regiao dorsal utilizando bisturi lamina 15, seguida de criacao de bolsao no subcutaneo com tesoura de ponta romba que abrigou as inclusoes.

A membrana de quitosana foi introduzida abaixo do subcutaneo e fixada no local com pontos separados, utilizando fio absorvivel Vicryl 5-0 ("Ethicon") (Figura 1). Ao final do procedimento, os animais receberam uma dose de antibiotico enrofloxacino a 10% intraperitonial e pomada de mupirocina 2%.

Os animais foram mantidos em caixas individuais, com temperatura constante de 36°C e ciclo de luz artificial de 12/12 horas, recebendo agua filtrada e alimentacao com racao Purina propria para a especie ad libitum.

O sacrificio foi feito usando sobredose de pentobarbital sodico a 3% intraperitoneal. Apos o sacrificio foi retirada a membrana de quitosana (Figura 2), sendo o material fixado em formol 10%, desidratado em serie crescente de alcoois, diafanizado, incluido em parafina, cortado com espessura de 4 m em microtomo rotativo RM-2155 (Leica) e corado por hematoxilina-eosina (HE). O exame histologico buscou observar a integridade da membrana, a intensidade da reacao inflamatoria do tecido circunvizinho e o grau de integracao do biomaterial com o tecido do receptor.

As laminas foram, entao, analisadas e fotodocumentadas ao microscopio Leica DM, acoplado ao software Leica QWin Versao 3.1 (Leica - UK). Foi avaliada morfometricamente a espessura da pseudocapsula formada ao redor da implantacao da quitosana, pelo modulo linear semi-automatico do programa. Esse resultado foi transferido para a planilha Excel e submetido a analise estatistica, utilizando-se a tecnica de analise de variancia para o experimento com um fator em grupos independentes complementada com o teste de comparacoes multiplas de Tukey,16 considerando- se P > 0,05.

RESULTADOS

Os animais permaneceram aparentemente saudaveis e alimentando-se bem ate o sacrificio, nao havendo obitos.

Exame clínico

A ferida cirurgica evoluiu bem, sem sinais de infeccao, deiscencia ou extrusao em todos os animais dos quatro grupos. A cicatrizacao foi completa, tendo sido dificil verificar o local do procedimento nos animais sacrificados com 30 e 60 dias, devido ao crescimento dos pelos que impediam a visibilizacao da cicatriz. A membrana nao promoveu saliencia, nem qualquer outra alteracao visivel da pele sobre o local em que foi implantada, sendo impossivel intuir sua localizacao no subcutaneo nao fosse a cicatriz cirurgica (Figura 3).

Análise histológica

G1: a inclusao foi reconhecida nos cortes histologicos como material liso, espesso e homogeneo, formado por blocos semelhantes que se unem entre si. Ao redor da inclusao, foi observada a formacao de uma pseudocapsula, composta de fibroblastos jovens, neovasos ativos, hemacias, fibras colagenas e poucas celulas inflamatorias, a maioria delas de neutrofilos e linfocitos.

A fibrose esteve mais estreita no setor inferior da inclusao, e sobre toda a superficie da mesma foram observadas celulas distribuidas em camada unica. (Figura 4A)

G2: apos 15 dias do procedimento cirurgico, havia grande numero de fibroblastos com caracteristicas de celulas jovens. Tambem muitas celulas inflamatorias foram observadas ao redor da inclusao (Figura 4B).

G3: a fibrose apresentou-se mais espessa, com fibroblastos volumosos. As celulas inflamatorias encontravam- se ao redor da inclusao e eram predominantemente linfocitos, monocitos, neutrofilos e celulas gigantes de corpo estranho (Figura 5A).

G4: o implante apresenta-se rodeado por uma fibrose celularizada, com fibroblastos maduros e houve consideravel diminuicao da reacao inflamatoria (Figura 5B).

Exame morfométrico

Embora ao exame macroscopico e histologico houvesse a impressao de fibrose (pseudocapsula) espessa, numericamente nao houve diferenca significativa entre os grupos (Tabela 1).

DISCUSSÃO

Esse trabalho foi realizado para validar a biocompatibilidade da membrana de quitosana, usando como modelo experimental o rato, animal de facil manipulacao e manutencao. ^8-17

A avaliacao clinica dos animais durante o periodo estudado mostrou ausencia de sinais inflamatorios evidentes ou extrusao das inclusoes. Foi possivel observar o crescimento de pelos na regiao cirurgica, o que e indicio de que a membrana implantada nao promove danos a regiao de implantacao, como ja observado em estudos anteriores. ^9-18-19

O estudo histologico revelou basicamente proliferacao de fibroblastos (pseudocapsula) e celulas inflamatorias ao redor da membrana de quitosana, resposta compativel com a regeneracao tecidual por tecido conjuntivo.

Apesar de as celulas inflamatorias serem abundantes no inicio do experimento, com o passar do tempo, houve diminuicao da reacao tecidual. Entretanto, na avaliacao de 30 dias apos a implantacao, foram detectadas celulas gigantes, resposta do organismo a introducao de material estranho, uma vez que essas celulas teriam a capacidade de envolver e ate de fagocitar pequenas particulas nao pertencentes ao organismo receptor. ^20-21

Dessa forma, considerou-se que a membrana de quitosana e indutora de pouca reacao inflamatoria, do tipo cronica. Nao houve sinais de rejeicao, o que pode ser indicativo favoravel a seu uso como material para inclusoes. Essa foi tambem a conclusao a que chegaram outros estudiosos, porem fazendo uso do material para outros fins.^1-19-22-23

Outro aspecto a ressaltar foi que nao houve colonização do implante por celulas do hospedeiro, sendo esse um material que nao possui poros, de superficie totalmente lisa. Dessa forma, inclusoes de quitosana devem ser consideradas implantes que nao sofrem integracao com o hospedeiro, permanecendo com as caracteristicas que apresentavam antes do contato com o receptor.

O exame morfometrico da pseudocapsula que se forma ao redor do implante visou estabelecer indicios de aumento da reacao tecidual contra o material implantado, o que nao se confirmou, uma vez que nao houve aumento da mesma ao longo do experimento. Esse tipo de mensuracao utilizado ja havia sido empregado, em analise de fibras musculares,24 para avaliacao de celulas cancerigenas e de qualidade de carnes. ^25-26

Assim como outros polimeros, como poliesteres, poliaminoacidos, lecitinas, etc., a quitosana vem sendo utilizada com propositos medicos, devido a necessidade de materiais biocompativeis e de baixo custo, para utilizacao em dermatologia, ortopedia e oftalmologia. ^6-7-19

Os resultados aqui obtidos nos autorizam a sugerir que membrana de quitosana possa ser aplicada tambem como inclusoes, na forma de membranas a serem implantadas para reparacao tecidual. Novos estudos devem ser realizados para definir os resultados ou a repercussao sistemica a longo prazo da aplicacao desse material.

CONCLUSÃO

A inclusao de membranas de quitosana no subcutaneo de ratos apresenta pouca reacao inflamatoria, com formacao de fibrose (pseudocapsula) ao redor. As caracteristicas observadas permitem considerar que esse tipo de material e do tipo nao integrado e que pode ter lugar como implante a ser utilizado em reparacoes teciduais.

AGRADECIMENTO

Os autores agradecem ao dr. Alexandre Paratela Gama, oftalmologista que os auxiliou na execução dos

procedimentos cirúrgicos para colocação dos implantes.

Recebido em 25.03.2008.

Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 26.12.08.

Suporte financeiro: Este estudo recebeu auxílio financeiro da Fapesp para aquisição de material de consumo e da Capes, que forneceu bolsa de pós-graduação para a autora.

Conflito de interesse: Declaramos não possuir nenhum tipo de conflito de interesse, assim como não recebemos nenhum tipo de suporte financeiro para a manufatura do produto ou para a realização do experimento.

Como citar este artigo/How to cite this article: Brito MKM, Schellini SA, Padovani CR, Pellizzon CH, Trindade-Neto CG. Inclusões de quitosana no subcutâneo de rato: avaliação clínica, histológica e morfométrica. An Bras Dermatol. 2008;84(1):35-40.

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Trabalho foi desenvolvido na Faculdade de Medicina de otucatu e Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista (Unesp) - São Paulo (SP), Brasil.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Jun 2009
• Data do Fascículo
  Fev 2009

Histórico

• Aceito
  26 Dez 2008
• Recebido
  25 Mar 2008