II Consenso Brasileiro de Fator Antinuclear em Células HEp-2: Definitions for standardization of autoantibody testing against the nucleus (ANA HEp-2), nucleolus, cytoplasm and mitotic apparatus, as wel as its clinical associations

II Brazilian Consensus on Antinuclear Antibodies in HEp-2 Cells

ARTIGO ORIGINAL ORIGINAL ARTICLE

II Consenso Brasileiro de Fator Antinuclear em Células HEp-2(^*) Definições para a padronização da pesquisa de auto-anticorpos contra constituintes do núcleo (FAN HEp-2), nucléolo, citoplasma e aparelho mitótico e suas associações clínicas

II Brazilian Consensus on Antinuclear Antibodies in HEp-2 Cells Definitions for standardization of autoantibody testing against the nucleus (ANA HEp-2), nucleolus, cytoplasm and mitotic apparatus, as wel as its clinical associations

Alessandra Dellavance^I; Alexandre Gabriel Júnior^II; Alice F. U. Cintra^III; Antônio Carlos Ximenes^IV; Barbara Nuccitelli^V; Ben Hur Taliberti^VI; Caio Moreira^VII; Carlos Alberto von Mühlen^VIII; Carlos David Bichara^IX; Cláudio Henrique Ramos dos Santos^X; Cristiane Martinez Yano^XI; Cristóvão Luis Pitangueira Mangueira^XII; Darlene Gonçalves Carvalho^XIII; Eloísa Silva Dutra de O. Bonfá^XIV; Elvira M. Doi^XV; Fabiana Nunes de Carvalho Guimarães^XVI; Flávia Ikeda e Araújo^XVII; Hugo Mendonça Mundim^XIII; Jozelia Rego^XIX; Lisiane Ericonio dos Anjos Vieira^XX; Luciana Poli^XXI; Luís Eduardo Coelho Andrade^XXII; Maria Roseli Callado^XXIII; Mauro Meira Mesquita^(XXIV); Mitiko Sugiyama^(XXV); Natasha Slhessarenko^(XXVI); Nilzio Antônio da Silva^(XXVII); Orlando Gabriel Carballo^(XXVIII); Paulo Guilherme Leser^(XXIV); Paulo Luiz Carvalho Francescantonio^(XXX); Renata Jarach^(XXXI); Ricardo Machado Xavier^(XXXII); Roger Abramino Levy^(XXXIII); Suzane P. F. Neves^(XXXIV); Wilson de Melo Cruvinel^(XXXV); Wilton Silva dos Santos(XXXVI⁾

^IBióloga, mestre em Ciências/Reumatologia pela FMUSP

^IICoordernador do curso de pós-graduação da Disciplina em Clínica Médica da UNIFESP

^IIIBio-Rad Laboratório Brasil/RJ

^IVChefe do Departamento de Medicina Interna do Hospital Geral de Goiânia, Ministério da Saúde. Doutor em Reumatologia

^VBiomédica. Padrão Laboratório Clínico

^VIProfessor titular em Clínica Médica da Universidade Federal de Uberlândia/MG. Pós-doutorado no Rheumaforschung Institutes, Aachen, Alemanha

^VIIPreceptor de residência do Serviço de Reumatologia do HC/UFMG. Presidente da Sociedade Brasileira de Reumatologia

^VIIIProfessor adjunto de Reumatologia da PUCRS

^IXPatologista Clínico e Biomédico/PA

^XNew Life Produtos Hospitalares. Minas Gerais

^XIProfessora assistente da disciplina de Imunologia da Universidade Católica de Goiás

^XIIReumatologista e patologista clínico, diretor do Serviço de Imunologia da Divisão de Laboratório Central do HC/FMUSP

^XIIIPatologista Clínica/MG

^XIVProfessora titular da Disciplina de Reumatologia do HC/FMUSP

^XVLaboratório Frischmann Aisengart. Paraná

^XVIProfessora convidada da Disciplina de Imunologia da Universidade Católica de Goiás

^XVIIBiomédica. Laboratório de Auto-Imunidade da Universidade Católica de Goiás

^XVIIIExame Medicina Laboratorial. Distrito Federal

^XIXReumatologista e responsável pelo Laboratório de Imuno-Reumatologia e HLA do HC/FMUFG

^XXAssessora de Imunologia da Lab. Santa Luzia. Santa Catarina

^XXIMedivax/Bion. Rio de Janeiro

^XXIIProfessor adjunto livre-docente da Disciplina de Reumatologia da UNIFESP

^XXIIIMestre em Clínica Médica/Reumatologia HSPE/SP

^XXIVBiomédico, coordenador do Laboratório da Área de Saúde da Universidade Católica de Goiás

^XXVFarmacêutica-Bioquímica/SP

^XXVIPatologista clínica, mestre em Medicina pela USP. Professora da Univ. Fed. Mato Grosso. Presidente regional da Sociedade Brasileira de Patologia Clínica

^XXVIIProfessor titular de Reumatologia. Chefe do Serviço de Reumatologia da FMUFG

^XXVIIIBioquímico, Unidad Inmunología, Hospital Durand, Buenos Aires, Argentina

^XXIXProfessor adjunto aposentado da Disciplina de Reumatologia da UNIFESP e assessor de imunopatologia do Laboratório Fleury

^XXXProfessor assistente da Disciplina de Imunologia da Universidade Católica de Goiás

^XXXIBiomédica do Padrão Laboratório Clínico/GO

^XXXIIProfessor adjunto doutor, PHD em Imunologia, médico reumatologista do Serviço de Reumatologia do HCPA/UFRGS

^XXXIIIProfessor adjunto de Reumatologia da FCM/UERJ

^XXXIVProfessora adjunta da FM/UFMG. Doutora em Ciências pela FIOCRUZ

^XXXVProfessor assistente da Disciplina de Imunologia da Universidade Católica de Goiás. Mestre em Medicina Tropical-Imunologia pela UFG

^XXXVICoordenador do Laboratório de Reumatologia do Hospital Universitário de Brasília e doutor em Reumatologia pela UNIFESP

RESUMO

OBJETIVO: O Segundo Consenso Brasileiro de Fator Antinuclear (FAN) em Células HEp-2 ratificou os algoritmos de decisão para leitura dos padrões do FAN na imunofluorescência indireta vistos na primeira edição do Consenso Brasileiro, adicionando ainda um novo algoritmo relacionado com os padrões mistos.

MÉTODOS: Tendo em vista a habilidade do teste em detectar autoantígenos nos distintos compartimentos celulares, e não apenas no núcleo, propõe-se novas denominações para este exame laboratorial.

RESULTADOS E CONCLUSÕES: Como novas denominações algumas sugestões foram igualmente aceitas, dentro do tema "pesquisa de auto-anticorpos contra constituintes do núcleo (FAN HEp-2), nucléolo, citoplasma e aparelho mitótico". Foram abordadas as principais relevâncias clínicas com os padrões de FAN descritos, facilitando o melhor uso do ensaio pelo médico.

Palavras-chave: Auto-anticorpos, células HEp-2, FAN, imunofluorescência.

ABSTRACT

OBJECTIVE: The Second Brazilian Consensus on Antinuclear Antibodies (ANA) in HEp-2 Cells approved and extended the decision trees developed during the First Brazilian Consensus in order to also offer information about mixed patterns of fluorescence.

METHODS: Since this test elicits reactions not only to nuclear autoimmune antigens but also to different cell compartments, new denominations for the test were approved. Results and CONCLUSIONS: These new denominations encompass variations on the "autoantibody testing against the nucleus (ANA HEp-2), nucleolus, cytoplasm, and mitotic apparatus" issue. Furthermore, major clinical associations were described for each immunofluorescent pattern, facilitating the interpretation of laboratory results in the clinical practice.

Keywords: Autoantibodies, HEp-2 cells, ANA, immunofluorescence.

INTRODUÇÃO

O objetivo do médico ao solicitar exames laboratoriais para um doente reumático é de auxiliar no diagnóstico precoce da doença em questão. O número de auto-anticorpos para

o diagnóstico de doenças sistêmicas ou órgão-específicas tem aumentado progressivamente desde que a técnica de imunofluorescência foi utilizada na sua triagem. Temos hoje uma variedade de padrões que pode ser resultado da ligação de vários auto-anticorpos distintos, de um número restrito deles, ou até mesmo de um único auto-anticorpo. Esses padrões têm grande importância, porquanto podem direcionar o raciocínio clínico e a investigação laboratorial adicional. De forma geral o clínico, com base no resultado da triagem de auto-anticorpos pela técnica do FAN, tem noção de qual deva ser o próximo passo na investigação. O diagnóstico em Reumatologia depende primariamente das formas de apresentação dos mais de cem tipos distintos de doenças reumáticas e o laboratório auxilia a referendar ou efetuar a hipótese diagnóstica.

A nomenclatura utilizada para definição dos padrões de FAN em nosso país foi inserida informalmente, muitas vezes sendo adaptada de nomenclatura estrangeira, principalmente dos idiomas inglês, francês e espanhol. O resultado inevitável desse processo foi o aparecimento de uma variedade de nomes de padrões, muitos dos quais destinados a descrever o mesmo aspecto morfológico. Por isso foi realizado nos dias 18 e 19 de agosto de 2000, em Goiânia,

o I Consenso Nacional para a Padronização dos Laudos de FAN em CélulasHEp-2, com o propósito de reunir diversos especialistas de todo o Brasil e de padronizar as leituras de FAN, corrigindo a nomenclatura divergente até então utilizada. Sucintamente as recomendações do I Consenso podem ser vistas na Figura 1.

A pesquisa de auto-anticorpos em células HEp-2 tem grande valor clínico, porém⁽¹⁾, como qualquer exame laboratorial, deve ser analisada com cuidado. Um teste negativo para pesquisa de anticorpos antinúcleo é forte evidência contra o diagnóstico de lúpus eritematoso sistêmico. Podem ocorrer reações falso-negativas em alguns pacientes com anti-SS-A/Ro isolado⁽²⁾, anti-Jo-1⁽³⁾, anti-P ribossomal, baixos títulos de anticorpos ou presença de imunocomplexos⁽⁴⁾. Entretanto, no dia-a-dia do laboratório, o problema mais expressivo é a positividade do teste sem correlação clínica. Isso se deve em grande parte à utilização indiscriminada do exame como teste de triagem na população em geral e não em grupos selecionados de pacientes com clínica sugestiva.⁽⁵⁾ Antes de interpretar um resultado, devemos considerar que 5% da população normal e até 13% da população acima de 50 anos pode ter um teste positivo em título baixo^(4,6,7).

Após os resultados do I Consenso Nacional para Padronização dos Laudos de FAN em Células HEp-2⁽⁸⁾, considerado um modelo a ser seguido por seu pioneirismo em termos mundiais, estamos apresentando os resultados do II Consenso Nacional para Padronização dos Laudos de FAN em Células HEp-2 (pesquisa de anticorpos contra constituintes do núcleo, nucléolo, citoplasma e aparelho mitótico), cujos objetivos foram os seguintes: primeiro, aprimorar as diretrizes do I Consenso; segundo, enumerar as associações de cada padrão de fluorescência observado com um ou mais antígenos celulares; e, terceiro, listar as possíveis associações clínicas de cada padrão/auto-anticorpo com doença específica ou manifestação clínica.

Um aspecto fundamental estabelecido neste II Consenso foi a própria terminologia empregada para designar o exame. A recomendação é que a terminologia tradicional FAN deva ser substituída por uma designação mais abrangente e que contemple a pesquisa de anticorpos contra todos os constituintes celulares, e não apenas contra os constituintes do núcleo celular. Isto em razão da introdução das células HEp2 como substrato da reação de imunofluorescência, que passou a permitir a detecção de auto-anticorpos contra antígenos do núcleo, da membrana nuclear, do nucléolo e outros localizados no citoplasma. Ademais, as células HEp-2 permitem reconhecer auto-anticorpos contra estruturas protéicas expressas no aparelho mitótico e no núcleo nas diferentes fases do ciclo celular, tais como: proteínas do centrômero, as que se expressam durante a proliferação celular/antígeno nuclear de células em proliferação (PCNA, antígeno nuclear de células em proliferação), CENP-F (proteína F do centrômero) e inúmeras outras⁽¹⁾.

Outro aspecto relevante foi o reconhecimento da importância de se atentar para a marcação dos cromossomos na placa metafásica. Sabe-se que os diversos auto-antígenos nucleares apresentam grande dinamismo topográfico durante

o ciclo celular⁽⁹⁾. O conhecimento de como cada auto-antígeno se comporta em cada fase do ciclo celular é um elemento-chave para se inferir os possíveis auto-anticorpos presentes em um determinado soro. A placa cromossômica metafásica é uma estrutura privilegiada sob esse aspecto, pois apresenta apenas a cromatina (DNA e histonas) e as proteínas a ela associadas. Assim, anticorpos contra DNA, histona, cromatina e DNA topoisomerase I (Scl-70) apresentarão marcação invariavelmente na placa metafásica. Por outro lado, anticorpos contra antígenos associados a RNA (Sm, U1-RNP, SS-A/Ro, SS-B/La) não coram a placa metafásica, ocasionando uma imagem negativa em seu lugar. A partir dessas observações, estabeleceu-se noII Consenso que o laudo deve conter um campo específico para descrição da marcação da placa cromossômica metafásica, principalmente nos laboratórios de pesquisa básica e aplicada.

Enfatizaram também os participantes do II Consenso a especificidade e sensibilidade do teste do FAN. Além de permitir a identificação de auto-anticorpos contra uma gama de antígenos extranucleares, a introdução da célula HEp-2 permitiu que alguns antígenos como SS-A/Ro, que não são adequadamente expressos nas células de camundongos, ratos ou cobaias, utilizados antigamente como substrato da reação, pudessem ter seus respectivos auto-anticorpos facilmente reconhecidos, tornando o teste muito mais sensível, mas em contrapartida menos específico⁽¹⁰⁾. Como a pesquisa de anticorpos contra constituintes celulares (FAN) passou a ser solicitada por clínicos das especialidades mais diversas possíveis, neste II Consenso foi dado um alerta para lembrar a todos que solicitam este exame, que ele deve ser considerado como um teste de triagem e a interpretação e valorização do resultado devem estar fundamentadas no conhecimento da sensibilidade e especificidade do mesmo, bem como no contexto clínico particular.

O conhecimento prévio desta propriedade com relação à sensibilidade e especificidade permitirá entender a razão do achado do número crescente de reações positivas em indivíduos normais ou naqueles com diferentes processos inflamatórios específicos e inespecíficos, e que não guardam nenhuma relação com doenças reumáticas auto-imunes, para as quais o teste na maioria das vezes é solicitado.

Finalmente, os participantes deste II Consenso procuraram definir, baseados na experiência de cada um, e principal-mente nos dados de revisão de literatura, quais as principais associações antigênicas e relevância clínica de cada padrão observado com diferentes patologias reumáticas e mesmo não reumáticas. Seguindo esse raciocínio, o II Consenso Brasileiro de FAN HEp-2 abordou a complexa análise dos padrões mistos que se encaixam em mais de um guia de classificação.

DENOMINAÇÃO DO TESTE

A interpretação da técnica de imunofluorescência indireta em células HEp-2 evoluiu acentuadamente no transcorrer dos últimos anos. Vivenciamos hoje uma pluralidade de padrões, cada qual com diversas opções de coloração histológica, permitindo-nos classificar mais de 25 possibilidades de laudos. Cada um desses pode refletir uma dada expressão antigênica reconhecida pelo seu auto-anticorpo, que norteia o clínico direcionando-o para uma melhor investigação diagnóstica. Diante dessa concreta evolução, o II Consenso Brasileiro de FAN HEp-2 tomou consciência dos prejuízos proporcionados pela denominação do ensaio Fa-tor Antinúcleo (FAN), por não expressar as reais potencialidades do método que, além da triagem de auto-anticorpos nucleares, avalia a presença de anticorpos contra o nucléolo, citoplasma e aparelho mitótico. Atualmente é evidente o descaso, muitas vezes involuntário, com relação ao teste, em decorrência da não valorização dos resultados de padrões não nucleares que podem ser relevantes em determinadas circunstâncias. Exemplo claro disto são os padrões citoplasmáticos, de grande importância, como pode-se observar a seguir nas tabelas de associações clínicas.

Outro fator importante é o de que a maioria dos ensaios laboratoriais é remunerada por convênios que têm a sua referência no rol de procedimentos do Ministério da Saúde ou na lista de procedimentos da Associação Médica Brasileira, designada pelo ano de elaboração. No capítulo de patologia clínica o ensaio é denominado Fator Antinúcleo (FAN-HEp-2)-IFI, indicado pelo código 28.06.213-2, o que dificulta a implantação de uma nova forma de solicitar o ensaio, caso não seja tomada uma medida de renomeá-lo junto às novas listas de procedimentos da AMB.

Como resultado, o II Consenso adotou a estratégia imediata de incorporar à sigla FAN as outras pesquisas realizadas no ensaio, definindo seis opções possíveis de serem utilizadas pelos laboratórios brasileiros em seus laudos (Figura 2). Essa atitude objetiva divulgar, de forma mais proveitosa, as potencialidades de um exame de grande importância em áreascomo Reumatologia, Nefrologia, Gastroenterologia, Neurologia e Psiquiatria.

CORPO DESCRITIVO DO LAUDO. O QUE MUDOU COM O SEGUNDO CONSENSO?

Os resultados doII Consenso incluem uma modificação nos algoritmos de classificação definidos no I Consenso Brasileiro, tendo sido criado um grupo de padrões mistos com o fim de resolver o problema dos padrões que não se encaixavam em apenas um algoritmo de classificação.

Outra mudança substancial ocorreu na denominação dos laudos dos padrões citoplasmáticos que passaram a ser considerados como FAN positivos. Essa mudança se coaduna com a necessidade de uma maior valorização desse grupo de padrões pelos clínicos, pois os mesmos têm atualmente importância comprovada no auxílio diagnóstico de enfermidades como lúpus eritematoso sistêmico, cirrose biliar primária, síndrome de Sjögren, polimiosite e esclerose sistêmica.

A partir desses resultados, ficam, portanto, desconsideradas as recomendações do I Consenso, que denominavam os padrões citoplasmáticos como FAN negativos, por não haver reatividade nuclear em tais situações. Em contrapartida, o II Consenso recomenda que padrões citoplasmáticos sejam liberados como FAN positivos, buscando a maior valorização desses achados pelos clínicos, contanto que os laboratórios adotem uma das novas denominações do teste (Figura 2).

A alteração descrita acima, juntamente com a sugestão das denominações para o teste de triagem de auto-anticorpos em células HEp-2, preparam-nos para que em um futuro breve tenhamos condições de melhor definir o nome deste exame. A seguir, o corpo descritivo do laudo em três exemplos (Figuras 3, 4 e 5), seguindo as recomendações do II Consenso Brasileiro de FAN HEp-2.

No caso da descrição do padrão homogêneo, o relato da presença de fluorescência junto ao nucléolo remeterá para a classificação de padrão misto (veja adiante).A ausência de reatividade (não fluorescência) o classificará como padrão pontilhado fino denso. Neste caso o nucléolo, em especial, será relatado como não observável (Figura 5).

O NOVO ALGORITMO DE CLASSIFICAÇÃO: PADRÕES MISTOS

O II Consenso deparou-se com a dificuldade de classificar alguns padrões que apresentam de forma simultânea mais de uma característica de classificação (fluorescência de núcleo, nucléolo, citoplasma ou aparelho mitótico simultaneamente). Esses casos foram denominados padrões mistos por apresentarem células com decoração de diferentes regiões. Por exemplo, núcleo e citoplasma, núcleo e nucléolo, entre outras possíveis combinações dos quatro grupos básicos: nucleares, nucleolares, citoplasmáticos e aparelho mitótico. O padrão formado pelo anticorpo antitopoisomerase I (Scl-70) é clássico de uma combinação de achados. Observa-se o núcleo corado de forma pontilhada, nucléolos corados de forma também pontilhada e placa metafásica cromossômica reagente. Essas informações permitem concluir que se trata do padrão misto nuclear e nucleolar pontilhados, que caracteriza possivelmente a presença de anticorpos antitopoisomerase I (Figura 6).

Outra possibilidade é o padrão ocasionado por um soro com a presença simultânea de anticorpos antigolginas e anti-SS-A/Ro. Nessa circunstância visualiza-se uma coloração polar na região citoplasmática, que caracteriza o primeiro anticorpo, bem como uma fluorescência nuclear pontilhada fina com placa metafásica negativa, caracterizando

o segundo auto-anticorpo. Nesse caso, recomenda-se desmembrar os padrões liberando os resultados possíveis com base na experiência do observador. Sabe-se então que o soro apresenta dois padrões: nuclear pontilhado fino e citoplasmático pontilhado polar (Figura 7).

Desta forma, o padrão misto ocorre a partir da combinação de dois auto-anticorpos distintos direcionados a componentes individuais da célula como núcleo e citoplasma (antigolgi e anti-SS-A/Ro), ou ainda pode sugerir a presença de um único auto-anticorpo específico, no caso da reatividade de núcleo e nucléolo, observada pela presença do Anti-Scl-70.

Pode-se observar, na Tabela 1, a classificação dos padrões mistos acordada no II Consenso Brasileiro de FAN HEp-2.

RELEVÂNCIAS CLÍNICAS

Com a finalidade de facilitar a interpretação do FAN pelos clínicos, durante o II Consenso foram discutidas as relevâncias clínicas mais freqüentes de cada padrão. Optou-se por não mencionar as doenças que ocorrem de forma mais rara, o que poderia na prática médica induzir o clínico a uma falsa interpretação dos resultados gerando a procura por entidades de muito baixa prevalência. A lista de descrições clínicas (Tabela 2) inclui a definição dos possíveis auto-anticorpos presentes em cada padrão com a respectiva relevância destes para a clínica reumatológica. Essas informações suprem a carência de maiores dados sobre a interpretação da pesquisa de auto-anticorpos, refletindo diretamente em um melhor auxílio diagnóstico para o clínico, principalmente o reumatologista.

É fundamental observar que as associações clínicas apresentadas na Tabela 1 referem-se aos auto-anticorpos específicos listados na segunda coluna. Estas são associações bem estabelecidas na literatura e podem ser bem apreciadas em publicações específicas sobre o tema. A relevância clínica do padrão de fluorescência foi estabelecida de forma indireta, mediante as associações antigênicas de cada padrão de fluorescência. Cabe, entretanto, frisar que essas associações antigênicas são relativas, em sua maioria. Por exemplo, o padrão nuclear pontilhado fino com placa cromossômica metafásica não corada pode corresponder a anticorpos anti-SSA/Ro, anti-SS-B/La ou a auto-anticorpos de especificidade antigênica ainda desconhecida. Portanto, a relevância clínica do padrão de fluorescência fornece uma orientação provisória, que deve ser corroborada por testes imunológicos específicos para identificação dos auto-anticorpos sugeridos no teste de FAN.

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AGRADECIMENTOS

Bio Rad • Bion/Virion/Medivax • BioSystems • Cedilab Medicina Laboratorial • Exame - Laboratórios de Patologia Clínica • Fundação de Assistência Estudo e Pesquisa de Uberlândia (FAEPU/HC/UFU) • GMK Diagnóstico/Hemagen Diagnósticos • Imunotech Sistemas Diagnósticos Imp. Exp. Ltda. • Instituto de Patologia Clínica Hermes Pardini • Laboratório Amaral Costa • Laboratório Atalaia • Laboratório de Imuno-Reumatologia e HLA (HC/UFG) • Laboratório Fleury • Laboratório Frischmann Aisengart • Laboratório Médico Santa Luzia • Laboratório Metanalysis • Labs Cardiolab - Exames Complementares • New Life - Comércio de Produtos Hospitalares • Padrão Laboratório Clínico - Medicina Laboratorial • Sociedade Brasileira de Análises Clínicas - Regional Goiás • Sociedade Brasileira de Patologia Clínica • Sociedade Brasileira de Reumatologia • Sociedade Goiana de Patologia Clínica • Universidade Católica de Goiás - Sociedade Goiana de Cultura • Wama Diagnóstica • Orlando Gabriel Carballo, Hospital Municipal Carlos Durán, Buenos Aires, República Argentina • Edward KL Chan, PhD, University of Florida, Gainesville (EUA) • Irmtraut Araci H. Pfrimer, Universidade Católica de Goiás - Goiânia.

Endereço para correspondência:

Laboratório de Apoio Didático/Departamento de Biomedicina/Universidade Católica de Goiás.

Av. Universitária 1.069, Setor Universitário, CEP 74605-010,

Goiânia, GO

e-mail: [e-mail]

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Trabalho realizado sob a coordenadoria de Fabiana Nunes de Carvalho Guimarães, Flávia Ikeda e Araújo, Paulo Luiz Carvalho Francescantonio e Wilson de Melo Cruvinel. Recebido em 15/4/2003. Aprovado, após revisão, em 21/4/2003.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Jun 2014
• Data do Fascículo
  Jun 2003

Histórico

• Aceito
  21 Abr 2003
• Recebido
  15 Abr 2003