Estudo-piloto: células NK nas gestantes com LES

Resumos

The innate immune system plays an important role in reproduction, with marked involvement of NK cells. These cells behavior during pregnancy may clarify crucial points in the pathogenesis of complications that may occur in pregnant women with SLE. OBJECTIVE: To measure the amount of circulating NK cells and their viability in pregnant SLE patients. MATERIALS AND METHODS: Blood samples from four groups of ten patients each were evaluated: 1. GLES: Pregnant SLE patients; 2. PLES: Non-pregnant SLE patients; 3. Gcontrols: Pregnant controls; 4. Controls: Healthy non-pregnant women. In all patients the amount and viability of NK cells was measured by flow cytometry, as well as the total apoptosis by annexin V and propidium iodite staining. RESULTS: Due to the great variability, median of each group was used for evaluation: CD56+ count [GLES (0.10), PLES (0.12), Gcontrols (0.15), Controls (0.08)]; total apoptosis (addition of initial and late apoptosis to total number of dead cells) [GLES (0.06), PLES (0.04), Gcontrols (0.11), Controls (0.11)]. The results for live cells count had low variability, so the averages and standard deviations were used for comparisons: [GLES (0.91±0.06), PLES (0.95±0.03), Gcontrols (0.86±0.11), Controls (0.88+0.08)]. CONCLUSION: Although not statistically significant, the total apoptosis in the SLE groups was lower than in the control groups, and the live cell count was higher. This suggests that in SLE patients, pregnant or not, the NK cells have a prolonged life cycle (or have a lower/different turnover), and that there may be a higher immune stimulus making the NK cells take longer to activate the apoptosis process.

pregnancy; systemic lupus erythematosus; NK cells

ARTIGO ORIGINAL

Estudo-piloto: células NK nas gestantes com LES

Alessandra Cardoso Pereira^I; Mônica Cristina Brandão dos Santos Lima^II; Nilson Ramires de Jesús^III; Marcus Montello França^IV; Homero da Silva Nahum Junior^V; Roger Abramino Levy^VI

^IProfessora Assistente da Disciplina de Reumatologia da Faculdade de Medicina (UNIGRANRIO) e mestranda de Ciências Médicas do PGCM (UERJ)

^IIProfessora Bióloga da Faculdade de Ciências Médicas, Departamento de Patologia Geral, Laboratório de Imunopatologia (UERJ)

^IIIProfessor Assistente da disciplina de Obstetrícia da Faculdade de Ciências Médicas (UERJ)

^IVResidente da disciplina de Oftalmologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto (UERJ)

^VProfessor da disciplina de Bioestatística (Universidade Estácio de Sá)

^VIProfessor Adjunto da Disciplina de Reumatologia da Faculdade de Ciências Médicas (UERJ)

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

O sistema imune inato desempenha papel central na reprodução, tendo as células NK participação marcante. Durante a gravidez, seu comportamento pode esclarecer pontos cruciais na patogênese das complicações que podem ocorrer em gestantes com LES.

OBJETIVO: Quantificar as células NK circulantes e sua viabilidade em gestantes com LES.

MATERIAL E MÉTODOS: Avaliaram-se amostras de sangue de quatro grupos de dez pacientes cada: 1 GLES: Gestantes com LES; 2 PLES: Pacientes com LES não gestantes; 3 Gcontroles: Gestantes controles; 4 Controles: Mulheres não gestantes saudáveis. Em todas as pacientes, a quantidade e a viabilidade das células NK foram medidas por citometria de fluxo, assim como por apoptose total por coloração para anexina V e iodeto de propidium.

RESULTADOS: Devido à variabilidade dos resultados, a mediana de cada grupo foi utilizada para avaliar: porcentagem CD56⁺ [GLES (0,10), PLES (0,12), Gcontroles (0,15), Controles (0,08)]; apoptose total [GLES (0,06), PLES (0,04), Gcontroles (0,11), Controles (0,11)]. Os resultados da contagem de células vivas tiveram baixa variabilidade, por isso média e desvio-padrão foram utilizados para comparação: [GLES (0,91 ± 0,06), PLES (0,95 ± 0,03), Gcontroles (0,86 ± 0,11), Controles (0,88 ± 0,08).

CONCLUSÃO: Apesar de não terem alcançado valor de significância estatística, o percentual de apoptose total nos grupos com LES foi menor que o dos controles, e a porcentagem de células vivas foi maior. Isso sugere que, em pacientes com LES, grávidas ou não, as células NK têm vida útil prolongada (ou tem turnover menor/diferente), o que indica um maior estímulo imune, fazendo com que as células NK levem mais tempo para ativar o processo de apoptose.

Palavras-chave: gravidez; lúpus eritematoso sistêmico; células NK.

INTRODUÇÃO

Células NK

As células NK são um subtipo de células mononucleares morfologicamente distintas dos linfócitos B e T, em virtude de sua densidade granular aumentada. Células NK participam de imunorregulação, hematopoiese, reprodução e interação neuroendócrina. Também desempenham papel significativo na defesa do hospedeiro contra certos micro-organismos, em parte por meio de sua capacidade para secretar citocinas como IFN-γ, TNF, e GM-CSF,¹entre outras.²

São capazes de produzir citocinas, pró e anti-inflamatórias, e levar à morte da célula-alvo por apoptose. Dessa forma, apresenta implicações na patogênese de várias doenças humanas. Pela natureza da produção de citocinas, as células NK fazem parte da regulação da produção de anticorpos dependentes das células T nas doenças autoimunes. Uma redução na atividade das células NK é vista no LES. Dessa maneira, a modulação da atividade das células NK pode ser importante na patogênese e no controle das doenças autoimunes, infecciosas, e neoplásicas.³

Células NK na gestação

O período gestacional representa um modelo único na natureza. Compreende um estado imunológico altamente complexo, com frequente exacerbação de enfermidades ou alterações prexistentes. Do ponto de vista imunológico, tem sido um grande desafio tentar entender quais os mecanismos envolvidos na não rejeição da placenta pelo sistema imunológico materno, já que ela, por ser de origem embriônica, contém material genético tanto materno como paterno.⁴O sistema imune inato está ativo na gravidez e, devido à relativa supressão da imunidade adaptativa, pode assumir papel relevante na defesa imune materna.⁵Além disso, o sistema imune inato tem um papel de influência dominante sobre a reprodução. Análises dos tipos celulares que estão presentes no local da implantação do óvulo mostram que as células T e B, típicas do sistema imune adaptativo, são raras, enquanto o predomínio populacional consiste de células NK.⁶ Os principais tipos de células imunes no endométrio secretório são as células T, células NK e os macrófagos. As células T compreendem aproximadamente 45% dos leucócitos na fase proliferativa do endométrio, e esse número se mantém constante em toda a fase secretória e na gestação. Contudo, seu número aparentemente diminui devido ao grande aumento das células NK durante a fase secretória e no início da gravidez.⁷Várias observações sugerem que as células NK uterinas têm um importante papel na reprodução: são reguladas por hormônios, aumentando em número durante a fase lútea do ciclo menstrual, quando ocorre a implantação; estão presentes no início da gestação na ocasião em que as células trofoblásticas invadem as arteríolas espiraladas. São particularmente abundantes em torno da infiltração fetal derivada de células trofoblásticas extravilosas. Células NK (CD56⁺) proliferam ativamente na decídua, durante a fase lútea. Nessas fases, outros elementos da mucosa (glândulas epiteliais e células do estroma) cessam a proliferação e dão início à diferenciação, exceto pelas células endoteliais, que continuam a proliferar nessa ocasião. Contudo, o estímulo para a proliferação in vivo da célula NK ainda é desconhecido.⁸ As NK da decídua estão em contato íntimo com trofoblasto da interface fetal e da materna. Entretanto, as NK da decídua não exercem ação citolítica contra as células trofoblásticas. Vários estudos têm mostrado que a citotoxicidade geral das NK da decídua é reduzida, quando comparada com as células NK do sangue periférico.⁹

Gestação no LES

Por muitos anos, pacientes com LES foram advertidas para não engravidar, mas, com o maior conhecimento dos mecanismos de fisiopatologia da doença e das manifestações clínicas durante a gravidez, associado aos cuidados médicos, a gravidez tem sido um evento normal na mulher com LES. Normal, mas não monótono. A gravidez da paciente com lúpus continua sendo uma gestação de alto risco, embora a maior parte das mulheres não apresente grandes complicações.¹⁰ A doença autoimune fundamentalmente representa um distúrbio da reatividade imune, alterando a tolerância contra várias substâncias que passam a se comportar como autoantígenos. De modo semelhante, o sucesso da gravidez depende da tolerância materna ou da não reatividade imune contra antígenos paternos. A tolerância materna parece estar associada ao desenvolvimento de diversos mecanismos específicos que protegem o feto dos ataques citotóxicos imunes maternos.¹¹

Células NK no LES

Desde 1980, muitas evidências têm sido coletadas sugerindo associação entre a diminuição do número e da atividade das células NK e as doenças autoimunes. Em um estudo realizado com 71 pacientes com LES, verificou-se que o número de células NK (CD16⁺ CD56⁺) no sangue periférico desses pacientes foi apenas um terço dos níveis dos controles - uma diferença altamente significativa. A proporção de células NK no sangue periférico foi significativamente menor em pacientes com doença moderada ou grave, comparada com pacientes que estavam com doença fora de atividade, e mais deprimida em pacientes com nefrite lúpica grave.¹Green et al. verificaram baixos níveis de atividade da célula NK em parentes de primeiro grau de pacientes com LES, sugerindo que a correlação da deficiência de célula NK com a atividade do paciente é importante na patogênese da doença e não é secundária ao processo da doença ou ao tratamento com drogas. Essa deficiência foi tanto no número como na função da célula.¹²

No LES, as células NK parecem sofrer alterações em relação à quantidade e à citotoxicidade, o que está relacionado com sua patogênese e, até o momento, não se verificou como essas células se apresentam durante a gestação no LES. Talvez um melhor controle da resposta imune seja a chave para evitar que a maioria das pacientes com LES entre em atividade da doença durante a gestação. Este estudo-piloto teve como objetivo avaliar a quantidade e o ciclo vital de células NK no sangue periférico e tentar correlacionar com a atividade da doença.

MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Pedro Ernesto e pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Maternidade-Escola da UFRJ, e tem inscrição no SISNEP.

Avaliamos quatro grupos de estudo. Grupo 1) gestantes com LES (GLES), que foi o grupo-alvo, e os outros três grupos controles; Grupo 2) gestantes sem doenças autoimunes (Gcontroles); Grupo 3) mulheres com LES (PLES); Grupo 4) mulheres sem doenças autoimunes (Controles). A atividade do LES foi avaliada pelo SLEPDAI¹³ em gestantes e pelo SELENA-SLEDAI^14,15 em não gestantes. Cada grupo foi formado por dez mulheres em idade fértil, com exceção do grupo Controles, que tinha 11 indivíduos. O critério de inclusão foi: gestantes portadoras de LES que iniciaram o acompanhamento gestacional com até, no máximo, vinte semanas de gestação, e os grupos gestantes controles, pacientes com LES e controles pareados para idade e cor da pele. Os critérios de exclusão foram: 1) mais de vinte semanas de gestação no momento da coleta do material (sangue e urina) para estudo; 2) mulheres não gestantes com mais de 40 anos (não se encontravam em idade fértil); 3) portadoras de LES associada à outra doença autoimune, excetuando síndrome anticorpo antifosfolipídeo; 4) processos infecciosos que requereram tratamento com antibioticoterapia sistêmica até sete dias antes do ingresso no estudo. No grupo PLES, foram aceitas somente pacientes que usassem, para tratamento do LES, prednisona (Pred), difosfato de cloroquina (CQN)/hidroxicloroquina (HCQ) e azatioprina (AZA), por serem as medicações mais comumente usadas para tratamento do LES na gestação. No dia da coleta de sangue e da amostra de urina, aplicou-se um questionário às pacientes, para avaliar fatores que poderiam interferir na resposta imune: febre, resfriado, alergias, uso de medicação, atividade física, exposição a sol e banho de mar, tabagismo, uso de bebida alcoólica e estado de humor.

Para determinação do número total de células NK, 50 μL de sangue (contendo, no máximo, 0,5 x 10⁶ células/mL por tubo) foram corados com 3 μL de anti-CD56-PE (BD 347747 Califórnia, EUA) e incubados por vinte minutos a 4 ºC. Em seguida, as hemácias foram lisadas com Quicklise (Cytognos, Salamanca, Espanha) por 15 minutos e as células restantes foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada pH 7,2 gelado. Logo após, as células foram centrifugadas por três minutos a 400 x g. Para a quantificação do percentual de apoptose nas células NK (CD56⁺), utilizou-se o kit de detecção de apoptose da BD Pharmingen™ (Califórnia, EUA), que cora com anexina V e iodeto de propidium. Neste ensaio, a apoptose é quantificada por meio da detecção de fosfatidilserina exposta na superfície de células apoptóticas usando anexina V, que tem afinidade por ela,¹⁶e o PI detecta células vivas ou mortas. As células, então, foram ressuspendidas em 300 μL de solução salina tamponada; 2,5 μL de anexina-V-FITC e 2,5 μL de PI (FL-3) foram adicionados, seguidos de homogeinização e incubação por 15 minutos em câmara escura. Após a incubação, foram adicionados 300 μL de solução salina tamponada às células, as quais foram processadas e adquiridas no citômetro FACSCalibur (BD Biosciences, Califórnia, EUA) no máximo em uma hora. Foram adquiridos 10 mil eventos nos canais FL-1, FL-2 e FL-3. A análise foi realizada com lógica multiparamétrica para visualizar o movimento de migração das células vivas para aquelas em apoptose (inicial e tardia) e mortas. Utilizou-se o programa Paint'A'Gate para essa análise e a quantificação dessas populações.

A avaliação estatística foi dividida em análise descritiva e inferencial; a primeira teve como objetivo caracterizar os grupos investigados, enquanto, com a realização das inferências, buscou-se compará-las para a identificação de possíveis diferenças estatísticas, sempre tendo o valor de α = 0,05.

A análise descritiva levou às estimativas de medidas de localização (média e mediana) e dispersão (desvio-padrão e coeficiente de variação) para as variáveis quantitativas (idade, CD56⁺%, CD56⁺ absoluta/mm³, célula viva, apoptose inicial, apoptose tardia, célula morta, apoptose total, idade gestacional), tal como defendido por Costa Neto.¹⁷ Essa referência embasou também o desenvolvimento de tabelas de frequência para as variáveis qualitativas (cor da pele, humor, questionário, Pred, CQN/HCQ, AZA, SLEPDAI¹³ e SLEDAI^14,15).

Ainda no domínio descritivo, estimaram-se a correlação linear de Pearson e a covariância, ambas tomadas para as variáveis quantitativas.¹⁸ O coeficiente de correlação V de Cramer foi estimado para a variável questionário contra CD56⁺%, CD56⁺ abs/mm³ e apoptose total, uma vez que envolve variável qualitativa.¹⁸

A comparação entre os grupos exigiu que a proximidade com a distribuição normal fosse avaliada para as variáveis quantitativas, o que foi realizado por meio do teste de Shapiro-Wilk, dado o baixo número de indivíduos/grupo.¹⁷

A normalidade possibilitou que a comparação de quatro grupos fosse realizada por meio da ANOVA two-way.¹⁹ Na inobservância de proximidade com a distribuição normal, aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis,²⁰ (CD56⁺%, CD56⁺abs, apoptose inicial, apoptose tardia, célula morta).

Os grupos GLES e PLES foram comparados para algumas variáveis que somente se fizeram presentes neles; então, a investigação de diferença estatística foi desenhada pelo teste de Mann-Whitney²⁰ (idade gestacional).

Para as variáveis qualitativas, a comparação das frequências se deu por meio do teste Qui-Quadrado¹⁹ (cor da pele, humor, questionário, Pred, CQN/HCQ, AZA).

As análises estatísticas foram feitas com base no coeficiente de variação (CV).¹⁷

CV < 20,00% - baixa variabilidade, os indivíduos tiveram resultados uniformes, então a caracterização da variável foi feita pela média e pelo desvio-padrão.

CV > 20,00% - alta variabilidade, os indivíduos tiveram resultados discrepantes, então a caracterização da variável foi feita pela mediana e pelo coeficiente de variação.

RESULTADOS

As pacientes GLES, no momento da avaliação, tinham idade gestacional que variava entre dez semanas e três dias a vinte semanas e as Gcontroles, de nove semanas e seis dias a 18 semanas. A idade gestacional foi estimada em dias, e o grupo GLES tinha 105,00 dias ± 23,55%, e do grupo GControles 100,45 dias ± 16,73%. A idade das mulheres estudadas nos quatro grupos variou de 17 anos e 11 meses a 40 anos; no grupo GLES foi de 25 anos ± 24,66%, enquanto, no PLES, Gcontroles e Controles, foi respectivamente 32,40 ± 6,20 anos, 25,80 ± 4,85 anos e 30,91 ± 5,01 anos, o que, a priori, indicou que os grupos eram uniformes no tocante à idade. Portanto, essa variável não deve ter impactado nas demais, exceto no GLES. Obteve-se a contagem das células CD56⁺ (porcentagem e valor absoluto). Sua porcentagem apresentou alta variabilidade e as medianas foram: no grupo GLES, 0,10 ± 91,01%; no PLES, 0,12 ± 27,65%; Gcontroles, 0,15 ± 45,70%; e controles, 0,08 ± 47,47%. Na tabela 1, estão descritos os valores individuais.

Após a determinação do valor total das células NK, essas foram analisadas em relação à sua viabilidade, sendo diferenciadas nas fases de células vivas, células em apoptose inicial, células em apoptose tardia e células mortas. O valor de apoptose total foi considerado como a soma das fases apoptose inicial, apoptose tardia e célula morta. Essa determinação se baseou na consideração de que, uma vez que a célula entra em apoptose, seu curso natural é a morte. Os resultados de cada fase foram calculados em porcentagem e analisados em relação à sua média, ao desvio-padrão, à mediana e ao coeficiente de variação (Tabela 2). As células vivas apresentaram baixa variabilidade, com médias: no grupo GLES, 0,91 ± 0,06%; PLES, 0,95 ± 0,03%; Gcontroles, 0,86 ± 0,11%; e Controles, 0,88 ± 0,08. Os grupos de pacientes com LES tiveram um número maior de NK vivas, se compararmos com as pacientes sem doença, e o grupo GLES teve valor menor que o grupo PLES, assim como o grupo Gcontroles, quando comparado ao grupo Controles (Tabela 2).

As fases de apoptose inicial, apoptose tardia e célula morta apresentaram alta variabilidade, assim como a apoptose total. A mediana da apoptose total, GLES 0,06 ± 73,45%, PLES 0,04 ± 54,86%, Gcontroles 0,11 ± 75,72% e Controles 0,11 ± 62,30%, foi menor nos grupos de pacientes com LES quando comparados com os grupos de pacientes sem doença (Tabela 2) (Figura 1).

Algumas pacientes estavam em uso de medicações durante o período do estudo, excetuando tratamento com antibiótico sistêmico. Analisou-se a frequência do uso dessas medicações (Tabela 3).

Foi aplicado o teste de Shapiro-Wilk para as variáveis de idade, CD56⁺, célula viva, apoptose inicial, apoptose tardia, célula morta e apoptose total (Tabela 4). Em seguida, aplicou-se o teste da ANOVA¹³ para as variáveis de idade (P = 0,02), célula viva (P = 0,06), apoptose total (P = 0,03), sendo também aplicado o teste de Fisher¹³ para idade e apoptose total (Tabela 5). Encontrou-se diferença significativa na apoptose total dos grupos Gcontroles e Controles em relação ao grupo PLES, mas não foi possível identificar diferença em relação ao grupo GLES.

Foram analisados os resultados dos índices de atividade do LES, SLEPDAI¹³ e SELENA/SLEDAI^14,15 em relação as CD56⁺%, CD56⁺ abs, célula viva e apoptose total (Tabela 6), e observou-se dependência com o CD56⁺abs, porém inverso, ou seja, quando a variabilidade de CD56⁺ aumentou a do SLEPDAI¹³ e a SELENA/SLEDAI^14,15 diminuiu. Verificou-se uma relação, mas não uma correlação, entre CD56⁺% e CD56⁺ abs: a dependência somente se deu no CD56⁺ abs. As correlações das células vivas e da apoptose total não foram significativas (P > 0,05). Não houve dependência entre as variáveis. Talvez devido ao pequeno número de indivíduos em cada grupo e/ou a alguma variável que interferiu nos resultados, não foi possível verificar valores estatisticamente significativos.

DISCUSSÃO

As células NK são a população de leucócitos predominantes na mucosa uterina e muito se tem estudado para analisar seu papel no momento da implantação e na manutenção da gestação. Alterações na regulação das células NK têm sido associadas a alterações reprodutivas, como abortos espontâneos, falha na implantação e infertilidade, e pré-eclâmpsia.²¹Aborto espontâneo está associado a aumento nas células NK CD56^dimCD16⁺ e diminuição na CD56^brightCD16^- no endométrio durante a fase lútea.²²Um estudo que avaliou os níveis de células NK no sangue periférico no período de pré-concepção e pós-concepção não constatou alterações significativas desses níveis, quando foram estudadas mulheres com história de abortos de repetição em comparação a controles normais. No entanto, quando avaliadas as subpopulações das células NK, as células CD56⁺CD16⁺ se encontraram moderadamente reduzidas nas gestantes em comparação com as não gestantes.²¹ É importante lembrar que os valores da contagem de células NK não refletem especificamente a resposta imune da gravidez, e que a quantidade e a atividade dessas células podem flutuar de acordo com diferentes variáveis, tais como: efeitos hormonais, atividade física, hora do dia e resposta simpática ao estresse. Além disso, o número de células NK do sangue periférico não está necessariamente correlacionado com sua citotoxicidade.²¹Em nosso estudo, usamos um questionário contendo algumas dessas variáveis, que poderiam interferir nos valores das células NK, para tentar minimizar erros na interpretação dos resultados. Não verificamos correlação entre os valores de células NK e as variáveis estudadas (febre, resfriado, alergias, uso de medicação, atividade física, exposição a sol e banho de mar, tabagismo, uso de bebida alcoólica e estado de humor).

Apesar de ainda controversos, alguns estudos demonstram aumento nos índices de atividade do LES adaptados para gestação. O aumento da atividade do LES tem implicações profundas sobre os resultados fetais, sendo associado ao menor número de nascidos vivos, e de prematuridade. Entretanto, a presença do lúpus anticoagulante aumenta o risco de perda fetal.²³Existem relatos de diminuição do número das células NK do sangue periférico de pacientes com LES, e essa diminuição seria mais acentuada em pacientes com doença ativa.¹ Este estudo não verificou redução no número de células NK em pacientes gestantes e/ou controles com ou sem LES, mas o pequeno número de indivíduos em cada grupo pode ter dificultado essa avaliação. Não se avaliou atividade das células NK, mas seu ciclo celular. Não se encontraram relatos sobre a avaliação do ciclo celular das células NK em pacientes com LES.

Schepis et al. verificaram um aumento de células NKem paciente com LES, independentemente da atividade da doença. Esse aumento foi relacionado ao aumento de INF tipo I (citocina de primeira resposta, produzida principalmente por células dendríticas; parece estar envolvida na patogênese do LES), uma citocina abundante no LES e que pode levar ao aumento de células NK in vitro. Os níveis séricos de INF-α estavam aumentados em pacientes em atividade da doença, mas não naqueles fora de atividade.²⁴Neste estudo, não observamos diferenças significativas na contagem de células NK entre os grupos estudados devido à alta variabilidade nos resultados. No entanto, quando relacionado aos índices de atividade do LES (SLEPDAI¹³ e SELENA/SLEDAI^14,15), verificamos relação inversa com o número absoluto de CD56⁺, mas essa relação não se manteve no percentual de células CD56⁺, não havendo correlação entre o percentual e o número absoluto. Esses resultados não tiveram significância estatística.

Ainda há discussão se os testes sanguíneos com aumento dos níveis de células NK podem ser reprodutíveis, se os valores das pacientes com perda gestacional estão dentro do índice de normalidade e os níveis elevados no sangue podem representar uma mobilização em resposta ao estresse. O aumento dos níveis de células NK pode decorrer, em parte, de uma resposta ao estresse da punção venosa (elevação da contagem de NK foi encontrada na amostra inicial, e não vinte minutos mais tarde). No entanto, contagens elevadas de células NK no sangue periférico poderiam ser importantes para eventos na interface materno-fetal, elevação de estresse da atividade das células NK e respectiva mobilização, sugerindo um papel relevante na fisiopatologia das perdas fetais.²⁵ Essas discordâncias na literatura sobre os valores encontrados de células NK em pacientes com LES podem estar relacionadas à dificuldade em determinar uma relação entre os valores das células NK e sua correlação com a atividade da doença, devido aos vários fatores que podem interferir na resposta imune.

Neste estudo, foram avaliados a contagem de células NK, sua viabilidade e o número de células vivas e em fase de apoptose inicial e tardia, células mortas e apoptose total. Os resultados das células vivas apresentaram baixa variabilidade e os grupos de pacientes com LES (GLES e PLES) tiveram um número maior de células NK vivas, em comparação com as pacientes sem a doença, e o grupo das gestantes (GLES) apresentou valor menor que o grupo das não gestantes (PLES), assim como o grupo das gestantes sem doença (Gcontroles), quando comparado ao grupo Controles. Talvez isso mostre que, no sangue periférico, há um número menor de células NK vivas no início da gestação. Em geral, células apoptóticas são rapidamente removidas por fagocitose devido à indução de mudanças na superfície da célula pelo processo de apoptose. Isso impede a liberação de constituintes fisiológicos intracelulares, incluindo nucleossomos, que são formados durante o processo de apoptose por meio de clivagem da cromatina por nucleases. Por isso, distúrbios, quer em apoptose ou em fagocitose, das células apoptóticas têm sido propostos no desenvolvimento de doenças autoimunes, especialmente em LES.²⁶Vários estudos usando camundongos com deficiências de moléculas (por exemplo, C1q e IgM) ou receptores envolvidos na fagocitose de células apoptóticas têm mostrado que a alteração na remoção das células apoptóticas conduz à autoimunidade contra nucleossomas e glomerulonefrite. Além disso, os defeitos de depuração de células apoptóticas têm sido descritos em camundongos e pacientes com lúpus. Nucleossomas não só são importantes para a indução da doença, como também podem influenciar na depuração das células apoptóticas. Além disso, autoanticorpos formados no LES também podem modular esse processo. Por isso, durante a progressão da doença, quando nucleossomas e autoanticorpos começam a circular, eles podem amplificar a doença por inibição da depuração das células apoptóticas.²⁶ Em nosso estudo, verificamos que a apoptose total esteve diminuída nos grupos de pacientes com LES quando comparados com os grupos sem doença.

Não foi possível determinar o perfil predominante das células NK, mas talvez esse aumento no valor de células vivas e a diminuição em apoptose total possam sugerir que as células NK em pacientes com LES, gestantes ou não, permanecem vivas e talvez em funcionamento, por um período maior.

CONCLUSÃO

Neste estudo-piloto, não foi possível demonstrar diferenças nos valores das células NK de pacientes com LES ou sem a doença. Em relação ao ciclo celular da célula NK, as células vivas nos grupos de pacientes com LES estiveram em maior número que nos controles sem a doença; as gestantes apresentaram valores menores do que as não gestantes nos grupos com LES e nos de pacientes sem a doença. A apoptose total esteve diminuída nos grupos de pacientes com LES quando comparados com os grupos sem a doença, porém menos nas pacientes não grávidas do que nas gestantes.

Essas diferenças entre contagem de células vivas e apoptose total talvez demonstrem que, em pacientes com LES, grávidas ou não, as células NK têm uma vida útil prolongada (ou um turnover menor/diferente), o que sugere que pode haver um maior estímulo imune, fazendo com que as células NK levem mais tempo para ativar o processo de apoptose. Devido ao pequeno número de pacientes em cada grupo, os resultados encontrados podem ter sido apenas uma coincidência. Continuaremos coletando amostras de novos casos dentro do mesmo protocolo.

AGRADECIMENTOS

Aos médicos e residentes das disciplinas de Reumatologia e Obstetrícia da Universidade Estadual do Rio de Janeiro e da Maternidade Escola da UFRJ, onde realizamos parte de nosso estudo com as gestantes; aos funcionários do Laboratório Bronstein, RJ (Diagnósticos da América SA), onde foram realizados os exames.

Recebido em 26/06/08.

Aprovado, após revisão, em 28/04/09.

Os autores declaram ter recebido apoio financeiro do FAPERJ E-26/170.034/06, 2006.

Disciplina de Reumatologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto (UERJ) e disciplina de Obstetrícia do Hospital Universitário Pedro Ernesto (UERJ)

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Ago 2009
• Data do Fascículo
  Ago 2009

Histórico

• Aceito
  28 Abr 2009
• Recebido
  26 Jun 2008