Influência da suplementação de creatina sobre a massa óssea de ratos espontaneamente hipertensos

Resumos

INTRODUÇÃO: Recentes evidências indicam que a suplementação de creatina (Cr) é capaz de aumentar a densidade mineral óssea (DMO) no fêmur de ratos saudáveis em crescimento. Entretanto, há poucos estudos que testam a efetividade da suplementação desse nutriente em condições de perda óssea. OBJETIVO: Investigar o efeito da suplementação de Cr na DMO e no conteúdo mineral ósseo (CMO) de ratos espontaneamente hipertensos (SHR), um modelo experimental de baixa massa óssea. MATERIAIS E MÉTODOS: Dezesseis ratos SHR machos com 8 meses de idade foram randomizados em dois grupos experimentais pareados pelo peso corporal, a saber: 1) Pl: SHR tratados com placebo (água destilada; n = 8); e 2) Cr: SHR tratados com Cr (n = 8). Após nove semanas de suplementação os animais foram eutanasiados e o fêmur e a coluna vertebral (L1-L4) foram analisados por densitometria óssea (Dual Energy X-Ray Absorptiometry). RESULTADOS: Não houve diferença significativa na DMO (Pl = 0,249 ± 0,003 g/cm² vs. Cr = 0,249 ± 0,004 g/cm²; P = 0,95) e no CMO (Pl = 0,509 ± 0,150 g vs. Cr = 0,509 ± 0,017 g; P = 0,99) da coluna vertebral e na DMO (Pl = 0,210 ± 0,004 g/cm² vs. Cr = 0,206 ± 0,004 g/cm2;P = 0,49) e no CMO (Pl = 0,407 ± 0,021 g vs. Cr = 0,385 ± 0,021 g; P = 0,46) do fêmur total entre os grupos experimentais. CONCLUSÃO: Neste estudo, usando um modelo experimental de baixa massa óssea, a suplementação de Cr não afetou a massa óssea.

osteoporose; creatina; densidade mineral óssea

INTRODUCTION: Recent evidence has suggested that creatine supplementation (Cr) can increase the bone mineral density (BMD) of the femur in healthy growing rats. Nevertheless, studies assessing the efficacy of the Cr supplementation in conditions characterized by bone mass loss are scarce. OBJECTIVE: To investigate the effect of Cr supplementation on BMD and bone mineral content (BMC) in spontaneously hypertensive rats (SHRs), an experimental model of osteoporosis. MATERIALS AND METHODS: Sixteen 8-month-old male SHRs were randomly allocated into two groups matched by body weight: 1) Pl group: SHRs treated with placebo (distilled water; n = 8); and 2) Cr group: SHRs treated with Cr (n = 8). After nine weeks of supplementation, the animals were euthanized and their femur and spine (L1-L4) were analyzed by use of densitometry (Dual Energy X-Ray Absorptiometry). RESULTS: No significant difference was observed between the groups regarding either the spine or the total femur measures as follows: spine - BMD (Pl = 0.249 ± 0.003 g/cm² vs. Cr = 0.249 ± 0.004 g/cm²; P = 0.95) and BMC (Pl = 0.509 ± 0.150 g vs. Cr = 0.509 ± 0.017 g; P > 0.99); and total femur - BMD (Pl = 0.210 ± 0.004 g/cm² vs. Cr = 0.206 ± 0.004 g/cm²; P > 0.49) and BMC (Pl = 0.407 ± 0.021 g vs. Cr = 0.385 ± 0.021 g; P > 0.46). CONCLUSION: In this study, using the experimental model of osteoporosis, Cr supplementation had no effect on bone mass.

osteoporosis; creatine; bone mineral density

COMUNICAÇÃO BREVE

Influência da suplementação de creatina sobre a massa óssea de ratos espontaneamente hipertensos

Christiano Robles Rodrigues Alves^I; Igor Hisashi Murai^I; Pamella Ramona^II; Humberto Nicastro^III; Lilian Takayama^IV; Fabiana Guimarães^V; Antonio Herbert Lancha Junior^VI; Maria Claudia Irigoyen^VII; Rosa Maria Rodrigues Pereira^VIII; Bruno Gualano^IX

^IAluno de Graduação em Educação Física, Escola de Educação Física e Esporte, Universidade de São Paulo - EEFE/USP

^IIMestranda em Fisiopatologia Experimental, Instituto do Coração, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo - InCor-HCFM/USP

^IIIDoutorando em Educação Física, EEFE/USP

^IVEspecialista do Laboratório de Metabolismo Ósseo, FMUSP

^VMestranda em Ciências, EEFE/USP

^VIDoutor em Nutrição Experimental, Faculdade de Ciências Farmacêuticas - FCM/USP; Professor Titular, EEFE/USP

^VIIDoutora em Fisiologia Cardiovascular, USP; Professora do Departamento de Cardiopneumologia, FMUSP

^VIIIDoutora em Reumatologia, FMUSP; Pós-Doutorado em Biologia Celular e Molecular Aplicada à Célula Óssea, Connecticut University; Professora-Associada da Divisão de Reumatologia, FMUSP

IXProfessor Doutor do Departamento de Biodinâmica do Movimento Humano, EEFE/USP

^{Correspondência para}

RESUMO

INTRODUÇÃO: Recentes evidências indicam que a suplementação de creatina (Cr) é capaz de aumentar a densidade mineral óssea (DMO) no fêmur de ratos saudáveis em crescimento. Entretanto, há poucos estudos que testam a efetividade da suplementação desse nutriente em condições de perda óssea.

OBJETIVO: Investigar o efeito da suplementação de Cr na DMO e no conteúdo mineral ósseo (CMO) de ratos espontaneamente hipertensos (SHR), um modelo experimental de baixa massa óssea.

MATERIAIS E MÉTODOS: Dezesseis ratos SHR machos com 8 meses de idade foram randomizados em dois grupos experimentais pareados pelo peso corporal, a saber: 1) Pl: SHR tratados com placebo (água destilada; n = 8); e 2) Cr: SHR tratados com Cr (n = 8). Após nove semanas de suplementação os animais foram eutanasiados e o fêmur e a coluna vertebral (L1-L4) foram analisados por densitometria óssea (Dual Energy X-Ray Absorptiometry).

RESULTADOS: Não houve diferença significativa na DMO (Pl = 0,249 ± 0,003 g/cm²vs. Cr = 0,249 ± 0,004 g/cm²; P = 0,95) e no CMO (Pl = 0,509 ± 0,150 g vs. Cr = 0,509 ± 0,017 g; P = 0,99) da coluna vertebral e na DMO (Pl = 0,210 ± 0,004 g/cm²vs. Cr = 0,206 ± 0,004 g/cm^2;P = 0,49) e no CMO (Pl = 0,407 ± 0,021 g vs. Cr = 0,385 ± 0,021 g; P = 0,46) do fêmur total entre os grupos experimentais.

CONCLUSÃO: Neste estudo, usando um modelo experimental de baixa massa óssea, a suplementação de Cr não afetou a massa óssea.

Palavras-chave: osteoporose, creatina, densidade mineral óssea.

INTRODUÇÃO

O rato espontaneamente hipertenso (SHR) tem sido considerado o modelo genético de hipertensão arterial que mais se assemelha à hipertensão primária observada em seres humanos.^1,2 Diversas evidências indicam redução da densidade mineral óssea (DMO) nesse modelo, decorrente de alterações no metabolismo do cálcio que provocam um aumento da reabsorção óssea.^3-5 Enquanto ratos Sprague Dawley saudáveis apresentam o pico de massa óssea por volta de 30-36 semanas de idade, ratos SHR estabilizam seu crescimento ósseo com apenas 18 semanas. Além disso, o valor de pico de massa óssea é cerca de 40 mg/cm² menor nos ratos SHR em comparação aos ratos saudáveis.6 Portanto, ratos SHR são considerados um modelo experimental para o estudo de osteoporose.⁷

A demanda energética das células ósseas para sobreviver, proliferar, diferenciar-se e sintetizar matriz extracelular é sabidamente alta.⁸ Há evidências indicando que parte da energia necessária para esses processos é proveniente da creatina (Cr; ácido α-metil guanidínico acético), que exerce papel central na manutenção dos níveis de ATP e ADP em diversos tecidos, tais como musculoesquelético, cerebral, testicular, cartilaginoso e ósseo (para uma recente e abrangente revisão sobre o tema, ver Wallimann et al.⁹).

A hipótese de que a Cr poderia exercer importante participação no metabolismo ósseo foi primeiramente sugerida com base na identificação de isoformas da creatina quinase (CK), enzima responsável pela reação reversível: creatina fosfato + ADP + H⁺ creatina + ATP no osso.^9,10 Além disso, ensaios in vitro indicam que estímulos capazes de induzir o desenvolvimento da massa óssea [p. ex., fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) e hormônio paratireoidiano] elevam concomitantemente a atividade da CK, sugerindo que o sistema Cr/CK está associado ao processo de remodelamento ósseo.^11,12 De fato, um estudo demonstrou que a incubação de Cr em meio de cultura com osteoblastos primários promove efeitos estimulatórios sobre diferenciação, atividade metabólica e mineralização óssea, elevando a razão fosforilcreatina/Cr e preservando a ultraestrutura e a função mitocondrial de osteoblastos.⁸

Evidências in vivo^13,14 corroboram esses achados. Sabe-se que a suplementação de Cr pode aumentar a DMO e ocasionar adaptações biomecânicas benéficas no fêmur de ratos saudáveis.¹⁵ Em humanos, há evidências preliminares de que a suplementação de Cr pode prevenir a perda de massa óssea em pacientes com distrofia de Duchenne¹⁴ e em idosos submetidos a treinamento físico.¹⁶

Claramente, entretanto, o papel da suplementação alimentar com Cr permanece pouco explorado. Com o objetivo de aumentar a compreensão sobre os efeitos da Cr em possíveis condições de perda de massa óssea, o presente estudo investigou o efeito desse nutriente sobre a DMO e o conteúdo mineral ósseo (CMO) de ratos SHR.

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostra

A amostra foi composta por 16 ratos SHR machos com 8 meses de idade. Os animais foram alocados no biotério do Laboratório de Nutrição e Metabolismo Aplicados à Atividade Motora (Escola de Educação Física e Esporte da Universidade de São Paulo - EEFE/USP) e mantidos em gaiolas plásticas (três a quatro animais por caixa), a uma temperatura ambiente de 22,0 ºC-24,0 ºC e em ciclo de 12 horas (claro:escuro invertido). Água e ração foram oferecidas de modo irrestrito, com dieta normoproteica (12% de proteínas).

Desenho experimental

Os animais foram randomizados em dois grupos experimentais pareados pelo peso corporal, a saber: 1) Pl: ratos SHR tratados com placebo (n = 8); e 2) Cr: ratos SHR tratados com Cr (n = 8). Após nove semanas de intervenção os animais foram eutanasiados por decapitação. As peças ósseas (fêmur direito e coluna vertebral L1-L4) foram removidas com auxílio de material cirúrgico, imersas em soro fisiológico 0,9% e congeladas a -80 ºC para posterior análise da DMO.

Os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da EEFE/USP sob o protocolo 2011/10.

Suplementação de creatina

O grupo Cr foi suplementado diariamente com Cr (Ethika, Ribeirão Preto, SP, Brasil) por meio de gavagem, durante nove semanas. A Cr em pó foi diluída em água (temperatura ambiente) na proporção de 200 g para cada litro de água, e a dosagem utilizada foi de 5 g/kg peso/dia.¹³ Os animais foram pesados diariamente para as correções necessárias. O grupo Pl recebeu água destilada via gavagem para mimetizar o estresse imposto ao grupo suplementado.

Densitometria mineral óssea

As análises da DMO e do CMO da coluna vertebral (L1-L4) e do fêmur total (o fêmur inteiro, incluindo a diáfise e as epífises) foram realizadas por densitometria óssea (Dual Energy X-Ray Absorptiometry; DXA). Para tal, utilizou-se o aparelho Discovery-A SN: 80999 Hologic (Bedford, MA, EUA) no modo high resolution, com auxílio do programa small animal, oferecido pelo mesmo fabricante. A precisão do DXA para análise da DMO foi previamente analisada pela mensuração do coeficiente de variação, expresso na porcentagem da média.17,18 O coeficiente de variação foi de 1,9% para a coluna vertebral e de 0,6% para o fêmur total. Em conjunto, esses dados indicam um alto nível de precisão nas medidas.

Análises estatísticas

Os dados foram expressos em média ± desvio padrão. Empregou-se o teste t não pareado para comparar a DMO e o CMO dos grupos experimentais e ANOVA de dois fatores para avaliar semanalmente o peso corporal. O nível de significância adotado para rejeição da hipótese nula foi de P < 0,05.

RESULTADOS

Apenas um rato (Pl) morreu ao longo do seguimento. O peso corporal não apresentou diferenças significativas entre os dois grupos experimentais durante todo o estudo (P = 0,48; Figura 1).

Não houve diferença significativa entre os grupos experimentais para a DMO (Pl = 0,249 ± 0,003 g/cm²vs. Cr = 0,249 ± 0,004 g/cm²; P = 0,95; Figura 2A) e o CMO (Pl = 0,509 ± 0,150 g vs. Cr = 0,509 ± 0,017 g; P > 0,99; Figura 2B) da coluna vertebral, bem como para a DMO (Pl = 0,210 ± 0,004 g/cm²vs. Cr = 0,206 ± 0,004 g/cm²; P > 0,49; Figura 3A) e o CMO (Pl = 0,407 ± 0,021 g vs. Cr = 0,385 ± 0,021 g; P > 0,46; Figura 3B) do fêmur total.

DISCUSSÃO

O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da suplementação de Cr na massa óssea de ratos SHR, um modelo experimental bem-descrito para estudo de baixa massa óssea.^3-5 Nossos achados vêm de encontro aos obtidos por Antolic et al.,¹⁵ que observaram efeitos benéficos da suplementação de Cr na massa óssea de ratos Sprague Dawley. Algumas diferenças metodológicas podem explicar os resultados contraditórios. Antolic et al.¹⁵ demonstraram benefícios da suplementação de Cr em ratos em fase de crescimento, ao passo que, no presente estudo, foram usados ratos adultos. O processo de crescimento e desenvolvimento ósseo é caracterizado por alto turnover ósseo, período mais suscetível a influências ambientais sobre a massa óssea.¹⁹ Possivelmente, os ganhos com a suplementação de Cr poderiam ter sido acentuados nessa fase. Além disso, é importante ressaltar que o modelo SHR apresenta sabidamente alta reabsorção óssea e, por conseguinte, baixa massa óssea. Em contrapartida, o modelo Sprague Dawley estudado por Antolic et al.¹⁵ não apresenta alterações no metabolismo ósseo. Com base nas diferenças dos modelos experimentais, é possível especular que a suplementação de Cr seja mais eficaz em potencializar o ganho de massa óssea em ratos saudáveis em fase de crescimento que atenuar a perda de massa óssea em ratos em processo de perda de massa óssea.

Este trabalho apresenta algumas limitações. Em primeiro lugar, não avaliamos a captação tissular de Cr a fim de garantir o sucesso da suplementação. Contudo, a dosagem empregada neste estudo (5 g/kg peso/dia) tem sido considerada alta na literatura^20,21 e efetiva em aumentar o conteúdo musculoesquelético de Cr em ratos Wistar.²¹ Estudos futuros precisam avaliar se a suplementação de Cr é capaz de elevar as concentrações desse substrato também no tecido ósseo. Por fim, é importante ressaltar que apenas ratos machos foram avaliados em nosso estudo. Sabendo que o gênero é um fator que influencia diretamente na resposta da massa óssea²² e, portanto, dada a impossibilidade de generalização desses dados para ambos os gêneros, novos estudos devem também avaliar o potencial terapêutico da Cr no remodelamento da massa óssea em fêmeas.

Embora existam evidências de que a suplementação de Cr poderia promover importantes efeitos terapêuticos, incluindo aumento de massa óssea,²³ nossos achados indicam que ratos SHR suplementados com Cr não apresentam tais ganhos. Tendo em vista a evidente dificuldade em se realizar grandes ensaios clínicos longitudinais, outros modelos que se caracterizam por perda de massa óssea (p. ex., ratos policísticos ou tratados com corticoides) devem ser investigados, a fim de se avaliar com maior profundidade o potencial terapêutico da Cr sobre a preservação da DMO em condições de baixa massa óssea. Contudo, cabe ressaltar que o metabolismo da Cr parece diferir substancialmente entre espécies, razão pela qual estudo em humanos deve ser conduzido com o intuito de comprovar todos os achados pré-clínicos.

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Recebido em 30/05/2011.

Aprovado, após revisão, em 05/03/2012.

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

Comitê de Ética: 2011/10.

Escola de Educação Física e Esporte, Universidade de São Paulo - EEFE/USP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Maio 2012
• Data do Fascículo
  Jun 2012

Histórico

• Recebido
  30 Maio 2011
• Aceito
  05 Mar 2012