Características de atividade das células natural killer em pacientes com esclerose sistêmica

Resumos

INTRODUCTION: Previous studies have shown an increased expression of natural killer (NK) cells in the peripheral blood of patients with systemic sclerosis (SSc). NK cells are part of innate immunity, recognizing infected cells through killer immunoglobulin-like receptors (KIR), which show marked polymorphism. A novel model has been proposed predicting the activity of NK cells, evaluating whether there is excessive activation (EA), excessive inhibition (EI) or balance (B) (neutral). OBJECTIVE: To evaluate the activity of NK cells in patients with SSc and compare it with that of a control group. METHOD: This study comprised 110 patients with SSc and 115 healthy controls. A novel model that predicts the activity of NK cells was used. For that, cells with their respective KIR/HLA-C and Bw4 ligands were considered. The activity of NK cells was defined as EA, EI, or B. RESULTS: Our results showed that 63.5% of healthy controls had the KIR phenotype characterized by EI, as compared with 39.1% of the patients with SSc (P = 0.001). Considering only KIR2DL2-positive individuals, 34.7% of EI was found in healthy controls and 10.9% in patients with SSc (P < 0.001). CONCLUSION: In our study, the model that predicts the action of NK cells showed that healthy controls have higher frequency of EI as compared with SSc patients, suggesting a protective effect of the EI profile against the development of SSc. These results suggest a potential role of NK cells in the pathogenesis of SSc, but further studies should be conducted to confirm our data.

ARTIGO ORIGINAL

Características de atividade das células natural killer em pacientes com esclerose sistêmica

Patricia Hartstein Salim^I; Mariana Jobim^II; Markus Bredemeier^III; José Artur Bogo Chies^IV; João Carlos Tavares Brenol^V; Luiz Fernando Jobim^VI; Ricardo Machado Xavier^VII

^IDoutoranda em Ciências Médicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFGRS

^IIDoutora em Medicina, UFGRS; Médica Imunologista, Hospital de Clínicas de Porto Alegre - HCPA, UFGRS

^IIIDoutor em Medicina, UFGRS; Médico do Serviço de Reumatologia, Hospital Nossa Senhora da Conceição, Grupo Hospitalar Conceição - HNSC-GHC

^IVDoutor em Ciências da Vida, Especialidade em Imunologia, Université de Paris V; Professor Associado do Departamento de Genética, UFGRS

^VDoutor em Medicina, UFGRS; Professor Associado do Departamento de Medicina Interna, UFGRS

^VIDoutor em Medicina, Médico Imunologista, Chefe do Serviço de Imunologia, HCPA-UFRGS; Professor Associado do Departamento de Medicina Interna, UFGRS

^VIIDoutor em Imunologia, Shimane Medical University; Professor Associado, UFGRS; Chefe do Serviço de Reumatologia, HCPA-UFRGS

^{Correspondência para}

RESUMO

INTRODUÇÃO: Estudos têm relatado um aumento da expressão das células natural killer (NK) no sangue periférico de pacientes com esclerose sistêmica (ES). Essas células fazem parte da imunidade inata, reconhecendo células infectadas por meio dos receptores killer immunoglobulin-like receptor (KIR), que apresentam acentuado polimorfi smo. Um novo modelo foi proposto prevendo a atividade das células NK, avaliando o excesso de ativação (EA), excesso de inibição (EI) ou se a célula está funcionalmente em equilíbrio (balance, B) (neutra).

OBJETIVO: Avaliar a atividade das células NK em pacientes com ES e comparar com grupo-controle.

MÉTODO: Cento e dez pacientes com ES e 115 controles foram estudados. Foi aplicado um novo modelo que prevê a atividade das células NK. Para esse método, considerou-se cada célula com seu respectivo ligante KIR/HLA-C e Bw4. A nomenclatura utilizada foi EA, EI e B.

RESULTADOS: Nossos resultados mostraram que 63,5% dos controles saudáveis apresentavam o fenótipo KIR caracterizado por EI, em comparação com 39,1% dos pacientes com ES (P = 0,001). Considerando-se somente indivíduos com presença de KIR2DL2 (KIR2DL2+), encontramos 34,7% de EI em controles sadios e 10,9% em pacientes com ES (P < 0,001).

CONCLUSÃO: Em nosso estudo, o modelo que prevê a ação das células NK mostrou que controles sadios têm maior frequência de EI quando comparados a pacientes com ES, sugerindo um efeito protetor do EI contra o desenvolvimento da ES. Outros estudos, porém, devem ser realizados para confi rmar nossos dados.

Palavras-chave: receptores KIR, células natural killer, escleroderma sistêmico, autoimunidade.

INTRODUÇÃO

A esclerose sistêmica (ES) é uma rara doença autoimune caracterizada por disfunção endotelial e fibrose tecidual. É uma doença difusa do tecido conjuntivo, podendo afetar diversos sistemas orgânicos (principalmente digestivo e respiratório). Há duas formas de apresentação da ES, limitada e difusa, diferenciadas pela extensão do envolvimento cutâneo.¹

Suas principais características são deposição excessiva de colágeno, lesões vasculares e alterações da imunidade celular e humoral.²

Existem evidências de que certos quadros genéticos favorecem a progressão da inflamação crônica para o processo fibrótico. A participação do sistema imune é sugerida pela presença de células mononucleares infiltradas em lesões, anormalidades nas células T auxiliares e na função dos monócitos,³ liberação de várias citocinas e redução da atividade das células natural killer (NK).⁴

As células NK apresentam receptores, denominados killer immunoglobulin-like receptor (KIR), que são representantes da família das imunoglobulinas presentes na superfície celular. Esses receptores estão divididos em grupos funcionais inibitórios (evitam a lise da célula-alvo) e ativadores (causam a lise da célula-alvo).⁵ O receptor inibidor reconhece o HLA de classe I específico, prevenindo o ataque das células NK contra células normais; em contrapartida, o receptor ativador é acionado quando os receptores KIR inibidores não reconhecem a célula-alvo, acionando as células NK para a destruição.⁶ A capacidade de atacar as próprias células que não possuem expressão do HLA-I é conhecida como missing self-recognition. Essa hipótese tem sido amparada por diversas constatações independentes, demonstrando que os antígenos HLA realmente protegem as células da lise por células NK fornecendo sinais negativos que inibem a função das células NK.⁷

Teoricamente, qualquer combinação ligante inibitória KIR-HLA deve ser capaz de neutralizar a ativação. A função das células NK é regulada por sinais positivos e negativos transmitidos por meio de pares de receptores ativadores e inibitórios. In vivo, as células NK estão sob o domínio de receptores inibitórios para os ligantes HLA-I próprios.⁸ Assim, as funções efetoras ocorrem apenas quando os sinais de ativação são capazes de superar a inibição da sinalização. Esta é obtida pelo predomínio de ativação das interações receptor-ligante ou pela falta de ligante inibitório do receptor.⁹

Um novo modelo foi proposto recentemente por Nelson et al.¹⁰ e prevê que, dependendo do genótipo, um determinado indivíduo poderia ser enquadrado em um de três grupos, de acordo com as características da atividade de suas células NK: 1) predominantemente sob o controle de receptores inibitórios (maior inibição); 2) controlada equitativamente por receptores inibitórios e ativadores (relativamente neutro); ou 3) predominantemente sob o controle de receptores ativadores (maior ativação). De modo semelhante, indivíduos que estão deficientes em ligantes para receptores inibidores (como é o caso entre homozigotos para HLA-Cw do grupo 1 ou 2) terão menos células NK sob o controle inibitório que indivíduos com todos os ligantes presentes.

Até o momento, apenas dois trabalhos avaliaram a atividade das células NK por esse modelo - um em diabetes¹¹ e o outro em psoríase.¹² Devido à escassez de estudos sobre o assunto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade das células NK em um grupo de pacientes com ES comparando-o com um grupo-controle.

PACIENTES E MÉTODOS

Todos os participantes receberam a explicação sobre o teor da pesquisa e, de forma livre e voluntária, assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, sem que sua decisão comprometesse a relação entre médico e paciente. O estudo, em todos os seus princípios e metodologias, obteve a aprovação do Comitê de Ética do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).

Pacientes

Foram incluídos neste estudo 110 pacientes com ES provenientes do Ambulatório de Reumatologia do Serviço de Reumatologia do HCPA. Todos estavam diagnosticados de acordo com os critérios do American College of Rheumatology 1987,¹³ ou pelos critérios de LeRoy e Medsger¹⁴ para formas precoces de ES. Pacientes com síndromes de superposição com outras doenças difusas do tecido conjuntivo (exceto síndrome de Sjögren) foram excluídos do estudo.

Controles

Como grupo-controle foram analisados 115 indivíduos não aparentados registrados voluntariamente para serem possíveis doadores de medula óssea (REDOME), provenientes do Serviço de Imunologia do HCPA. Foram excluídos da amostra indivíduos com doenças crônicas e agudas, assim como os que apresentavam história familiar de doenças genéticas (doenças ligadas ao cromossomo X, doenças autossômicas ou anormalidades cromossômicas).

Estudo imunogenético

As amostras de DNA foram extraídas pelo método de salting out¹⁵ e amplificadas pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). A sequência dos primers para a reação de PCR foi a descrita por Gómez-Lozano et al.16

Para a amplificação do DNA utilizou-se uma mistura com 1 µL de Buffer 10x, MgCl₂ 50 nM, dNTP's 25 mM, 0,5 U taq polimerase, 10 ηg de DNA, 100 nm de controle interno e 500 mM de primer específico. A temperatura inicial para a amplificação foi de 94ºC durante 3 minutos. Depois, houve 4 ciclos com 15 s a 94ºC, 15 s a 65ºC e 30 s a 72ºC. Em seguida, 21 ciclos com 15 s a 94ºC, 15 s a 60ºC e 30 s a 72ºC. Para finalizar, 5 ciclos com 15 s a 94ºC, 60 s a 55ºC e 120 s a 72ºC. O produto ficou mais 420 s a 72ºC.

O produto do PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1% (p/v) em tampão tris-acetato-EDTA (TAE), e a corrida eletroforética ocorreu em 20 min a 200 V, em temperatura ambiente. As bandas foram visualizadas e fotografadas em luz UV por coloração do brometo de etídio.

Análise estatística

Aplicou-se o modelo que prevê a atividade das células NK, fundamentado da seguinte forma: a) KIR2DS1 e/ou KIR2DS2 com HLA-Cw homozigoto para grupo 1 ou 2 (combinação de suscetibilidade - excesso de ativação); b) KIR2DS1 e/ou KIR2DS2 com grupo HLA-Cw heterozigoto; c) falta de KIR2DS1 ou KIR2DS2 com grupo HLA-Cw homozigoto (combinação relativamente neutra - equilíbrio, balance); e d) falta de KIR2DS1 ou KIR2DS2 com grupo HLA-Cw heterozigotos (combinação de proteção - excesso de inibição). Os resultados foram avaliados pelo teste de qui-quadrado de Pearson, pelo programa SPSS 16.0. Considerou-se estatisticamente signifi cativo um valor de P < 0,05.

RESULTADOS

O perfil genético dos pacientes pode ser observado na Tabela 1. Como podemos observar, a presença de todos os genes KIR tende a apresentar um fator de proteção ao desenvolvimento da ES. Verifi camos que 1,77% dos pacientes com ES apresentam esse perfi l genético, comparado a 13,9% do grupo-controle com esse mesmo perfi l (P < 0,001). Os outros perfis genéticos não apresentaram diferença significativa.

A ativação da célula NK pode ser previsível pela possível combinação da ativação ou inibição de receptores com a molécula HLA-C. Essa previsão indica que, dependendo do genótipo, um indivíduo pode ter mais células NK com excesso de ativação, equilíbrio ou excesso de inibição. Em nosso estudo, constatamos que os pacientes com ES apresentam excesso de ativação, quando comparados ao grupo-controle (Tabela 2). Dos 110 pacientes com ES, 34 (29,6%) tiveram excesso de ativação, comparado a 22 (19,1%) dos 115 indivíduos sadios. Ao analisar o excesso de inibição em cada grupo, conferimos que o grupo-controle apresentou maior frequência desse perfil.

Estudos anteriores evidenciaram que a presença do gene inibidor KIR2DL2 em pacientes pode estar relacionada a um fator de proteção para desenvolver a ES. Para testar essa hipótese, estratificamos os pacientes de acordo com presença e ausência desse gene (Tabela 3). Ao considerar somente pacientes com 2DL2 positivo, identificamos que o grupo-controle apresenta excesso de inibição (34,7%) em relação aos pacientes com a doença (10,9%), com uma diferença estatisticamente significativa (< 0,001). Quando analisamos o estado das células em equilíbrio ou o excesso de ativação na presença do gene 2DL2, não encontramos diferença estatística significativa. Os pacientes com ES apresentam 10,2% em excesso de ativação e 10% em equilíbrio, similar aos controles, que apresentam 16,5% e 11,3%, respectivamente. Avaliando pacientes com ausência do gene KIR2DL2, encontramos resultados diversos. A frequência de excesso de inibição nos pacientes (29,1%) é semelhante à do grupo-controle (26,1%). Por conseguinte, o estado da célula em excesso de ativação e equilíbrio apresenta frequência menor em indivíduos sadios (2,6% e 6,1%, respectivamente) em comparação com pacientes com ES (20,9% e 20,9%, respectivamente).

DISCUSSÃO

A ES é uma doença multifatorial complexa. A hipótese mais aceita sobre a patogênese da ES é que a ativação do sistema imune é desencadeada pela interação entre fatores ambientais e predisposição genética.17 Alguns fatores genéticos podem influenciar a suscetibilidade para desenvolvê-la. A história familiar representa o maior fator de risco identificado; no entanto, o risco absoluto para cada membro da família é baixo (< 1%). O risco relativo em parentes de primeiro grau é de 10 a 16, e entre gêmeos monozigóticos é de 10 a 27.18 Muitos estudos sugerem que a suscetibilidade genética sozinha não é suficiente para induzir a doença.

Em nosso estudo, observamos que 9,73% dos pacientes com ES apresentam o ativador 2DS2 e o inibidor 2DL2, com ausência dos ativadores 2DS1, 2DS3 e 3DS1, comparado a 13,9% do grupo-controle, podendo existir uma proteção também nesse perfil. Ao analisar o perfil de pacientes com ausência do inibidor 2DL2 e dos ativadores 2DS1, 2DS2 e 2DS3, encontramos esse perfil somente em pacientes com ES (9,73%). Inversamente, o perfil com presença do inibidor 2DL2 e ausência dos ativadores só foi encontrado no grupo-controle (6,1%), assim como a presença de todos os genes (incluindo o ativador 2DS2 e o inibidor 2DL2) foi encontrada em maior frequência no grupo-controle, comparado ao grupo de pacientes. Esses dados mostram a importância do inibidor 2DL2 no desenvolvimento da ES, e vão ao encontro de um estudo anterior, que mostrou aumento da frequência do ativador KIR2DS2 na ausência do inibidor KIR2DL2 em pacientes com ES.¹⁹ Recentemente, usando dados dos mesmos pacientes envolvidos no presente estudo, relatamos um efeito protetor do gene inibidor 2DL2 no desenvolvimento da ES.²⁰ Essa combinação de genes KIR também tem sido observada na patogênese de outras doenças reumáticas. Na artrite reumatoide, a presença de KIR2DS2 foi relacionada à vasculite;²¹ na artrite psoriásica, observou-se associação de KIR2DS2 na ausência de ligantes de KIR2DL2 com maior risco de desenvolvimento da doença.¹¹ Também há evidências que sugerem o envolvimento da combinação KIR2DS2+/KIR2DL2- na patogênese da síndrome de Sjögren.²²

Estudos recentes sugerem que os genes HLA-I podem ter um papel na suscetibilidade e na expressão em doenças autoimunes como artrite reumatoide, espondilite anquilosante e lúpus eritematoso sistêmico, por meio da interação com receptores KIR. Com base no raciocínio de que um KIR ativador, como o KIR2DS2, pode favorecer o desenvolvimento de ES se o ligante para qualquer KIR2DL1 ou KIR2DL2/3 estiver em falta (ou seja, homozigotos para um grupo de ligantes HLA-Cw), empregou-se o novo modelo proposto por Nelson et al.,¹⁰ que se encaixa adequadamente em nossa compreensão da expressão e da função do KIR, e que apresenta um suporte estatístico mais robusto para o papel do KIR na suscetibilidade à ES que o modelo anterior.

Estudos prévios associando os genes KIR na ES evidenciaram importantes resultados referentes à suscetibilidade à doença. Porém, nenhum deles avaliou o perfil de ação das células NK em pacientes e controles - foram avaliados apenas os genes isoladamente. Nosso estudo mostrou que os indivíduos sadios apresentam excesso de inibição quando comparados a pacientes com ES (P < 0,001), o que corrobora um estudo realizado em pacientes com diabetes,²³ em que se encontrou excesso de inibição em controles (25,71%) quando comparados a pacientes (1,02%). Entretanto, em outro estudo, ao analisar tal modelo em pacientes com psoríase, não se encontrou diferença estatística entre pacientes e controles (P = 0,822).¹²

Quando estratificamos os pacientes pelo gene que estava associado à ES (KIR2DL2), encontramos excesso de inibição nos controles com presença do KIR2DL2 (P < 0,001). Quando esse gene estava ausente, houve prevalência de excesso de ativação (P < 0,001) e de equilíbrio (P = 0,001) nos pacientes com ES, sugerindo papel importante desse gene no desenvolvimento da doença. Essas observações corroboram ainda mais a hipótese de uma proteção dominante conferida por alguns genes KIR inibitórios.

CONCLUSÃO

O desequilíbrio entre o número de KIR ativador/inibidor parece ser importante para a suscetibilidade e a proteção contra a doença. Se modelos perspicazes são utilizados na análise de dados, a interação entre os genes KIR/HLA-C pode indicar o papel das células NK na patologia da doença. Níveis adicionais de variações, como polimorfi smos alélicos, precisam ser investigados, assim como são necessários novos estudos de associação de genes KIR com outras desordens autoimunes. Os resultados sugerem que as experiências com a função das células NK podem ser mais informativas.

Recebido em 20/12/2011.

Aprovado, após revisão, em 13/12/2012.

Os autores declaram a inexistência de conflito de interesse.

Suporte Financeiro: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Ensino Superior (Capes), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundo de Incentivo a Pesquisa e Eventos do HCPA (Fipe-HCPA).

Comitê de Ética: 05-549.

Serviço de Reumatologia e Serviço de Imunologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande do Sul - HCPA, UFRGS.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Abr 2013
• Data do Fascículo
  Fev 2013

Histórico

• Recebido
  20 Dez 2011
• Aceito
  13 Dez 2012