Expressão de antígenos MHC classe I e de células CD4 e CD8 na polimiosite e dermatomiosite

Resumos

Objetivo:

Analisar as frequências de expressão dos antígenos de complexo principal de histocompatibilidade classe I (MHC-I) e células CD4 e CD8 no músculo esquelético na polimiosite (PM) e dermatomiosite (DM).

Métodos:

Estudo retrospectivo de 34 casos de PM, oito casos de DM e 29 controles com miopatias não inflamatórias.

Resultados:

Os antígenos MHC-I expressaram-se no sarcolema e/ou sarcoplasma em 79,4% dos casos de PM, 62,5% dos casos de DM e 27,6% dos controles (a expressão de CD4 foi observada em 76,5%, 75% e 13,8%, respectivamente). Quando os antígenos de MHC-I foram coexpressados com CD4, houve elevada suspeita de PM/DM (principalmente PM). Em 14,3% dos casos de PM/DM, observou-se a expressão isolada dos antígenos MHC-I, sem células inflamatórias.

Conclusão:

A expressão dos antígenos MHC-I e a positividade do CD4 podem aumentar a suspeita diagnóstica de PM/DM. Não foi observado infiltrado celular em 14,3% dos casos.

Patologia muscular; Imuno-histoquímica muscular; Biópsia muscular; Antígenos de complexo principal de histocompatibilidade classe I (MHC-I); Miopatias inflamatórias

Objective:

To analyze the frequencies of the expression of major histocompatibility complex class I (MHC-I) antigens, and CD4 and CD8 cells in skeletal muscle in polymyositis (PM) and dermatomyositis (DM).

Methods:

This was a retrospective study of 34 PM cases, 8 DM cases, and 29 control patients with non-inflammatory myopathies.

Results:

MHC-I antigens were expressed in the sarcolemma and/or sarcoplasm in 79.4% of PM cases, 62.5% of DM cases, and 27.6% of controls (CD4 expression was observed in 76.5%, 75%, and 13.8%, respectively). There was a high suspicion of PM/DM (mainly PM) in participants in whom MHC-I antigens and CD4 were co-expressed. In 14.3% of PM/DM cases, we observed MHC-I antigens expression alone, without inflammatory cells.

Conclusion:

MHC-I antigens expression and CD4 positivity might add to strong diagnostic suspicion of PM/DM. No cellular infiltration was observed in approximately 14.3% of such cases.

Muscle pathology; Muscle immunohistochemistry; Muscle biopsy; Major histocompatibility complex class I antigens (MHC-I); Inflammatory myopathies

Introdução

As miopatias inflamatórias (MI) constituem um grupo heterogêneo de doenças autoimunes caracterizadas clinicamente por fraqueza e inflamação do músculo esquelético. O diagnóstico preciso é fundamental, pois as MI são potencialmente tratáveis. Com base nas características clínicas e histopatológicas, são definidos três subgrupos principais de MI: polimiosite (PM), dermatomiosite (DM) e miosite por corpos de inclusão (MCI). O diagnóstico dessas doenças é baseado em exames clínicos e laboratoriais, particularmente os níveis de creatinoquinase, eletromiografia e os achados do exame patológico dos músculos feito por meio de biópsia.^1-3 As características patológicas marcantes para o diagnóstico correto são necrose da fibra muscular (geralmente em áreas isoladas) e a presença de células inflamatórias no perimísio e no endomísio e também algumas vezes em regiões perivasculares. Achado típico é a invasão linfocítica em fibras não necróticas, que logo substituída por macrófagos e células T e então se torna necrótica.⁴ A atrofia perifascicular é específica e característica da DM, assim como os vacúolos rimmed são para a MCI.⁴ É bem reconhecido que a ausência de infiltrados inflamatórios não exclui MI. Nesses casos, a presença de antígenos do complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC-I) no sarcolema e/ou sarcoplasma pode contribuir para o diagnóstico em casos suspeitos de MI, embora não seja específico.

No caso das fibras musculares normais, os antígenos MHC-I são detectados apenas nos vasos sanguíneos e podem ser facilmente vistos nos capilares do endomísio. Em contraste, na MI, a expressão dos antígenos MHC-I é observada no sarcolema e também internamente (sarcoplasma) em várias fibras.^5,6 A indução e a expressão dos antígenos MHC-I ocorrem precocemente, com frequência antes dos infiltrados inflamatórios, e continua durante toda a evolução da doença crônica, mesmo com o uso de imunossupressores e depois de aparente remissão clínica.^1,7-10 As fibras musculares em regeneração e/ou imaturas expressam antígenos MHC-I no sarcolema independentemente da presença de doença;¹¹ por causa disso, é importante distinguir esse achado normal de outro anormal e aplicar a técnica imuno-histoquímica para miosina neonatal,⁴ marcador de imaturidade. A expressão do MHC-I no sarcolema e/ou sarcoplasma das fibras musculares maduras é anormal e representa uma ferramenta útil para o diagnóstico de MI, particularmente na ausência de infiltrados inflamatórios, necrose da fibra muscular, vacúolos rimmed ou atrofia perifascicular.

Este estudo visa a enfatizar a importância da análise rotineira dos antígenos MHC-I juntamente com a expressão de subtipos de células T nas técnicas de biópsia muscular quando houver suspeita de MI. Embora o achado patológico característico da MI seja infiltrado inflamatório (como salientado anteriormente), algumas vezes ele pode estar ausente.

Material e métodos

Pacientes

Foram estudados 71 pacientes atendidos no Hospital de Base da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (Famerp), entre junho de 2005 e junho de 2013. Eles foram encaminhados para biópsia muscular por médicos de várias especialidades, particularmente neurologia e reumatologia.

Foram constituídos dois grupos de pacientes para a avaliação. O grupo 1 foi composto por 42 pacientes com quadro clínico e patológico característicos de miopatia inflamatória, PM ou DM: presença de necrose muscular, infiltrado inflamatório no endomísio e/ou perivascular (fig. 1A e B), invasão de fibras musculares não necróticas e/ou atrofia perifascicular. O grupo 2 foi formado por 29 pacientes encaminhados para biópsia muscular por suspeita de outras miopatias não inflamatórias e cujo resultado foi normal ou com presença de anormalidades miopáticas discretas e não específicas.

Figura 1
Biópsia muscular de paciente com miopatia inflamatória. (A) Necrose da fibra muscular e infiltrado inflamatório endomisial (hematoxilina & eosina). (B) Aumento da atividade lisossomal (fosfatase ácida).

Biópsia muscular

Todas as biópsias foram feitas por médico especializado em doenças neuromusculares no músculo Deltoideus por meio de técnica aberta, sob anestesia local. A amostra do músculo foi enviada ao Laboratório de Investigação Neuromuscular em estado fresco, sem fixadores ou aditivos, imediatamente congelada em nitrogênio líquido a –176 °C e armazenada até o processamento. As espécimes musculares congeladas foram cortadas no criostato na temperatura de –30 °C em seções de 5 µm de espessura. O tecido cortado foi montado em lâminas de vidro revestidas com polilisina. A distribuição dos antígenos MHC-I foi analisada com o uso de anticorpo monoclonal pela técnica de imunoperoxidase. A marcação dos anticorpos a serem visualizados sob microscopia óptica foi feita com um sistema de detecção de polímero (NovoLink Max Polymer Detection System, Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle upon-Tyne, England), de acordo com as instruções do fabricante. Os anticorpos usados foram: anti-MHC-I (Rhea Biotech, Campinas, Brasil), anti-CD8 (anticorpo monoclonal de camundongo, clone 1A5, isotipo IgG1) e anti-CD4 (anticorpo monoclonal de camundongo, clone 4B12, isotipo IgG1). Os anticorpos CD4 e CD8 eram da DakoCytomation Denmark A/S, Dinamarca.

Análise estatística

Foi usado teste de qui-quadrado para a comparação de duas proporções, expresso como percentagem. Os valores de p < 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.

Ética

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Famerp.

Resultados

O grupo 1 incluiu 42 pacientes (PM ou DM): 28 do sexo feminino (66,7%) e 14 do masculino (33,3%), com média de 44,7 ± 19,9 anos (variação de seis a 80). Desses 42 casos, 34 (80,1%) eram pacientes com PM, 22 mulheres (64,7%) e 12 homens (35,3%); média de 49,3 ± 17,7 anos (variação de oito a 80). Os outros oito casos (19,9%) eram DM, seis mulheres (75%) e dois homens (25%); a média era de 25,3 ± 17,4 anos (variação de seis a 51). O grupo 2 incluiu 29 pacientes: 17 mulheres (58,6%) e 12 homens (41,4%), com média de 34,2 ± 21,9 anos (variação de um a 71).

A frequência de expressão dos antígenos MHC-I nas fibras musculares é mostrada em detalhes na tabela. A figura 2A-C mostra sua expressão no sarcolema ou sarcoplasma, assim como ausência de expressão. A expressão dos antígenos MHC-I foi observada tanto no sarcoplasma quanto no sarcolema em 79,4% dos pacientes com PM, 62,5% dos com DM e 27,6% dos controles. Não foi observada expressão dos antígenos MHC-I no sarcolema nem no sarcoplasma em 20,6% dos pacientes com PM, 37,5% dos com DM e 72,4% dos controles.

Figura 2
Expressão de antígenos MHC-I nas fibras musculares: (A) negativo; (B) sarcolema; (C) sarcolema e sarcoplasma.

As frequências de positividade de anticorpos para CD4 e CD8 estão detalhadas na tabela 1. A figura 3A-C mostra a expressão de CD4/CD8 principalmente no endomísio. A maior parte dos casos de PM (76,5%) revelou positividade na expressão de CD4; em 23,5% havia negatividade para expressão de ambos, CD4 e CD8. De modo semelhante, 75% dos casos de DM revelaram positividade para expressão de CD4; em 25% havia negatividade para expressão de ambos, CD4 e CD8. A expressão de CD4 ou CD8 foi observada em 24,1% dos pacientes controle; em 75,9% havia negatividade para expressão de CD4 e CD8; já a positividade de ambos, CD4 e CD8, não foi observada.

Tabela 1
Expressão de antígenos MHC-I (sarcolema e sarcoplasma), CD4 e CD8 em biópsias musculares de pacientes com polimiosite (PM), dermatomiosite (DM) e controles (C)

	PM	DM	Controles	p	p
N	34	8	29	PM/C	DM/C
Idade	49,3 ± 19,9	25,3 ± 17,4	34,2 ± 21,9
Masculino	35,3% (12)	25% (2)	41,4% (12)
Feminino	64,7% (22)	75% (6)	58,6% (17)
MHC-I (+) sarcolema	47,1% (25)	62,5% (5)	24,1% (7)	0,1037	0,1035
MHC-I (+) sarcoplasma	73,5% (16)	50,0% (4)	13,8% (4)	< 0,0001	0,0860
MHC-I (+) ambos	41,2% (14)	50,0% (4)	10,3% (3)	0,0135	0,0424
MHC-I (+) um ou outro	79,4% (27)	62,5% (5)	27,6% (8)	0,0001	0,1579
MHC-I (–) ambos	20,6% (7)	37,5% (3)	72,4% (21)	0,0001	0,1579
CD8 (+)	38,2% (13)	12,5% (1)	10,3% (3)	0,0247	0,6410
CD4 (+)	76,5% (26)	75,0% (6)	13,8% (4)	< 0,0001	0,0027
CD4 e CD8 (+)	38,2% (13)	12,5% (1)	nenhum (0)	0,0006	0,4846
CD4 e/ou CD8 (+)	76,5% (26)	75,0% (6)	24,1% (7)	0,0001	0,0243
CD4 e CD8 (–)	23,5% (8)	25,0% (2)	75,9% (22)	0,0001	0,0243
MHC-I (um ou outro) e CD4 (+)	88,2% (30)	50,0% (4)	3,5% (1)	< 0,0001	0,0048
MHC-I (um ou outro) e CD8 (+)	35,3% (12)	12,5% (1)	nenhum (0)	0,0012	0,4846

• p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Figura 3
Expressão de CD4 e CD8: (A) CD4-positivo; (B) CD4-negativo; (C) CD8-positivo; (D) CD8-negativo.

A expressão dos antígenos MHC-I no sarcoplasma ou sarcolema foi observada em conjunto com positividade para CD4 em 88,2% dos pacientes com PM, 50% dos com DM e 3,5% dos do grupo controle. Em comparação, a expressão dos antígenos MHC-I no sarcoplasma ou sarcolema foi observada em conjunto com a positividade para CD8 em 35,3% dos casos de PM, 12,5% dos de DM e 0% dos do controle.

Em cinco casos de PM (14,7%) e em um caso de DM (12,5%) os antígenos MHC-I foram marcados no sarcolema ou no sarcoplasma na ausência de expressão para CD4 e CD8.

Discussão

Este estudo demonstrou que a expressão de antígenos MHC-I no sarcolema ou sarcoplasma ocorreu mais frequentemente em pacientes com PM/DM do que nos controles, embora apenas a diferença entre os controles e os pacientes com PM tenha sido estatisticamente significativa. De modo geral, os antígenos MHC-I estavam expressos em 79,4% dos pacientes com PM/DM. Segundo a literatura, a sensibilidade do teste para o diagnóstico de MI é de 78%, semelhantemente à encontrada neste estudo (79,4%).¹² Quando se considerou apenas a expressão dos antígenos MHC-I no sarcolema, não houve diferença estatisticamente significativa entre os controles e os pacientes com PM ou DM. Quando se considera apenas a expressão dos antígenos MHC-I no sarcoplasma, a diferença foi significativa apenas entre os pacientes controle versus PM. Os antígenos MHC-I não estavam expressos no sarcolema nem no sarcoplasma na maior parte dos controles, o que diferiu significativamente apenas nos casos de PM. De acordo com Karpati et al.,¹¹ na PM, a maior parte das fibras musculares apresenta uma expressão forte dos antígenos MHC-I no sarcolema; na DM, as fibras musculares perifasciculares ou em regiões distribuídas ao acaso também revelaram forte expressão.

No geral, 76,2% dos pacientes com PM/DM revelaram positividade na expressão de CD4 e/ou CD8. A positividade das células inflamatórias (CD4) foi maior no caso dos indivíduos com PM/DM versus controles, com diferença significativa para ambos. A positividade para CD8 foi menos pronunciada, mas ainda significativa para os casos de PM, embora não para os casos de DM. O percentual de negatividade dos controles para CD4 e CD8 foi significativo quando comparado tanto com a PM quanto com a DM. Nenhum controle revelou positividade para CD4 e CD8, o que representou um achado notável.

A expressão dos antígenos MHC-I o sarcolema ou sarcoplasma em combinação com a positividade para CD4 foi o achado mais comum na PM em relação aos controles e mais útil para o diagnóstico. Já para o diagnóstico de DM ele foi menos comum, embora ainda útil na ausência de outros achados típicos. Também vale a pena ressaltar que não foram observados casos de associação entre a expressão dos antígenos MHC-I (no sarcolema ou sarcoplasma) e a expressão do CD8 no grupo controle. Esse achado provavelmente representa uma ferramenta muito útil para descartar PM/DM.

Não foi observado infiltrado inflamatório em cinco casos de PM e um de DM, embora os antígenos MHC-I estivessem expressos no sarcolema ou no sarcoplasma. Esse achado mostra que aproximadamente 15% dos casos de PM/DM podem não ser diagnosticados com base apenas no infiltrado inflamatório, o que corrobora a afirmação de Dalakas¹ de que a expressão dos antígenos MHC-I é um marcador útil para confirmar o diagnóstico de MI, mesmo quando não existam células inflamatórias na biópsia do músculo.

De acordo com os resultados obtidos da biópsia muscular por Van der Pas et al.,¹³ a expressão dos antígenos MHC-I foi observada em 67% dos pacientes com DM e em 61% dos com PM. Nos casos de DM, a análise imuno-histoquímica revelou expressão significativamente maior dos antígenos MHC-I no tipo juvenil (96,4%) do que no tipo adulto (50%).¹² A expressão dos antígenos MHC-I foi observada em 11% das biópsias de pacientes com distrofia muscular e em 4% das biópsias de pacientes com doenças neuromusculares variadas, totalizando 15% (menor do que a expressão de 27,6% encontrada neste estudo).

A maior parte das fibras musculares invadidas por células T, CD4 e/ou CD8, expressa os antígenos MHC-I em sua superfície.⁷ No entanto, como citado anteriormente, em alguns casos foi observada expressão dos antígenos MHC-I sem invasão por células mononucleares. Nyberg et al.¹⁴ também enfatizaram a importância da expressão dos antígenos MHC-I na PM ou DM crônica inativa com fraqueza muscular persistente na ausência tanto de infiltrados inflamatórios quanto de sinais de inflamação na ressonância magnética. Além disso, a expressão dos antígenos MHC-I não é modificada pelo tratamento prévio com fármacos imunossupressores, embora Van der Pas et al.¹³ tenham relatado diminuição da sensibilidade para o teste dos antígenos MHC-I depois de quatro semanas de terapia imunossupressora.

Deve-se enfatizar que os antígenos MHC-I também podem ser expressos nas distrofias musculares, principalmente na deficiência de disferlina, que se manifesta clinicamente como uma distrofia das cinturas dos membros ou miopatia distal. ¹⁵ Nesses casos, foi observado aumento da resposta inflamatória, em conjunto com o padrão distrófico ativo. Os infiltrados celulares sugerem que a reação inflamatória é secundária à necrose. Os antígenos MHC-I foram superexpressos principalmente em associação com a fagocitose e a regeneração das fibras.^15,16 Nas disferlinopatias, os linfócitos CD8 são raros e os linfócitos T invadem fibras musculares apenas ocasionalmente, enquanto ambos são achados comuns na PM.¹⁷ A disferlinopatia deve ser considerada no diagnóstico diferencial de MI que não responde aos esteroides.

Conclusão

A presença de expressão de antígenos MHC-I e subtipos de células T pode ser útil na diferenciação de miopatias inflamatórias de outras não inflamatórias, muitas vezes um desafio clínico. Os antígenos MHC-I foram mais frequentemente expressos na PM; células foram mais positivas para CD4 na PM e na DM; os antígenos MHC-I foram expressos sem células inflamatórias em 14,6% dos casos de PM/DM; existe forte suspeita de PM/DM (principalmente PM) quando os antígenos MHC-I são expressos em combinação com positividade para CD4; e há uma alta probabilidade de excluir tanto a PM quanto a DM na ausência de expressão de antígenos MHC-I e CD4.

• Financiamento
  Bolsa de Auxílio à Pesquisa, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil.

REFERÊNCIAS

• ¹
  Dalakas MC. Muscle biopsy findings in inflammatory myopathies. Rheum Dis Clin N Am. 2002;28:779–98.
• ²
  Chinoy H, Lamb JA, Ollier WER, Cooper RG. Recent advances in the immunogenetics of idiopathic inflammatory myopathy. Arthritis Research & Therapy. 2011;13(3):216.
• ³
  Salaroli R, Baldin E, Papa V, Rinaldi R, Tarantino L, De Giorgi LB, et al. Validity of internal expression of the major histocompatibility complex class I in the diagnosis of inflammatory myopathies. J Clin Pathol. 2012;65:14–9.
• ⁴
  Dubowitz V, Sewry CA. Muscle biopsy. In: A practical approach. 3^rd ed. Philadelphia: Saunders Elsevier; 2007.
• ⁵
  Appleyard ST, Dunn MJ, Dubowitz V, Rose ML. Increased expression of HLA ABC class I antigens by muscle fibres in duchenne muscular dystrophy, inflammatory myopathy, and other neuromuscular disorders. Lancet. 1985;1(8425):361–3.
• ⁶
  McDouall RM, Dunn MJ, Dubowitz V. Expression of class I and class II MHC antigens in neuromuscular diseases. J Neurol Sci. 1989;89:213–26.
• ⁷
  Emslie-Smith AM, Arahata K, Engel AG. Major histocompatibility complex class I antigen expression, immunolocalization of interferon subtypes, and T cell-mediated cytotoxicity in myopathies. Hum Pathol. 1989;20:224–31.
• ⁸
  Choi JH, Park YE, Kim SI, Kim JI, Lee CH, Park KH, Kim DS. Differential immunohistological features of inflammatory myopathies and dysferlinopathy. J Korean Med Sci. 2009;24:1015–23.
• ⁹
  Singh P, Kohr D, Kaps M, Blaes F. Skeletal muscle cell MHC I expression: implications for statin-induced myopathy. Muscle Nerve. 2010;41:179–84.
• ¹⁰
  Vincze M, Danko K. Idiopathic inflammatory myopathies. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2012;26:25–45.
• ¹¹
  Karpati G, Pouliot Y, Carpenter S. Expression ofimmunoreactive major histocompatibility complex productsin human skeletal muscles. Annals of Neurology.1988;23:64–72.
• ¹²
  Shinjo SK, Sallum AM, Silva CA, Marie SK. Skeletal muscle major histocompatibility complex class I and II expression differences in adult and juvenile dermatomyositis. Clinics (Sao Paulo). 2012;67(8):885–90.13
• ¹³
  Van der Pas J, Hengstman GJD, Ter Laak HJ, Borm GF, Van Engelen BGM. Diagnostic value of MHC class I staining in idiopathic inflammatory myopathies. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2004;75:136–9.
• ¹⁴
  Nyberg P, Wikman A, Nennesmo I, Lundberg I. Increasedexpression of interleukin 1 a and MHC class I in muscle tissueof patients with chronic, inactive polymyositis anddermatomyositis. J Rheumatol. 2000;27:940–8.
• ¹⁵
  Fanin M, Angelini C. Muscle pathology in dysferlin deficiency. Neuropathology and Applied Neurobiology. 2002;28:461–70.
• ¹⁶
  Dalakas MC. Inflammatory disorders of muscle: progress inpolymyositis, dermatomyositis and inclusion body myositis. Current Opinion in Neurology. 2004;17:561–7.
• ¹⁷
  Confalonieri P, Oliva L, Andreetta T, Lorenzoni R, Dassi P, Mariani E, et al. Muscle inflammation and MHC class 1 upregulation in muscular dystrophy with lack of dysferlin: an immunopathological study. Journal of Neuroimmunology. 2003;142:130–6.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  May-Jun 2015

Histórico

• Recebido
  03 Jun 2014
• Aceito
  06 Out 2014