Infecção sistêmica e localizada por Candida spp. em pacientes reumatológicos em terapia anti-TNF

RESUMO

Objetivo:

Avaliar a prevalência de infecção sistêmica e localizada por Candida spp. e sua possível associação com dados demográficos, manifestações clínicas e laboratoriais e terapêutica em pacientes com doenças reumatológicas em uso de anti-TNF.

Métodos:

Foram incluídos pacientes consecutivos com doenças reumatológicas em uso de agentes anti-TNF. Foram analisados os seguintes fatores de risco até quatro semanas antes do estudo: uso de antibioticoterapia, imunossupressores, hospitalização e procedimentos invasivos. Todos foram avaliados para queixas clinicas, coletaram hemocultura específica para fungos e amostras de sangue para pesquisa de Candida spp. por reação em cadeia de polimerase.

Resultados:

Foram incluídos 194 pacientes [67 com artrite reumatoide (AR), 47 espondilite anquilosante (EA), 36 artrite idiopática juvenil (AIJ), 28 artrite psoriásica e 16 outros]. A média de idade era de 42 ± 16 anos, com 68 (35%) do sexo masculino e média de duração de doença de 15 ± 10 anos; 64 (33%) pacientes usavam adalimumabe, 59 (36%) etanercepte e 71 (36%) infliximabe; 81% faziam uso concomitante de imunossupressores. No momento do estudo, apenas um (0,5%) paciente apresentou infecção fúngica localizada (candidíase vaginal). Nenhum dos pacientes incluídos apresentou candidíase sistêmica com hemocultura positiva para fungos ou PCR positiva para Candida spp. em amostra de sangue periférico.

Conclusões:

Este foi o primeiro estudo que avaliou prevalência de doença fúngica invasiva e localizada por Candida em um expressivo número de pacientes reumatológicos em terapia anti-TNF e demonstrou baixo risco de candidíase, apesar da alta prevalência de uso de imunossupressores.

Palavras-chave:
Candidíase sistêmica; Candida spp.; Anti-TNF; Artrite reumatoide; Espondilite anquilosante

ABSTRACT

Objective:

To evaluate the prevalence of systemic and localized infection by Candida species and its possible association with demographic, clinical and laboratory manifestations and therapy in patients with rheumatic diseases taking TNF blockers.

Methods:

Consecutive patients with rheumatic diseases receiving anti-TNF agents were included. The following risk factors up to four weeks prior to the study were analyzed: use of antibiotics, immunosuppressant drugs, hospitalization and invasive procedures. All subjects were evaluated for clinical complaints; specific blood cultures were obtained for fungi and blood samples were collected for Candida spp. detection by polymerase chain reaction.

Results:

194 patients [67 with rheumatoid arthritis (RA), 47 with ankylosing spondylitis (AS), 36 with juvenile idiopathic arthritis (JIA), 28 with psoriatic arthritis and 16 with other conditions] were included. The average age of patients was 42 ± 16 years, with 68 (35%) male and mean disease duration of 15 ± 10 years. Sixty-four (33%) patients were receiving adalimumab, 59 (30%) etanercept and 71 (36%) infliximab. Eighty-one percent of patients were concomitantly taking immunosuppressant drugs. At the time of the study, only one (0.5%) patient had localized fungal infection (vaginal candidiasis). None of the patients included had systemic candidiasis with positive blood cultures for fungi or PCR positive for Candida spp. in peripheral blood sample.

Conclusions:

This was the first study to assess the prevalence of invasive and localized fungal disease by Candida in a significant number of patients with rheumatic diseases on anti-TNF therapy, and demonstrated low risk of candidiasis, despite the high prevalence of immunosuppressive drug use.

Keywords:
Systemic candidiasis; Candida spp.; Anti-TNF; Rheumatoid arthritis; Ankylosing spondylitis

Introdução

A terapia anti-TNF tem sido amplamente empregada em pacientes com doenças reumatológicas não responsivos a drogas modificadoras do curso da doença (DMARDs), com melhoria expressiva no prognóstico. Entretanto, concomitantemente, emergem preocupações relacionadas à imunossupressão decorrente de tal terapia, que torna crescentes os relatos de infecções por agentes oportunistas fúngicos, como a Candida spp.¹

Esse fungo pode causar uma variedade de apresentações clínicas, incluindo desde um comprometimento limitado ao tecido mucocutâneo a infecções invasivas extremamente graves. A candidíase sistêmica afeta principalmente pacientes submetidos a drogas imunossupressoras, incluindo glicocorticoides, antibioticoterapia de amplo espectro e procedimentos invasivos, com altos índices de mortalidade.^2-5

Candidemia já foi previamente relatada em pequenas séries de pacientes sob terapia biológica com anti-TNF, porém uma clara relação causal ainda não foi estabelecida.^6,7 Além disso, há raros relatos de infecção sistêmica por Candida spp. em pacientes com doenças reumatológicas.^8,9

O objetivo do presente estudo foi determinar a prevalência de candidíase sistêmica e localizada e sua possível associação com dados demográficos, manifestações clínicas e laboratoriais e terapêutica em pacientes com doenças reumatológicas em uso de agentes anti-TNF.

Materiais e métodos

Foram avaliados pacientes consecutivos com diagnósticos de artrite reumatoide (AR),¹⁰ espondilite anquilosante (EA)¹¹ artrite psoriásica (APs),¹² artrite idiopática juvenil¹³ e outros (doença de Behçet, doença de Crohn, artrite reativa, doença de Still, uveíte idiopática e arterite de Takayasu) acompanhados regularmente no Ambulatório de Reumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. Todos os pacientes estavam em tratamento com agentes anti-TNF (adalimumabe, etanercepte ou infliximabe) no Centro de Dispensação de Medicamentos de Alta Complexidade (Cedmac) e faziam uso concomitante de drogas modificadoras de doença (DMARDs).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética institucional e um consentimento informado foi obtido de todos os participantes.

Avaliação das doenças reumatológicas

A atividade de doença foi avaliada por meio de instrumentos padronizados, incluindo o Disease Activity Score (DAS28) para pacientes com AR¹⁴ e AIJ e Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity Index (Basdai)¹⁵ para EA e APs.

Os parâmetros laboratoriais foram avaliados pela velocidade de hemossedimentação (VHS) de acordo com o método de Westergreen (mm/1ª hora) e níveis de proteína C reativa por nephelometria (mg/L).

O tratamento atual concomitante ao anti-TNF com prednisona, DMARDs e imunossupressores (metotrexate, azatioprina, leflunomide, antimalárico, sulfassalazina e/ou ciclosporina) também foi avaliado.

Avaliação de candidíase e fatores de risco

Os pacientes foram avaliados clinicamente no dia da aplicação da terapia anti-TNF em relação a sinais e sintomas de infecção por Candida spp., incluindo monilíase oral, candidíase genital, disúria ou leucorreia característica. Foram analisados os seguintes fatores de risco até quatro semanas antes do estudo: uso de antibioticoterapia, imunossupressores, hospitalização e procedimentos invasivos.

1. Cultura de sangue periférico para fungos: A cultura de sangue para fungos na população em uso de agente anti-TNF foi feita com frascos com meio de cultura BD BACTEC™-MYCO/F Lytic Medium (Becton Dickinson, USA).

2. PCR para Candida spp. no sangue periférico: A detecção do DNA da Candida spp. foi feita por reação em cadeia da polimerase.¹⁶ A análise do material coletado foi feita no Laboratório de Investigação Médica em Micologia (LIM-53) do HC-FMUSP em pacientes submetidos à terapia anti-TNF-alfa.

As extrações de DNA das amostras de sangue total dos pacientes incluídos no estudo foram feitas de acordo com a técnica descrita por Löeffler et al.¹⁷ Foram coletadas amostras de 3 a 5 mL de sangue em um tubo com EDTA e submetidas a hemólise inicial com solução de NH₄Cl 1,55 M; KHCO3 100 mM; EDTA pH 7,4 10 mM. Após obtenção do pellet de células livres de hemácias, foram acrescentados 3 mL de solução com Tris-HCl pH 8,0 100 mM; NaCl 4 M; EDTA pH8,2 20 mM. A seguir, as amostras foram vigorosamente agitadas e foram adicionados 600 µL de solução com 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 250U/mL de liticase (L-4276, Sigma, USA) e 5% de β-mercaptoetanol. Os tubos foram mantidos a 37 °C por 2:30 horas e, após o período de incubação, a extração do DNA total foi feita com o QIAamp^® DNA Mini kit (QIAGEN, Germany), de acordo com o protocolo descrito pelo fornecedor.

Como controles positivos das reações de amplificação, amostras de DNA de Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. lusitaniae e C. pelliculosa foram obtidas.

Para amplificação do DNA extraído das amostras de sangue dos pacientes e das amostras da Candida spp. foi empregada a técnica de nested-PCR. Na primeira etapa de amplificação foram usados os primers ITS1 e ITS4 e a segunda etapa foi idealizada para dois sistemas de amplificação, com o uso de primers espécie-específicos: o sistema 1 composto por primers de C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata e C. lusitaniae; e o sistema 2, por primers de C. pelliculosa, C. parapsilosis e C. krusei.

A detecção dos amplificados foi feita em géis de agarose a 2,5% submetidos a eletroforese em cubas horizontais Horizon H-58 (Life Technologies, EUA), em tampão TAE 1 x (TRIS-ácido acético-EDTA pH 8,0), a 80 V por 45 minutos Após eletroforese, os géis foram corados com GelRed™ (Biotium, USA) e os resultados registrados em sistema de fotodocumentação (Uvitec, Inglaterra).¹⁸

Análise estatística

Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão (DP) ou mediana (variação) para variáveis contínuas e percentagem para variáveis categóricas.

Resultados:

Entre os 194 pacientes incluídos, 67 apresentavam AR, 47 EA, 36 AIJ, 28 artrite psoriásica e 16 outros diagnósticos. A média de idade dos pacientes no momento do estudo era de 42 ± 16 anos, com 68 (35%) de sexo masculino, média de duração de doença de 15 ± 10 anos e média de tempo de uso de terapia anti-TNF de 1,9 ± 1,6 anos; 85% dos pacientes eram brancos, 8% negros, 7% pardos e 1% amarelo; 64 (33%) pacientes faziam uso de adalimumabe, 59 (30%) de etanercepte e 71 (36%) de infliximabe; 81% dos pacientes faziam uso concomitante de imunossupressores. Em relação às medicações concomitantes, 96 (49%) usavam prednisona, 88 (45%) metotrexate, 46 (24%) leflunomide, 24 (12%) sulfassalazina, 10 (5%) ciclosporina, seis (3%) azatioprina e 11 (6%) difosfato de cloroquina (tabela 1).

Tabela 1
Dados demográficos e tratamento de pacientes reumatológicos em terapia anti-TNF

Variáveis	n = 194
Dados demográficos
Idade atual, anos	42 ± 16
Sexo masculino, n (%)	68 (35)
Etnia
Brancos, n (%)	165 (85)
Negros, n (%)	16 (8)
Pardos, n (%)	14 (7)
Amarelos, n (%)	2 (1)
Tempo de doença, anos	15 ± 10
Tempo de terapia anti-TNF, anos	1,9 ± 1,6
Tratamento
Anti-TNF
Adalimumabe, n (%)	64 (33)
Etanercepte, n (%)	59 (30)
Infliximabe, n (%)	71 (36)
Glicocorticoides, n (%)	96 (49)
Média de dose, mg/dia	7,8 ± 4,6
Metotrexate, n (%)	88 (45)
Média de dose, mg/semana	22,2 ± 8,6
Leflunomide, n (%)	46 (24)
Sulfassalazina, n (%)	24 (12)
Ciclosporina, n (%)	10 (5)
Azatioprina, n (%)	6 (3)
Cloroquina, n (%)	11 (6)

• Os dados estão apresentados como número (%) ou média ± desvio padrão.

Entre pacientes com AR, a média de DAS28 era de 3,6 ± 1,5, HAQ de 1,1 ± 0,6, VHS 18 ± 16 mm/1ªh e PCR 10,1 ± 15,4 mg/L. Nos pacientes com EA, a média de BASDAI era de 3,2 ± 2,6, BASFI de 43 ± 32, ASQoL de 6,7 ± 5,4, VHS 8 ± 8 mm/1ªh e PCR 4,3 ± 5,2 mg/L. Entre os pacientes com AIJ, a média de DAS28 era de 3,4 ± 1,3, VHS 15 ± 18 mm/1ªh e PCR 19,5 ± 55,1 mg/L (tabela 2).

Tabela 2
Parâmetros clínicos e laboratoriais da doença em pacientes reumatológicos em uso de terapia anti-TNF

Variáveis
Artrite reumatoide (n = 67)
DAS28	3,6 ± 1,5
HAQ	1,1 ± 0,6
VHS, mm/1a hora	18 ± 16
PCR, mg/L	10,1 ± 15,4
Espondilite anquilosante (n = 47)
BASDAI	3,2 ± 2,6
BASFI	43 ± 32
ASQoL	6,7 ± 5,4
VHS, mm/1a hora	8 ± 8
PCR, mg/L	4,3 ± 5,2
Artrite idiopática juvenil (n = 36)
DAS28	3,4 ± 1,3
VHS, mm/1a hora	15 ± 18
PCR, mg/L	19,5 ± 55,1
Artrite psoriásica (n = 28)
DAS28	2,5 ± 1,3
Basdai	3 ± 1,7
VHS, mm/1a hora	10,3 ± 7,8
PCR, mg/L	4,2 ± 4,7

• DAS28, Disease Activity Score 28; HAQ, Health Assessment Questionnaire; VHS, velocidade de hemossedimentação; PCR, proteína C reativa; Basdai, BathAnkylosing Spondylitis Disease Activity Index; Basfi, Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index.Os dados estão apresentados como número (%) ou média ± desvio padrão.

No momento do estudo, apenas um (0,5%) paciente apresentou infecção fúngica localizada (candidíase vaginal) e nenhum teve monilíase oral. Nenhum dos pacientes incluídos apresentou candidemia com hemocultura positiva para fungos ou PCR positiva para Candida spp. em amostra de sangue periférico.

A análise de possíveis fatores de risco para infecção por Candida revelou que apenas 14 (7,2%) haviam recebido antibioticoterapia até quatro semanas antes da avaliação, nove por infecção de trato respiratório, três cutâneas, uma de trato urinário e uma odontogênica. Além disso, nenhum paciente foi hospitalizado ou submetido a procedimentos invasivos até um mês antes do início do estudo.

Discussão

Este foi o primeiro estudo que avaliou a prevalência de doença fúngica invasiva e localizada por cândida em um expressivo número de pacientes com doenças reumatológicas tratados com terapia anti-TNF e demonstrou baixo risco de candidíase, apesar da alta prevalência de uso de imunossupressores.

Estudos epidemiológicos têm demonstrado um aumento considerável em infecções em pacientes imunodeprimidos, entre as quais a Candida spp., particularmente nas sepses nosocomiais, com alto índice de mortalidade. Candida albicans é considerada como um agente comensal da flora normal do trato digestivo e sua patogenicidade é resultado de alterações nos mecanismos de defesa do hospedeiro que induzem modificações no comportamento do fungo.^19,20

Pacientes reumatológicos estão frequentemente expostos a diversos fatores de risco associados ao aumento significativo da incidência dessa infecção fúngica nas últimas décadas. O uso de antibioticoterapia de amplo espectro pode causar modificações na flora da mucosa e levar à proliferação de Candida; corticoterapia pode afetar a atividade de células polimorfonucleares, macrófagos e células T; procedimentos cirúrgicos e o uso de drogas imunossupressoras, particularmente agentes biológicos, facilitam a proliferação de agentes oportunistas.^2,21 De fato, na literatura, em 98% das infecções fúngicas invasivas como histoplasmose, candidíase e aspergilose, foi relatado o uso de pelo menos um imunosupressor, particularmente corticoterapia, associado à terapia anti-TNF.¹

A resposta imune inata é o mecanismo dominante responsável pela depuração de leveduras após a infecção sistêmica inicial. Os monócitos e macrófagos são as células mais associadas com a resposta contra infecção sistêmica por C. albicans. As vias pelas quais isso ocorre ainda não são completamente esclarecidas, mas parecem envolver o reconhecimento de padrões moleculares associados patógeno (PAMPs) na levedura por receptores na célula fagocítica, o que resulta na ativação e liberação de citocinas inflamatórias.¹⁹ Além disso, o espectro de defesas contra infecção mucocutânea e sistêmica por Candida inclui imunidade celular mediada que é caracterizada pela liberação de citocinas por linfócitos e a ativação de células NK e linfócitos por interleucinas. Entretanto, há evidências que apoiam o papel da resposta humoral na proteção contra a infecção invasiva Candida.^19,20

Sabe-se que, na infecção sistêmica por C. albicans, a produção de TNF é estimulada pelo patógeno. Louie et al.²² demonstraram, em um modelo animal de candidíase sistêmica, que essa citocina teria um papel protetor na infecção. A neutralização da atividade do TNF levaria a uma supressão na produção de IFN, promoveria a apoptose de monócitos, impediria a manutenção do granuloma e permitiria o crescimento do fungo em diversos órgãos.¹ De fato, em uma revisão de relatos de infecções fúngicas invasivas associadas à terapia anti-TNF (infliximabe, adalimumabe, etanercepte) em diversas doenças (doença versus hospedeiro, doença inflamatória intestinal e AR) entre 1966 e 2007, Tsiodras et al.¹ encontraram 281 casos. Candidíase foi responsável por 23% dessas infecções e, entre essas, apenas três ocorreram em pacientes com AR. Embora evidências na literatura sugiram que possa haver diferenças em relação a risco de infecção entre diferentes drogas anti-TNF,²³ o presente estudo evidenciou baixas frequências de candidíase para os três agentes usados.

Além disso, entre pacientes reumatológicos há apenas dois relatos de artrite séptica por Candida spp. em pacientes com artrite reumatoide em terapia anti-TNF.^8,9 Entretanto, nos dois casos, o uso concomitante de outros agentes imunossupressores pode ter contribuído para o desenvolvimento da infecção por Candida.

A metodologia de PCR empregada para detecção de Candida spp. no presente estudo não parece justificar a ausência de positividade, uma vez que essa é considerada uma das mais sensíveis para o diagnóstico de candidemia em relação aos métodos tradicionais.²⁴ Em um estudo com camundongos com candidemia induzida, a sensibilidade dessa técnica foi de 79%.²⁵ Por outro lado, o isolamento do fungo em cultura de fluido estéril como sangue e líquido peritoneal é associado a um índice de recuperação baixo e atinge apenas 40 a 60% de positividade em pacientes com candidíase sistêmica comprovada por autópsia.²⁶

A partir deste estudo, concluímos que doença fúngica invasiva e localizada por Candida não representou uma infecção frequente em pacientes reumatológicos em terapia imunossupressora associada a agentes anti-TNF.

• Financiamento
  Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), 2009/51897-5 para EB e CAS, Conselho Nacional do Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), 302724/2011-7 para CAS e 301411/2009-3 para EB, Federico Foundation para CAS e Núcleo de Apoio à Pesquisa Saúde da Criança e do Adolescente da USP (NAP-CriAd).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Nov-Dec 2016

Histórico

• Recebido
  18 Jul 2014
• Aceito
  1 Mar 2015