Evidência molecular de Borrelia burgdorferi sensu lato em pacientes no centro-oeste brasileiro

Resumo

Este estudo promoveu a detecção de DNA de Borrelia burgdorferi sensu lato em amostras de sangue e soro de pacientes com manifestações clínicas e epidemiologia compatíveis com a doença de Lyme-símile brasileira ou síndrome de Baggio-Yoshinari. Para tanto, foi feita triagem sorológica pelos métodos de Elisa e Western blotting e a identificação molecular de B. burgdorferi por meio da amplificação de um fragmento do gene conservado que sintetiza o gancho flagelar (flgE). Os resultados demonstraram sorologia positiva e, pela primeira vez, a presença de DNA de Borrelia burgdorferi sensu lato em humanos na Região Centro-Oeste do Brasil. A análise genética das sequências dos isolados mostrou similaridade às sequências disponíveis no GenBank. Pela análise filogenética inferida pela sequência parcial do gene flgE, a cepa brasileira agrupou-se com a sequência de B. burgdorferi sensu lato. Este estudo abre perspectivas promissoras e reforça a necessidade de estudos adicionais a fim de determinar as características epidemiológicas da doença, bem como o impacto da prevalência da borreliose brasileira no Estado de Mato Grosso do Sul, Brasil.

Palavras-chave:
Borrelia burgdorferi; Doença de Lyme; flgE; Síndrome de Baggio-Yoshinari; Brasil

Abstract

We aimed to detect DNA of Borrelia burgdorferi in whole blood and serum samples of patients with clinical symptoms and epidemiology compatible with Brazilian Lyme-like disease. Four patients with positive epidemiological histories were recruited for the study. Blood samples were collected, screened by serologic testing by ELISA and Western blotting and molecular identification of B. burgdorferi by amplifying a fragment of the conserved gene that synthesizes the hook flagellar flgE. The results showed positive serology and for the first time, the presence of B. burgdorferi sensu lato in humans in the Midwest region of Brazil. The resulting sequences were similar to GenBank corresponding sequences of B. burgdorferi flgE gene. By neighbor-joining the phylogenetic analysis, the flgE sequence of the Brazilian strain clustered in a monophyletic group with the sequence of B. burgdorferi sensu lato under 100% bootstrap support. This study opens up promising perspectives and reinforces the need for additional studies to determine the epidemiological characteristics of the disease, as well as the impact of the prevalence of Brazilian borreliosis in Mato Grosso do Sul State, Brazil.

Keywords:
Borrelia burgdorferi; Lyme disease; flgE; Baggio-Yoshinari syndrome; Brazil

Introdução

A doença de Lyme (DL) é uma zoonose emergente de caráter multissistêmico, causada por espiroquetas do grupo Borrelia burgdorferi sensu lato e transmitida por carrapatos do complexo Ixodes ricinus.¹

A distribuição geográfica da doença é ampla e as manifestações clínicas variam conforme a espécie do complexo B. burgdorferi sensu lato encontrada em determinada localidade geográfica.^2,3 A diversidade etiológica e antigênica explica o organotropismo e o aparecimento de quadros clínicos e laboratoriais distintos nas diferentes regiões e representa um crescente desafio ao manejo dessa zoonose emergente.¹

No Brasil, os primeiros casos foram descritos no Estado de São Paulo em 1992⁴ e, desde então, outros casos têm sido descritos com técnicas sorológicas e moleculares em diversos estados brasileiros: Mato Grosso do Sul,^5-7 Amazonas,⁸ Tocantins⁹ e Paraná,¹⁰

Diferenças observadas nas características epidemiológicas, clínicas e laboratoriais em relação à DL descrita no hemisfério norte permitiram caracterizar a doença de Lyme-símile brasileira (DLSB) ou síndrome de Baggio-Yoshinari,^11,12 que, apesar do clássico eritema migratório e das habituais complicações sistêmicas encontradas na DL, cursa com grande frequência de recorrências e produção de autoanticorpos ao longo da prolongada evolução clínica.¹³

Estudos com métodos moleculares a partir de amostras de humanos com sintomatologia compatível com a DLSB têm reforçado a existência de casos de borreliose no Brasil.^10,14 Dessa forma, o presente estudo objetivou investigar a presença de DNA de Borrelia burgdorferi em amostras de pacientes com diagnóstico clínico e sorológico de borreliose no Mato Grosso do Sul, Brasil.

Pacientes e métodos

Selecionamos quatro pacientes com manifestações clínicas e epidemiologia compatível com a DLSB atendidos pelo Serviço de Reumatologia do Hospital Universitário Maria Aparecida Pedrossian da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (Humap-UFMS). Todas as pacientes eram do sexo feminino com média de 33,3 (± 11,9) anos. Todas tinham histórico de picadas de carrapato e visitas a áreas de alto risco nas regiões Sudeste e Centro-Oeste do Brasil e também preenchiam os critérios brasileiros para o diagnóstico de borreliose, tal como adotados pelo Laboratório de Investigação em Reumatologia, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo (LIM-17), centro de referência no Brasil.^12,15

Uma das pacientes estava na fase aguda (diagnosticada dentro de três meses do início da doença) e as outras três estavam na fase tardia (diagnosticados mais de três meses após o início da doença) da borreliose. A paciente que estava em fase de doença aguda apresentava sintomas flu-like, inclusive febre, cefaleia, mialgia e artralgia. As pacientes que estavam no estágio tardio da doença tinham desenvolvido artrite e apresentavam distúrbios cognitivos, manifestavam-se com sintomas inespecíficos, inclusive perda de memória, alterações do sono e alterações do humor, quadro depressivo com indiferença social e perda de apetite, além da recorrência de sintomas flu-like e fadiga crônica. Todas apresentaram resultados positivos nos testes sorológicos para B. burgdorferi G39/40, de origem americana, com metodologias Elisa e WB¹⁶ de acordo com a padronização e interpretação recomendadas pelo laboratório de referência nacional LIM-17.^12,15

Quarenta indivíduos em bom estado geral, sem histórico de picada de carrapato ou de viagem recente a áreas de alto risco, forneceram amostras de sangue e foram incluídos no grupo de controle. Trinta indivíduos eram do sexo feminino (75%) e dez eram do masculino (25%). A média foi de 34,6 (± 19,2) anos.

DNA foi extraído com kit QIAamp DNA Kit (QIAGEN^®) a partir de amostras de 100 µL de sangue periférico e de soro, de acordo com as instruções do fabricante. A pureza (260 nm/280 nm) e a concentração (ng/µL) total de DNA foram determinadas por densidade óptica em espectrofotômetro (BioDrop^® Touch Duo Spectrophotometer by BioDrop England).

Os iniciadores usados foram desenhados por Rezende et al. (Instituto Nacional da Propriedade Industrial - INPI - Processo BR 10 2016 021522 6) para amplificação de um fragmento de 262 pb da região de codificação do gene conservado que sintetiza o gancho flagelar (flgE) de B. burgdorferi descrito por Sal et al.¹⁷ Foram usados os seguintes primers: flgE 262 FW (5′-TCCTCCGGGATTCATACAAG-3′) e flgE 262 Rev (5′-TGGGTGCAAATGTAGGTGAA-3′).

Amplificação foi feita em 25 µL de volume final de reação com 17,55 µL de H₂O ultrapura livre de DNAse/RNAse, 2,50 µL de Tampão PCR 10x, 0,75 µL de MgCl₂ (1,5 mM), 0,50 µL de dNTP mix (10 mM), 0,25 µL de cada primer (10 pmoles), 0,2 µL de Platinum™ TaqDNA Polymerase e 3 µL de DNA extraído da amostra.

As condições de ciclos da PCR consistiram de uma desnaturação inicial durante 3 minutos a 95 °C, seguida de 45 ciclos repetitivos, consistiu em desnaturação a 95 °C por 20 segundos, anelamento a 62 °C por 25 segundos, extensão a 72 °C por 25 segundos, seguidos por uma extensão final durante 5 minutos a 72 °C. As boas práticas de laboratório foram seguidas para evitar a contaminação e, em cada reação, foi incluído um controle negativo (água) para descartar possibilidade de contaminação. Borrelia anserina foi usada como um controle positivo em todas as reações. Os produtos de PCR foram analisados em eletroforese de gel de agarose a 1,5%, corado com SYBR Gold (Invitrogen) e analisados por transiluminação de UV.

As amostras positivas foram purificadas com QIAEX^® II Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH) e sequenciadas em sequenciador automático de DNA ABI Prism 3130 (Applied Biosystems^®) em ambas as direções com BigDye Ready Reaction mix (ABI Corporation^®). O alinhamento foi feito em software Clustal W2^® com as sequências obtidas neste estudo e a sequência disponível no GenBank (Número de Acesso: CP009656.1). A análise filogenética foi inferida para o gene flgE com o programa MEGA 7.0^® e um dendograma foi construído pelo método de Neighbor-Joining.¹⁸ Valores de confiança para os ramos individuais da árvore resultante foram determinados pela análise de bootstrap com 100 repetições.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS) conforme indicado no protocolo de pesquisa número 1.065.681 de 15 de maio de 2015 - CAAE 42325815.1.0000.0021. Todos os controles e pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

Resultados

A presença de anticorpos anti-Borrelia e a amplificação do DNA de Borrelia burgdorferi sensu lato para o gene flgE foram detectadas em todas as amostras analisadas (tabela 1).

Tabela 1
Resultado da sorologia para B. burgdorferi por Elisa e Western blotting e da PCR para o gene flgE em amostras de pacientes

Paciente	Elisa			Western blotting		PCR
	Ig M	Ig G		Ig M	Ig G	flgE
1	Negativo	Positivo		Negativo	Positivo	Positivo
2	Positivo	Positivo		Positivo	Positivo	Positivo
3	Negativo	Positivo		Positivo	Positivo	Positivo
4	Negativo	Positivo		Negativo	Positivo	Positivo

Para a reação de PCR foram submetidas oito amostras (quatro sangue total e quatro soros) e 100% (4/4) das amostras de sangue total e 25% (1/4) das amostras de soro humano foram positivas (fig. 1).

Figura 1
PCR do gene flgE analisado em gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídeo: PM = peso molecular (100pb); C- = controle negativo; 1, 2, 3 e 4 = amostras de soro de pacientes com borreliose brasileira; 5, 6, 7 e 8 = amostras de sangue total de pacientes com borreliose brasileira; C+ = Borrelia anserina.

As sequências obtidas neste estudo apresentaram homologia com sequências de B. burgdorferi sensu lato depositadas no GenBank e possibilitaram a identificação em nível de espécie. A extensão sequenciada e avaliada do gene flgE de acordo com as sequências disponíveis no GenBank foi de 228 pb, que codificam 76 aminoácidos.

As sequências obtidas neste estudo foram depositadas no GenBank com os números de acesso KU712208, KU712209, KU712210, KY073265 e KY073266. As sequências foram agrupadas em um grupo monofilético pela análise filogenética, pelo método de Neighbor-Joining, com 100%de suporte bootstrap (fig. 2).

Figura 2
Árvore filogenética baseada na comparação da região codificadora do gene flgE de Borrelia burgdorferi.

Discussão

Nossos resultados fornecem evidência de Borrelia burgdorferi sensu lato em amostras de sangue total e a inédita detecção do DNA da espiroqueta amplificada para o gene flgE em amostra de soro humano em nossa região.

O gene que sintetiza o gancho flagelar (flgE) é um gene cromossômico único, de aproximadamente 1 kb, e que codifica para a proteína flagelina (41 kDa). Por ser altamente conservado, sua diversidade é valiosa para distinguir as espécies de Borrelia.^19,20 A análise filogenética com a sequência de genes da flagelina confirmou a homologia entre os isolados.

Todas as amostras de sangue total analisadas apresentaram positividade e apenas uma única amostra de soro foi positiva na reação de PCR. Coburn et al.²¹ demonstraram a capacidade de ligação de B. burgdorferi às plaquetas do hospedeiro e Goodman et al.²² afirmam que talvez esse seja o motivo da maior concentração de espiroquetas no plasma em relação ao soro e sugerem que o plasma seja a amostra preferencial para pesquisa.

No Brasil, pacientes diagnosticados com características sugestivas de borreliose apresentam histórico de exposição a carrapatos, quadro clínico sugestivo com frequentes recorrências, sorologia positiva mas com títulos baixos e pouco persistentes, inclusive a visualização de estruturas sugestivas de espiroquetas em amostras de sangue de pacientes com perfil clínico compatível.^12,13

A presença de anticorpos anti-Borrelia pelas técnicas de Elisa e WB tem sido demonstrada em pacientes sintomáticos e assintomáticos, com epidemiologia positiva de contato com carrapato, em diversas regiões do Brasil.^5,6,8-10

Entretanto, a observação de um padrão de reatividade sorológica diferente da DL com baixa sensibilidade e títulos variáveis levou à definição de critérios nacionais para interpretação dos testes sorológicos. O LIM-17, centro de referência no Brasil, adota um critério de avaliação do WB que se baseia não na presença de bandas específicas, mas no quantitativo de bandas, sendo considerado teste positivo a presença de duas bandas para IgM, quatro para IgG ou ainda um padrão combinado de uma banda IgM e duas bandas IgG.^12,15

A descrição de espiroquetas na sua forma L, conhecidas como bactérias deficientes em parede celular e que podem alterar sua morfologia quando as condições de sobrevivência não são favoráveis,¹² e a posterior detecção de Borrelia burgdorferi sensu stricto por Mantovani et al.¹⁴ auxiliaram no entendimento da maioria das controvérsias da DLSB: longa permanência das espiroquetas no hospedeiro devido aos mecanismos de evasão das defesas do hospedeiro,²³ dificuldades para cultivá-las nos meios tradicionais como o BSK, embora descrevam a visualização de estruturas sugestivas de espiroquetas em amostras de sangue humano de pacientes com perfil clínico compatível¹², baixa resposta imunológica contra a bactéria que ocasiona títulos baixos e pouco persistentes de anticorpos, desenvolvimento de autoimunidade¹² e resistência à sua eliminação dos hospedeiros, ocorrem recidivas clínicas e sorológicas.^13,23-25

Esses resultados confirmam a existência de borreliose causada por B. burgdorferi sensu lato no Estado de Mato Grosso do Sul, Brasil, com sintomas semelhantes a DL clássica e sugerem a necessidade de prosseguir com os estudos epidemiológicos, sorológicos e moleculares a fim de melhor caracterizar essa zoonose emergente na região, que raramente é fatal, porém de grande morbidade quando não adequadamente diagnosticada e tratada, devido às recorrências e complicações clínicas progressivas.

• Financiamento
  Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia do Estado de Mato Grosso do Sul (Fundect).

Agradecimentos

À equipe do LIM-17 pelo treinamento e a cooperação durante este estudo e aos professores Dra. Susana Elisa Moreno (UCDB), Dra. Ana Rita Coimbra Motta de Castro (UFMS) e Dr. Cristiano Marcelo Espinola Carvalho (UCDB) pela inestimável colaboração.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Nov-Dec 2017

Histórico

• Recebido
  22 Nov 2016
• Aceito
  14 Abr 2017