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Brazilian Journal of Physical Therapy

Print version ISSN 1413-3555

Rev. bras. fisioter. vol.15 no.4 São Carlos Aug./Sept. 2011

https://doi.org/10.1590/S1413-35552011000400007 

ARTIGO ORIGINAL

 

Ação anti-inflamatória da fração lipídica do Ovis aries associado ao ultrassom terapêutico em modelo experimental de tendinite em ratos (Rattus norvegicus)

 

 

Marcelino MartinsI,II; Antonio L. M. Maia FilhoI,II; Charllyton L. S. CostaI; Nayana P. M. F. CoelhoI,II; Maricilia S. CostaIII; Regiane A. CarvalhoIV

IColegiado de Fisioterapia, Faculdade Integral Diferencial (FACID), Teresina, PI, Brasil
IIUniversidade Estadual do Piauí (UESPI), Teresina, PI, Brasil
IIIUniversidade Vale do Paraíba (UNIVAP), São José dos Campos, SP, Brasil
IVUniversidade Nove de Julho (UNINOVE), São Paulo, SP, Brasil

Correspondência para

 

 


RESUMO

CONTEXTUALIZAÇÃO: Estudos demonstram o efeito benéfico da aplicação tópica de ácidos graxos como agentes cicatrizantes. A fração lipídica do Ovis aries apresenta uma ação anti-inflamatória que acelera o processo de cicatrização. O ultrassom aumenta o fluxo sanguíneo bem como a extensibilidade das estruturas de colágeno e tendões.
OBJETIVOS: Analisar a ação anti-inflamatória da fração lipídica do Ovis aries associado ao ultrassom terapêutico (UST) pulsado e à fricção em modelo de tendinite induzida.
MÉTODOS: Cinquenta ratos Wistar foram distribuídos nos seguintes grupos: controle, gel Ovis aries - uso tópico - UST pulsátil + loção estéril (oil free), UST pulsátil + gel Ovis aries, loção estéril (oil free) - uso tópico. Para induzir a tendinite, utilizou-se uma injeção intratendínea de 10µL de colagenase no tendão do calcâneo direito. O tratamento consistiu em aplicações diárias de ultrassom, com os seguintes parâmetros: modo pulsado 10%, frequência de 1 MHz, pulsátil a 10% com intensidade de 0,5W/cm2, durante sete ou 14 dias.
RESULTADOS: A variação do número de células inflamatórias, para os animais tratados por 14 dias, com relação aos grupos controle, UST + oil free e UST + Ovis aries, apresentou resultados significativos p<0,001. O grupo Ovis aries + massagem e o grupo massagem + oil free apresentaram resultados significativos, p<0,01. Nos animais tratados por sete dias, observou-se que o grupo UST + Ovis aries, em relação ao controle, é estatisticamente significativo, p<0,05
CONCLUSÃO: Pode-se concluir que o tratamento com UST + Ovis aries é mais efetivo que os outros tratamentos, visto que consegue reduzir o número de células inflamatórias no tempo de sete e 14 dias.

Palavras-chave: fisioterapia; reabilitação; movimento; ultrassom; inflamação; tendinite.


 

 

Introdução

As lesões dos tendões são comuns na prática esportiva, pressupõe-se que elas correspondam de 30 a 50% do total1. Tais lesões constituem-se em um grande problema de saúde nos países industrializados, precipitada nos dias atuais pela força de trabalho de uma mão de obra recente, com a ocupação das pessoas exigindo uma série contínua de movimentos repetitivos2. Os tendões são estruturas fibrosas, com extremidades cilindroides ou em forma de fitas resistentes e formados por tecido conjuntivo denso3. A lesão dos tendões pode ocorrer devido aos mais diversos fatores, como sobrecarga, quando o atleta ou desportista faz um esforço acima de suas possibilidades, ou por esforço repetitivo de um mesmo movimento, o que pode ocasionar um processo inflamatório. O uso excessivo do tendão poderá levar a um processo degenerativo, comprometendo a prática de atividades pelo aparecimento de calcificações na bainha do tendão4.

Os ácidos graxos são compostos que contêm uma longa cadeia hidrocarbonada e grupamento carboxila terminal, apresentando três funções principais: são componentes estruturais das membranas biológicas; fazem o papel de precursores de mensagens intracelulares e, quando oxidados, geram energia - ATP (trifosfato de adenosina)5,6. Existem diversos estudos que demonstram o efeito benéfico da aplicação tópica de ácidos graxos no tratamento de feridas. São substâncias de baixo custo e amplamente utilizadas como agentes cicatrizantes pela cultura popular de diversos países, apresentando ainda a propriedade de servir de barreira protetora contra os micro-organismos, evitando a desidratação tecidual além do importante caráter imunomodulador7.

O ultrassom terapêutico (UST) é uma forma não-invasiva de tratamento na reparação de lesões teciduais, sendo o método pulsátil a modalidade mais escolhida por alguns pesquisadores pelos efeitos benéficos, sobretudo, em baixa intensidade8. O efeito térmico do ultrassom gerado pelo atrito intermolecular nos tecidos ocorre por agitação do meio eletrolítico dos líquidos intersticiais, tanto da água como dos solutos nela contidos, fazendo com que a onda de ultrassom contínuo seja contraindicada nos processos inflamatórios agudos e traumatismos recentes, em áreas isquêmicas ou com alterações da sensibilidade. Quanto à resposta do ultrassom na forma pulsada, pela diminuição do efeito térmico, ela é utilizada em outras situações, como a inflamação aguda e subaguda, dor de origem neuropática e edema9.

O ultrassom favorece a penetração transcutânea de várias substâncias, como corticosteroides, dexametasona e hidrocortisona, em animais; vasodilatador metilnicotinato, em humanos saudáveis, e anti-inflamatório indometacina, em animais10,11. A fonoforese apresenta-se como uma alternativa favorável por ser uma técnica não-invasiva. Os efeitos térmicos e mecânicos do UST podem levar a alterações físico-químicas dos tecidos biológicos, favorecendo a penetração dos princípios ativos presentes nas substâncias de uso tópico. O aquecimento da área a ser tratada pode aumentar a absorção da medicação nos tecidos, pois ocorre o aumento do fluxo sanguíneo, dilatação dos folículos pilosos, redução da resistência da pele e aumento da energia cinética da droga, facilitando a absorção. Os efeitos mecânicos do UST agem mesmo que os parâmetros sejam para produzir aquecimento12.

Alguns autores mostraram que o ultrassom é capaz de aumentar a penetração de alguns fármacos aplicados topicamente. Essa ação do UST, associada a fármacos, vem promovendo investigações nos diversos campos da medicina13. As pesquisas realizadas nas últimas décadas mostram as lesões tendinosas como uma das principais causas de sofrimento dos trabalhadores em atividade manual, como também das indenizações trabalhistas2. A incidência dessas patologias deve-se à exigência de alta produtividade e qualidade, determinadas pelo trabalho, em detrimento da conservação da saúde do trabalhador. Na maioria das vezes, tais patologias se desenvolvem devido à falta de controle do ritmo e à velocidade dos movimentos, associados a maquinários e mobiliários ergonomicamente incorretos14.

O objetivo geral do estudo foi analisar histologicamante a ação anti-inflamatória da fração lipídica do Ovis aries associado ao UST em modelo experimental de tendinite em ratos.

 

Materiais e métodos

Foram utilizados, no estudo, 50 ratos machos adultos, da espécie Rattus norvegicus, variedade Wistar (200-250 g), com idade acima de 30 dias, divididos em dois grupos de 25 ratos, com alimentação e água à vontade. O experimento foi realizado no Laboratório de Fisiologia da Faculdade Integral Diferencial (FACID), Teresina, PI, Brasil. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FACID, pelo protocolo nº 492/2008, no dia 11/11/2008, de acordo com a resolução nº 196/96, de 10 de outubro de 1996, do Conselho Nacional de Saúde (CNS).

Grupos experimentais

Os animais foram divididos aleatoriamente em cinco grupos, observando-se o período de sete e 14 dias, conforme período de cicatrização, totalizando dez animais por grupo:

• Grupo 1: controle;

• Grupo 2: gel de Ovis aries, uso tópico (massagem);

• Grupo 3: UST + loção estéril (oil free);

• Grupo 4: UST + gel Ovis aries;

• Grupo 5: loção estéril (oil free), uso tópico (massagem).

Indução da tendinite

Inicialmente, os animais foram anestesiados com cloridrato de quetamina a 10%, administrado 0,1 ml para cada 100 gramas de peso do animal, associado à mesma dose de cloridrato e xilazina a 2% por via intramuscular, contando com o auxílio de dois colaboradores para segurar o animal.

Para induzir a tendinite experimentalmente, utilizou-se uma injeção intratendínea de 10 µL de colagenase (10mg/ml; SIGMA; C6885) no tendão do calcâneo direito, usando uma agulha de 30G. A colagenase foi dissolvida em uma solução salina tamponada estéril de fosfato15.

Preparação do extrato da fração lipídica do Ovis aries

O procedimento de preparação do extrato de Ovis aries descrito a seguir foi realizado no Laboratório de Produtos Naturais do Departamento de Química da Universidade Federal do Piauí (UFPI), Teresina, PI, Brasil. O material adiposo/proteico obtido de Ovis aries (caprino) foi submetido à trituração mecânica manual, rendendo 1 kg de material triturado e com fragmentos com dimensões não-superiores a 2 cm. O material adiposo/proteico foi transferido para frasco de extração e, sobre ele, foram adicionados 2l de hexano P. A., marca Vetec. A cada dois dias, o material era filtrado em papel de filtro preparativo, e novo solvente era adicionado ao material, realizando-se um total de três extrações, as quais se deram em temperatura ambiente e com pouca luminosidade. Ao término de cada passo de extração, o filtrado era concentrado sob pressão reduzida a 55ºC, em evaporador rotatório. Ao término do processo de concentração do solvente, obteve-se o extrato lipídico de Ovis aries, utilizado no presente trabalho16.

Preparação da loção a 5% de lipídeos de Ovis aries

Preparou-se uma loção carregada com 5% do extrato lipídico de Ovis aries com a finalidade de permitir uma aplicação homogênea sobre os locais lesionados. A loção oil free foi adquirida em uma farmácia de manipulação e, então, se adicionou quantidade suficiente do extrato lipídico de Ovis aries para estabelecer uma concentração de 5% massa/massa. A consistência do preparado foi ajustada com a adição de quantidade suficiente de água destilada. O material foi armazenado em frasco opaco sob refrigeração até sua utilização.

Tratamento da tendinite

Utilizou-se o ultrassom (marca Ibramed, modelo sonopulse) com os seguintes parâmetros: modo pulsado 10%, frequência de 1 MHz, pulsátil a 10% com intensidade de 0,5 W/cm2, método de acoplamento direto com movimentos oscilatórios numa ERA de 1 cm2, durante 2 minutos. Esse protocolo obedece à literatura, pois, para lesões superficiais com área pequena, utiliza-se o protocolo acima17,18. O aparelho foi devidamente calibrado por empresa especializada, antes e após o tratamento proposto, com o intuito de verificar se não tinha havido perda de intensidade durante o tratamento19. Todos os animais foram tratados diariamente, respeitando o período de sete e 14 dias. O tratamento foi iniciado 24 horas após a indução da tendinite.

Análise histológica

Os animais foram sacrificados após o tratamento, respeitando o período de cicatrização de sete e 14 dias. Os tendões foram desidratados após fixação e inclusos em parafina; em seguida, foram confeccionados 150 campos para serem cortados em micrótomo, de forma semisseriada, com secções de 5 µm de espessura, cinco cortes por animal, para serem corados com hematoxilina-eosina (H&E) e tricrômico de Masson (TM). A histomorfometria foi realizada com a utilização de um microscópio óptico binocular, com aquisição de fotos na objetiva de 40X, para a diferenciação celular do número de células inflamatórias totais do campo de observação, intratendíneo, utilizando o programa de computador Image J® na sua função cell conter. Vale considerar que todas as fotos apresentadas nos resultados tiveram o mesmo aumento. Não foi feita diferenciação celular e, sim, contadas células totais.

Análise estatística

Os dados coletados foram avaliados quanto ao coeficiente de variação e à distribuição amostral para determinação do teste estatístico, considerando o nível de significância de 5% (p<0,05)20. Realizou-se a análise estatística da variação do número de células inflamatórias obtido nos grupos tratados e não-tratados, utilizando-se ANOVA, com pós-teste de Tukey, por meio do programa estatístico GraphPad Prism®, versão 3.0. Para confecção da barra de rolagem dos gráficos, levou-se em consideração o erro-padrão da amostra. Os dados obtidos apresentaram distribuição normal, segundo teste de Kolmogorov-Smirnov.

 

Resultados

Após análise da Figura 1, comparativo da variação do número de células inflamatórias foi considerado estatisticamente significativo com valor de p<0,05, porém observou-se não existir diferença estatística significativa quanto ao número de células inflamatórias entre os grupos tratados e não-tratados.

 

 

Ao se analisar a Figura 2, para os animais tratados por 14 dias, os grupos tratados com ultrassom apresentaram resultados significativos p<0,001.

 

 

A Figura 3, Foto A, corada com H&E mostra que, para os animais tratados durante sete dias, há presença de tecido de granulação em amadurecimento, edema e vasos neoformados, porém em menor quantidade que no tecido de granulação recém-formado, com vasos mais organizados e proliferação de fibroblastos com deposição de matriz extracelular (ME). Aos 14 dias de tratamento, como ilustrado na Foto B, corada com H&E, ocorre fibrose em organização, proliferação de fibroblastos e vasos mais organizados e em menor quantidade que no tecido de granulação, porém ainda em maior número que no tecido fibroso maduro.

 

 

Nos animais tratados por sete dias, corados com TM, Foto C, observa-se deposição de ME de maneira desorganizada, com fibras mais delgadas que no tecido conjuntivo habitual. Na Foto D, corada com TM, após 14 dias de tratamento, ocorre área de fibrose com áreas azuis (ME depositada) em maior quantidade que na área vermelha (fibroblastos proliferados). A fibrose encontra-se em processo de organização.

Analisando a Figura 4, quanto aos animais tratados por sete dias, corados com H&E, observa-se, na Foto A, tecido de granulação em amadurecimento, edema e neoformação vascular, porém em menor quantidade que no tecido de granulação recém-formado. Os vasos também são mais organizados que no tecido de granulação recém-formado. Há proliferação de fibroblasto e deposição de ME. Após 14 dias de tratamento e corados com H&E, a Foto B mostra fibrose em organização, proliferação de fibroblastos, com vasos mais organizados e em menor quantidade que no tecido de granulação, porém ainda em menor número que no tecido maduro.

 

 

Para os animais tratados por sete dias e corados com TM, a Foto C mostra fibras mais delgadas e desorganizadas que no tecido conjuntivo habitual. Para os ratos tratados por 14 dias e corados com TM, a Foto D mostra áreas de fibrose e outras vermelhas (fibroblasto proliferado) e fibrose em organização.

 

Discussão

A terapia com UST e Ovis aries apresentou resultado significativo no período de sete dias no que diz respeito ao processo inflamatório. Aos 14 dias de tratamento, observou-se maior presença de fibroblastos no grupo UST + oil free e UST + Ovis aries, com tecido colágeno mais organizado, sugerindo a ação anti-inflamatória dessa terapia.

Os autores relataram, em estudo, que os ácidos oleico e linoleico, presentes na fração lipídica do Ovis aries, podem ser usados como agentes anti-inflamatórios durante a primeira fase do processo de cicatrização, contribuindo ainda de maneira eficaz na aceleração do processo de reparação tecidual7.

Existe a influência da administração tópica dos ácidos α-linolênico (n-3), linoleico (n-6) e oleico (n-9) no processo de cicatrização de feridas em ratos. Observou-se que, a partir do 5º dia de tratamento, topicamente, com ácidos oleico e linoleico, houve redução significativa da ferida e inibição de óxido nítrico no local nas primeiras 48 horas21.

Neste trabalho, observou-se uma ação terapêutica importante dos ácidos linoleico e oleico, encontrados na fração lipídica do Ovis aries22,23, no processo de cicatrização, cujos resultados da contagem do número de células inflamatórias estão representados na Figura 1. Os resultados obtidos mostram que houve uma diminuição do número de células inflamatórias e evidenciou-se também o poder de aceleração do processo anti-inflamatório, o que está de acordo com a literatura22,23.

Os ácidos graxos têm se mostrado como aceleradores do processo cicatricial, atuando como agentes quimiotáticos para leucócitos, promovendo a angiogênese, como hidratante das feridas24,25.

Os efeitos do UST dependem de vários fatores físicos e biológicos, como: a intensidade; o tempo de aplicação; o estado fisiológico da área a ser tratada e a estrutura espacial e temporal do campo ultrassônico que vai ser tratado26. Essas variáveis devem ser entendidas para que se tenha uma correta compreensão do mecanismo do UST na ação com o tecido biológico. A irradiação ultrassônica tem uma importante participação no processo de cicatrização cutânea, acelerando a reparação tecidual e colaborando com a velocidade de cicatrização quanto à qualidade do tecido cicatricial29. Essas mudanças incluem aumento da síntese proteica, mastócitos, granulação, absorção de cálcio e mobilidade de fibroblastos que, segundo vários estudos, poderiam acelerar o processo cicatricial27-30.

Os resultados desta pesquisa mostram que a terapia com ultrassom associado ao Ovis aries apresenta efeito anti-inflamatório significativo na fase aguda do processo de inflamação (Figura 1) tratado por um período de sete dias, com relação ao grupo controle. Nesse período da inflamação aguda, ocorre inicialmente uma resposta vascular, com produção de vasoconstrição pela ação da noradrenalina e contração do endotélio, seguida de vasodilatação, e as células inflamatórias (leucócitos e neutrófilos) são atraídos para a área da lesão. Nesse momento, os macrófagos removem os restos celulares e componentes extracelulares alterados, e os fibroblastos iniciam a síntese de colágeno28-30.

Tem-se estudado um melhor entendimento dos ácidos graxos poli-insaturados sobre o sistema imune com a finalidade de conhecer a dinâmica dos eicosanoides derivados do ácido araquidônico na modulação das respostas inflamatórias e na imunidade, importante para o organismo e para as células31.

O pesquisador32 relata os efeitos positivos do UST na fonoforese comparados com os efeitos da aplicação tópica de hidrocortisona no processo de reparo do tendão de Aquiles de rato, após tenotomia. O tratamento demonstrou ser o método mais eficiente, concluindo que o UST estimula a aceleração do processo de reparo tecidual e induz a penetração transcutânea da hidrocortisona.

Este estudo avaliou a aplicação do gel Ovis aries, utilizando o ultrassom pulsátil no processo de aceleração no tratamento da inflamação. O uso concomitante de anti-inflamatórios tópicos na forma de gel e UST vem se tornando uma prática comum nos serviços de reabilitação pelo favorecimento da penetração de substâncias através da via transcutânea13.

 

Conclusão

O modelo utilizado no presente estudo mostra que o efeito da terapia da fração lipídica do Ovis aries, associado ao ultrassom pulsado e à fricção em modelo de tendinite induzida em ratos, interfere na cicatrização tendínea. Houve uma variação do número de células inflamatórias para os animais tratados por 14 dias em relação ao grupo controle, apresentando resultado significativo.

Dessa maneira, sugerem-se mais estudos para explicar o mecanismo de ação do UST e da fonoforese bem como validar os parâmetros utilizados.

 

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Correspondência para:
Marcelino Martins
Coordenação de Fisioterapia, FACID
Av. Rio Poty, 2381, Horto Florestal
CEP 64049-410, Teresina, PI, Brasil
e-mail: marcelinomartins@facid.com.br

Recebido: 09/06/2010
Revisado: 07/12/201
Aceito: 26/04/2011

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