Ensaios toxicológicos aplicados à análise de águas contaminadas por fármacos

Toxicological tests applied to the analysis of water contaminated by drugs

RESUMO

Fármacos de diversas classes têm sido detectados no ambiente aquático nos últimos anos. A presença desses compostos químicos deve-se, sobretudo, ao lançamento de esgoto in natura ou à remoção incompleta durante as etapas do tratamento de esgoto. Embora tais materiais sejam detectados em baixas concentrações (ng.L^-1 - µg.L^-1), os impactos de alguns fármacos à biota aquática já são conhecidos, sendo os efeitos na saúde humana, especialmente aqueles relacionados à exposição crônica, ainda pouco conhecidos e/ou controversos. Ensaios biológicos são ferramentas valiosas para avaliar a toxicidade de fármacos aos organismos expostos, e a sua adoção conjunta aos ensaios de tratabilidade da água e efluentes permitiria preencher lacunas de conhecimento e a construção de consenso na literatura científica sobre os seus efeitos toxicológicos. Pelo exposto, este artigo de revisão apresenta uma visão geral da ocorrência de fármacos em amostras ambientais do país e a toxicidade observada por meio de diferentes ensaios biológicos.

Palavras-chave:
fármacos; ecotoxicidade; toxicidade; microcontaminantes; contaminantes de preocupação emergente; qualidade de água

ABSTRACT

Drugs of several classes have been detected in the aquatic environment in recent years. The presence of these chemicals is mainly due to the discharge of raw sewage or to their incomplete removal in sewage treatment plants. Although they have been detected at low concentrations (ng.L^-1 - µg.L^-1), the effects of pharmaceutical compounds on the aquatic biota are already acknowledged, being the effects on human health, especially those related to chronic exposure, still unknown and/or controversial. Biological assays are valuable tools for assessing drug toxicity to exposed organisms and their joint adoption in water and effluent treatability trials would fill up knowledge gaps and build consensus in the scientific literature on their toxicological effects. This review paper presents an overview of the occurrence of drugs in several Brazilian environmental samples and compiles the toxicity observed by means of different biological assays.

Keywords:
drugs; ecotoxicity; toxicity; micropollutants; contaminants of emerging concern; water quality

FÁRMACOS NO AMBIENTE

Fármacos, assim como novos pesticidas, produtos de cuidado/higiene pessoal, suplementos nutricionais, agentes de diagnóstico, entre outros compostos que têm sido detectados no ambiente e para os quais não há legislação estabelecendo padrões ou limites ambientais, são considerados contaminantes emergentes (BIRCH et al., 2015). Os produtos farmacêuticos e os de higiene pessoal têm recebido atenção de pesquisadores nos últimos anos por causa da intensa produção e, principalmente, do uso generalizado e contínuo em humanos e animais (DAUGHTON, 2002).

Os fármacos são classificados pela atividade biológica, estrutura química ou modo de ação. Quanto à atividade biológica, podem ser divididos em analgésicos, antitérmicos, anti-inflamatórios, antibióticos, anti-hipertensivos, hormônios etc. (KÜMMERER, 2010). Os mecanismos de ação dos fármacos são diversificados, variando de acordo com a classe pertencente. Uma vez administradas, essas substâncias são absorvidas no organismo, sendo parcialmente metabolizadas e então excretadas nas formas original, associada ou como metabólitos. Quando essas substâncias são excretadas pela urina e fezes de seres humanos e animais, alcançam o esgoto doméstico e/ou os corpos d’água (BILA; DEZOTTI, 2003; MELO et al., 2009).

De fato, a principal rota de entrada de resíduos de fármacos no ambiente é o lançamento de esgotos domésticos, tratados ou in natura, nos cursos d’água. No caso dos fármacos consumidos pelo ser humano, parte deles entra no sistema aquático na forma inalterada ou como metabólito, após passagem pela estação de tratamento de esgotos, que remove apenas parcialmente a carga afluente de tais contaminantes (AQUINO; BRANDT; CHERNICHARO, 2013; GARTISER et al., 2012; MELO et al., 2009). Além disso, deve-se considerar o descarte de efluentes hospitalares e de fármacos não consumidos ou fora do prazo de validade, incluindo os de uso veterinário, quando as drogas são deliberadamente introduzidas no ambiente (DELGADO et al., 2012; FARRÉ et al., 2008; TERNES et al., 2002).

Dados de monitoramento ambiental realizados no Brasil (LIMA et al., 2017) indicam que fármacos são encontrados em mananciais superficiais, principalmente aqueles pouco preservados, em concentrações que variam de dezenas a centenas de nanogramas por litro (ng.L^-1). Para que fármacos e outros microcontaminantes não sejam encontrados na água potável, eles devem ser eficientemente removidos durante o tratamento de água, mas sabe-se que as operações unitárias (coagulação, floculação, sedimentação, filtração) utilizadas nas estações de tratamento de água (ETAs) são apenas moderadamente eficazes na remoção de tais poluentes (BENOTTI et al., 2009; BILA; DEZOTTI, 2003; LIMA et al., 2014; USEPA, 2001), fazendo com que a água tratada seja uma rota potencial de exposição humana a fármacos e outros contaminantes emergentes (MACHADO et al., 2016). Embora a etapa de desinfecção com cloro resulte normalmente na remoção (por oxidação) do fármaco-alvo, isso em geral ocorre com a formação de subprodutos oxidados cuja toxicidade é pouco conhecida (SOUZA et al., 2018). De fato, a formação de subprodutos da cloração de fármacos já foi observada para diclofenaco (QUINTANA et al., 2010; RIGOBELLO, 2012), metformina (QUINTÃO et al., 2016), sulfametoxazol (DODD; HUANG, 2004; SOUZA et al., 2018), 17β-estradiol e estrona (PEREIRA, 2011), entre outros.

Em 2011, foram determinados os procedimentos e as responsabilidades relativos ao controle e à vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade por meio da Portaria nº 2.914/2011, do Ministério da Saúde (BRASIL, 2011), posteriormente incorporada como Anexo XX da Portaria de Consolidação nº 5, de 28 de setembro de 2017, do referido ministério (BRASIL, 2017). Essa portaria, a exemplo do que se passa em outros países e coadunando-se com a versão mais atual dos guias de qualidade da água potável da Organização Mundial da Saúde (OMS, 2017), não estabelece valores de referência para a presença de fármacos na água potável. Embora alguns estudos de monitoramento realizados no Brasil indiquem a presença de tais contaminantes em mananciais de abastecimento e até mesmo em águas distribuídas à população (GHISELLI, 2006; GUIMARÃES, 2008; SODRÉ et al., 2010; JARDIM et al., 2011), é improvável que a exposição a eles pelo consumo de água cause significativos efeitos adversos, uma vez que esses compostos ocorrem em concentrações muito inferiores à dose terapêutica mínima. Por outro lado, a OMS (2012) salienta no documento Pharmaceuticals in Drinking-Water que há lacunas no conhecimento da avaliação de riscos associados à exposição a longo prazo a fármacos em baixas concentrações e ao possível efeito combinado de misturas de substâncias químicas, incluindo os fármacos.

Na mesma linha, outros documentos da OMS (BERGMAN et al., 2013; OMS, 2014) reconhecem a preocupação ambiental que se deve ter com fármacos que exibem atividade endócrina (desreguladores endócrinos) ou que induzam à resistência antimicrobiana (antibióticos).

Avanços nas técnicas analíticas têm contribuído para o aumento na detecção de fármacos e outros contaminantes de preocupação emergente na água (OMS, 2012). A seguir, são apresentados resultados de estudos de monitoramento de fármacos de diversas classes, em esgoto e águas naturais no Brasil (Tabela 1). De acordo com os dados, pode-se inferir que tanto no esgoto bruto quanto no efluente tratado há a presença de uma variada classe de fármacos indicando que algumas classes não são totalmente removidas durante o tratamento. Particularmente, a baixa eficiência ou a não remoção desses compostos em estações de tratamento de esgoto (ETE) foram observadas por diferentes grupos de pesquisa para o antilipêmico bezafibrato, o anti-inflamatório diclofenaco, os antibióticos trimetoprima e sulfametoxazol e o estrogênio sintético 17α-etinilestradiol.

Tabela 1 -
Estudos sobre a ocorrência de fármacos de diversas classes em esgoto bruto e em esgoto tratado em estações de tratamento de esgoto (ETEs) brasileiras.

	Fármaco	Classe	Concentração (µg.L-1)	Estado	Referência
Esgoto bruto	Ácido clofíbrico	Principal metabólico de três antilipêmicos	1,0	RJ	Stumpf et al. (1999)
	Bezafibrato	Antilipêmico	1,2	RJ	Stumpf et al. (1999)
			< 0,0043 a 0,249	MG	Brandt et al. (2013) Queiroz et al. (2012)
	Diclofenaco	Anti-inflamatório não esteroidal	0,8	RJ	Stumpf et al. (1999)
			2,9	SP	Ghiselli (2006)
			< 0,007 a 0,240	MG	Brandt et al. (2013) Queiroz et al. (2012)
			< 0,4 a 5,6	CE	Souza (2011)
	Dipirona	Analgésico	36,4	SP	Ghiselli (2006)
			< 2,2 a 8,9	CE	Souza (2011)
	17 α-Etinilestradiol1	Inibidor da ovulação	0,005	RJ	Ternes et al. (1999)
			5,8	SP	Ghiselli (2006)
			< 0,0124	MG	Brandt et al. (2013)
			< 12,4 a < 41,3	MG	Queiroz et al. (2012)
			< 0,020 a 5,2	CE	Souza (2011)
	Ibuprofeno	Anti-inflamatório não esteroidal	54,2	SP	Ghiselli (2006)
	Paracetamol	Analgésico	18	SP	Ghiselli (2006)
	Sulfametoxazol	Antibiótico	< 0,0019 a 0,151	MG	Brandt et al. (2013) Queiroz et al. (2012)
	Trimetropina	Antibiótico	0,023 a 0,114	MG	Brandt et al. (2013) Queiroz et al. (2012)
Efluente de ETE	Bezafibrato	Antilipêmicos	1,0	RJ	Stumpf et al. (1999)
			< 4,3 a 309	MG	Brandt et al. (2013)
			< 4,3 a 249	MG	Queiroz et al. (2012)
	Diclofenaco	Anti-inflamatório não esteroidal	0,02 a 0,06	RJ	Stumpf et al. (1999)
			1,8	SP	Ghiselli (2006)
			< 0,007 a 0,755	MG	Brandt et al. (2013)
			< 0,4 a 1,9	CE	Souza (2011)
	Dipirona	Analgésico	23,7	SP	Ghiselli (2006)
			< 2,2 a 1,3	CE	Souza (2011)
	17 α-Etinilestradiol	Inibidor da ovulação	5,4	SP	Ghiselli (2006)
			< 0,0124	MG	Brandt et al. (2013) Queiroz et al. (2012)
			< 0,020 a 1,2	CE	Souza (2011)
	Ibuprofeno	Anti-inflamatório não esteroidal	48,4	SP	Ghiselli (2006)
	Paracetamol	Analgésico	5,9	SP	Ghiselli (2006)
	Sulfametoxazol	Antibiótico	< 0,0019 a 0,124	MG	Brandt et al. (2013)
			< 0,0019 a 0,161	MG	Queiroz et al. (2012)
	Trimetropina	Antibiótico	< 0,001 a 0,075	MG	Brandt et al. (2013)
			< 1 a 88	MG	Queiroz et al. (2012)

• ¹Classificação de acordo com Kolpin et al. (2002).

A presença de fármacos no esgoto tratado é determinante para a presença de tais contaminantes nos corpos d’água. Em uma revisão publicada por Carlsson et al. (2006), avaliou-se e classificou-se o risco ambiental de diversos produtos farmacêuticos, como diclofenaco, ciclofosfamida, enalapril, ibuprofeno e metformina. Das 27 substâncias testadas, nove (diclofenaco, etinilestradiol, ibuprofeno, metoprolol, noretisterona, oestriol, oxazepam, paracetamol e oxitetraciclina) foram consideradas perigosas para o ambiente aquático, considerando fatores como meia-vida, biodegradabilidade, ocorrência ambiental e estatísticas de vendas no país de estudo (Suécia).

Os estudos de monitoramento de fármacos em ETA são ainda incipientes, mas os dados divulgados na literatura sugerem que tais fármacos estão presentes em pequenas concentrações na água distribuída (Tabela 2). Assim, a presença desses compostos em mananciais de abastecimento ocorre com maior frequência e em maior concentração que nas águas distribuídas.

Tabela 2 -
Estudos sobre a ocorrência de fármacos de diversas classes em mananciais e águas tratadas em estações de tratamento de água (ETAs) brasileiras.

	Fármaco	Classe	Concentração (µg.L-1)	Estado	Referência
Águas de abastecimento	Ácido acetilsalicílico	Anti-inflamatório não esteroidal	12,21 a 20,96	SP	Raimundo (2007)
			0,5 a 21	SP	Montagner e Jardim (2011)
	Ácido clofíbrico	Principal metabólico de 3 antilipêmicos	0,02 a 0,03	RJ	Stumpf et al. (1999)
	Bezafibrato	Antilipêmicos	0,025	RJ	Stumpf et al. (1999)
	Cafeína	Estimulante	0,26 a 1,08	MG	Machado et al. (2016) Montagner e Jardim (2011) Raimundo (2007)
			1,73 a 2,57	RS
			0,02 a 0,25	SP
			1,1 a 41,5	SP
			0,2 a 127	SP
	Diclofenaco	Anti-inflamatório não esteroidal	2 a 6	SP	Ghiselli (2006)
			0,02 a 0,06	RJ	Stumpf et al. (1999)
			0,096 a 0,115	SP	Raimundo (2007)
			< 0,14 a 0,106	SP	Montagner e Jardim (2011)
	17 α-Etinilestradiol	Inibidor da ovulação	0,106 a 4,39	SP	Raimundo (2007)
			1,2 a 3,5	SP	Ghiselli (2006)
			0,002 a 0,054	MG	Moreira et al. (2009)
			0,005 a 0,064	MG	Moreira et al. (2011)
			< 0,17 a 4,3	SP	Montagner e Jardim (2011)
	Ibuprofeno	Anti-inflamatório não esteroidal	0,01	RJ	Stumpf et al. (1999)
			< 22,3	SP	Ghiselli (2006)
			< 0,51	SP	Montagner e Jardim (2011)
	Paracetamol	Analgésico	0,3 a 13,5	SP	Raimundo (2007)
			< 8,3	SP	Ghiselli (2006)
Água tratada	Cafeína1	Estimulante	0,12 a 2,8	RS	Machado et al. (2016)
			0,22	SP	Sodré et al. (2010)
	Diclofenaco	Anti-inflamatório não esteroidal	nd	SP	Ghiselli (2006)
	Paracetamol	Analgésico	nd
	Ibuprofeno	Anti-inflamatório não esteroidal	nd
	17 α-Etinilestradiol	Inibidor da ovulação	1,7	SP	Ghiselli (2006)
			nd	SP	Jardim et al. (2011)

• ¹Classificação de acordo com .); nd: não detectado.

Vale ressaltar que a simples presença de fármacos no ambiente não significa, per se, risco à saúde humana e/ou à biota aquática. Idealmente, uma avaliação toxicológica deve ser feita de forma preliminar ou conjunta ao monitoramento químico para avaliar o risco ambiental de tais micropoluentes. A adoção de avaliação toxicológica vai ao encontro da recomendação feita pela OMS (2011) de investigar possíveis efeitos aditivos ou efeitos sinérgicos de misturas de fármacos e outras substâncias de modo a precisar se há risco potencial à saúde humana decorrente da exposição a tais contaminantes. Os próximos itens apresentam os principais testes de toxicidade que podem ser utilizados para cumprir tal objetivo.

TESTES DE TOXICIDADE AQUÁTICA

Quando fármacos são liberados no ambiente por meio do lançamento de efluentes (industrial, rural ou doméstico), ou como resultado do descarte inadequado de drogas fora do prazo de validade, eles podem permanecer na forma original ou ser convertidos em produtos da transformação sob fotólise, oxidação e outros processos. Tanto os fármacos inalterados como os produtos da transformação podem ser bioativos e causar efeitos negativos em seres humanos e outros seres vivos (LI et al., 2015). Além disso, a poluição dos corpos d’água por fármacos e a ampla distribuição desses compostos no ambiente podem aumentar o risco de toxicidade, principalmente aos organismos aquáticos.

Com o intuito de investigar o risco decorrente da presença de poluentes ambientais, análises químicas e testes biológicos são continuamente desenvolvidos e empregados para quantificar os poluentes e avaliar os seus efeitos adversos (PARRELLA et al., 2013). Métodos analíticos são fundamentais para detectar e quantificar microcontaminantes no ambiente (BISTAN et al., 2012) enquanto os ensaios biológicos (in vitro ou in vivo) fornecem informações sobre os efeitos causados pelas substâncias no meio, servindo como uma complementação valiosa à análise química.

Os testes de toxicidade aguda e crônica são amplamente utilizados para avaliar os efeitos de substâncias sobre os organismos no ambiente aquático (COSTA et al., 2008; FERRARI et al., 2003; ISIDORI et al., 2005). Os testes de toxicidade aguda são utilizados para medir os efeitos de agentes tóxicos sobre espécies aquáticas durante um curto período de tempo em relação ao período de vida do organismo-teste e permitem a determinação de valores de concentração efetiva média (CE₅₀) e concentração letal média (CL₅₀) (COSTA et al., 2008). Por sua vez, testes de toxicidade crônica são realizados para medir os efeitos de substâncias químicas em espécies aquáticas por um período que pode abranger parte do ciclo de vida do organismo-teste ou todo esse ciclo, e os seus resultados são geralmente expressos como concentração de efeito não observado (CENO) ou concentração de efeito observado (CEO), mas também como CE₅₀ (COSTA et al., 2008).

Na literatura da área podem ser encontrados testes de toxicidade aquática, agudos e crônicos, empregados para avaliar o potencial tóxico de diversas classes de fármacos com organismos-teste distintos, como visto na Tabela 3.

Tabela 3 -
Valores de CL₅₀ e concentração efetiva média (CE₅₀) obtidos para fármacos em testes de toxicidade aguda e crônica.

Organismo/Teste	Efeito	Classe	Fármacos (s)	Concentração (mg.L-1)	Referência
Testes de Toxicidade Aguda
Ankistrodesmus fusiformis	EC50 para inibição do crescimento	Antibióticos de uso veterinário	Clortetraciclina Oxitetraciclina Enrofloxacina	3,23 7,15 10,6	Magdaleno, Carusso e Moretton (2017)
Atyaephyra desmarestii	CL50 em 96h	Anti-inflamatório/analgésico	Diclofenaco Ibuprofeno	6,4 10,1	Nieto et al. (2016)
		Antiepilético	Carbamazepina	66,4
Brachionus calyciflorus	CL50 em 24h	Antibiótico	Eritromicina/Sulfametoxazol Ofloxacino/Lincomicina Claritromicina	27,53/26,27 29,88/24,94 35,46	Isidori et al. (2005)
Ceriodaphnia dubia	EC50 para imobilização em 48h	Anti-inflamatório	Diclofenaco	0,02	Ferrari et al. (2003)
		Antibióticos	Eritromicina/Sulfametoxazol Ofloxacino/Lincomicina Claritromicina	10,23/15,51 17,41/13,98 18,66	Isidori et al. (2005)
Daphnia magna	CL50 em 24h	Antiepilético Anti-inflamatório Antimicrobiano	Carbamazepina Diclofenaco Triclosan	Nd Nd 0,35	Rozas et al. (2016)
	CL50 em 48h			Nd 18,8 0,19
	EC50 para imobilização em 24h	Antibióticos	Eritromicina/Sulfametoxazol Ofloxacino/Lincomicina Claritromicina	22,45/25,20 31,75/23,18 25,72	Isidori et al. (2005)
	EC50 para imobilização em 48h	Anti-inflamatório/analgésico	Diclofenaco	0,22	Ferrari et al. (2003)
			Ibuprofeno Naproxeno	108,0 174,0	Cleuvers (2003)
		Anti-hipertensivo	Captopril	>100,0
		Antilipêmico	Ácido clofíbrico	72,0
				>0,20	Ferrari et al. (2003)
Desmodesmus subspicatus	EC50 para inibição da taxa de crescimento	Anti-inflamatório/analgésico	Ibuprofeno Diclofenaco Naproxeno	315,0 72,0 > 320	Cleuvers (2003)
		Anti-hipertensivo	Captopril	168,0
		Antilipêmico	Ácido clofíbrico	115,0
Testes de toxicidade aguda
Lemna minor	EC50 para inibição da taxa de crescimento	Anti-inflamatório Analgésico	Ibuprofeno Diclofenaco Naproxeno	22,0 7,5 24,2	Cleuvers (2003)
		Anti-hipertensivo	Captopril	25,0
		Antilipêmico	Ácido clofíbrico	12,5
Pseudokirchneriella subcapitata	EC50 para inibição do crescimento	Antibióticos de uso veterinário	Clortetraciclina Oxitetraciclina Enrofloxacina	1,19 0,92 5,18	Magdaleno, Carusso e Moretton (2017)
Vibrio fischeri	EC50 para redução da luminescência	Antibióticos	Eritromicina Sulfametoxazol Ofloxacino Lincomicina Claritromicina	Sem efeito até 100 23,30 25% inibição a 100 sem efeito até 100 sem efeito até 100	Isidori et al. (2005)
		Anti-inflamatório	Diclofenaco	0,01	Ferrari et al. (2003)
Testes de toxicidade crônica
Brachionus calyciflorus	Alteração da reprodução após 48h	Anti-inflamatório	Diclofenaco	CENO 0,012 CEO 0,025	Ferrari et al. (2003)
	Inibição do crescimento em 48h	Antibióticos	Eritromicina/Sulfametoxazol Ofloxacino/Lincomicina Claritromicina	0,94/9,63 0,53/0,68 12,21	Isidori et al. (2005)
Ceriodaphnia Dubia	Inibição da reprodução após sete dias	Anti-inflamatório	Diclofenaco	CENO 0,001 CEO 0,002	Ferrari et al. (2003)
	Inibição do crescimento após sete dias	Antibióticos	Eritromicina/Sulfametoxazol Ofloxacino/Lincomicina Claritromicina	0,22/0,21 3,12/7,20 8,16	Isidori et al. (2005)
Pseudokirchneriella subcapitata	Inibição do crescimento após 96h de exposição	Anti-inflamatório	Diclofenaco	CENO 0,01 CEO 0,02	Ferrari et al. (2003)
	Inibição do crescimento em 72h	Antibióticos	Eritromicina/Sulfametoxazol Ofloxacino/Lincomicina Claritromicina	0,020/0,52 1,44/0,07 0,0020	Isidori et al. (2005)

• CE₅₀; Nd: Não determinado; CENO: concentração de efeito não observado; CEO: concentração de efeito observado.

Isidori et al. (2005) adotaram diversos testes de toxicidade aguda e crônica para avaliar os efeitos de diferentes antibióticos (Tabela 3). Segundo os autores, os ensaios crônicos são mais apropriados para detectar os impactos de fármacos em relação aos agudos, pois os efeitos foram constatados em concentrações de fármacos na ordem de µg.L^-1, enquanto os agudos, somente na ordem de mg.L^-1.

Além disso, a escolha do organismo a ser usado pode influenciar na informação gerada. Por exemplo, Ferrari et al. (2003), avaliando a toxicidade aguda do diclofenaco com a bactéria marinha Vibrio fischeri e os crustáceos Daphnia magna e Ceriodaphnia dubia, revelaram que a bactéria marinha foi mais sensível ao fármaco quando comparada com os demais, enquanto o teste de toxicidade crônica revelou que das espécies estudadas a C. dubia foi a mais sensível (Tabela 3).

Testes de toxicidade aguda foram empregados com o microcrustáceo D. magna, a alga Desmodesmus subspicatus e a macrófita Lemna minor para diferentes fármacos (CLEUVERS, 2003) (Tabela 3). Os efeitos dos fármacos foram classificados de acordo com as diretrizes da Comissão das Comunidades Europeias (1996) (EU-Directive 93/67/EEC), que consideram um composto muito tóxico quando o valor de CE₅₀ é menor que 1 mg.L^-1; tóxico, de 1 a 10 mg.L^-1; e perigoso, de 10 a 100 mg.L^-1. Com base nessa classificação, nenhum composto foi muito tóxico para as espécies analisadas. No geral, a toxicidade dos fármacos testados foi heterogênea entre as espécies, e a macrófita foi a mais sensível com base nos valores de CE₅₀. CLEUVERS destacou ainda que, embora os efeitos agudos sejam algumas vezes improváveis quando os compostos são testados individualmente, o estudo da combinação dos efeitos é um fator de extrema importância, mesmo quando a toxicidade da substância é baixa, para obter uma melhor avaliação do potencial ecotoxicológico das substâncias no ambiente aquático.

Segundo a classificação EU-Directive 93/67/EEC supracitada, Nieto et al. (2016) observaram que o diclofenaco é tóxico para o crustáceo Atyaephyra desmarestii e que o ibuprofeno e a carbamazepina são perigosos. A resposta letal (CL₅₀) foi avaliada a 25 (Tabela 3) e a 20ºC e indicou que o aumento da temperatura pode maximizar a toxicidade aos organismos aquáticos.

Rozas et al. (2016) avaliaram a toxicidade aguda de fármacos individualmente e em mistura - no segundo caso, após tratamento com UV/H₂O₂. A CL₅₀ em D. magna foi determinada para os fármacos diclofenaco e triclosan (Tabela 3). A utilização de um processo oxidativo avançado como UV/H₂O₂ para amostras de água foi justificada pelo fato de métodos tradicionais de tratamento não serem eficientes para a remoção de fármacos. Dada a possibilidade de formação de subprodutos nesses processos, os autores avaliaram ainda os efeitos das misturas de fármacos após tratamento com UV/H₂O₂. Os dados obtidos indicaram que os subprodutos da oxidação podem ser mais tóxicos que o fármaco individualmente. Além disso, observou-se que na mistura contendo triclosan houve 100% de imobilização de D. magna antes e depois do tratamento com UV/H₂O_2.

A diferença na resposta entre espécies também foi constatada por Magdaleno, Carusso e Moretton (2017), que testaram a toxicidade de antimicrobianos em duas espécies de algas. Embora todos os fármacos testados tenham inibido o crescimento algal, a alga Pseudokirchneriella subcapitata foi a mais sensível (Tabela 3). Segundo Sanderson et al. (2004), antibióticos são considerados os fármacos mais perigosos, uma vez que podem levar à resistência microbiana, o que, segundo a OMS (2016), se configura como uma séria ameaça à saúde pública global e requer ação de setores governamentais e de toda a sociedade.

TESTES DE GENOTOXICIDADE

Uma ferramenta para avaliar o potencial genotóxico de compostos é a aplicação do teste SOS cromoteste, que utiliza bactérias Escherichia coli geneticamente modificadas, denominadas de PQ37. O teste in vitro é um ensaio colorimétrico que se baseia na expressão da enzima β-galactosidase e na resposta aos ataques de mutagênicos pela exclusão da capacidade de reparo de ácido desoxirribonucleico (DNA) (DEODATO, 2009). Isidori et al. (2005) testaram a genotoxicidade de antibióticos e observaram resposta positiva apenas para a ofloxacina no SOS cromoteste (Tabela 4).

Tabela 4 -
Resultados de testes de genotoxicidade e citotoxicidade para fármacos.

Organismo-teste	Efeito	Classe	Fármaco(s)	Concentração (mg.L-1)	Parâmetro	Referência
Testes de genotoxicidade
Allium cepa	Alteração cromossômica e da divisão celular	Antirretrovirais	Zidovudina Nevirapina	170 250	-	Onwuamah et al. (2014)
Teste cometa	Formação do cometa	Antibiótico	Trimetropina	25-150 µg/mL	-	Abou-Eisha (2006)
		Estimulante	Cafeína	0,0003-0,03	-	Santos-Silva, Montagner e Martinez (2018)
Teste de micronúcleos	Formação de micronúcleos	Antibiótico	Adriamicina	Efeitos com 15 mg	-	Al-Harbi (1993)
		Anticâncer	Ciclofosfamida	Efeitos com 50 mg	-	Hosseinimehr & Karami (2005)
		Anti-inflamatório	Indometacina	Efeitos com 36 mg	-	Devi e Polasa (1987)
		Antibiótico de uso veterinário	Enrofloxacina	1-10	-	Magdaleno, Carusso e Moretton (2017)
Escherichia coli PQ37	Mudança da cor do meio	Antibiótico	Eritromicina Sulfametoxazol Ofloxacino Lincomicina Claritromicina	-	0,84 ± 0,06* 1,63 ± 0,18 78 ± 7,21 1,46 ± 0,08 1,20 ± 0,17	Isidori et al. (2005)
Salmonella typhimurium TA98 / TA100	Deslocamento do quadro de leitura / Substituição dos pares de bases	Antibiótico	Sulfametoxazol Ofloxacino Lincomicina	-	2,7 ± 0,95**/0,2 ± 0,09 130,8 ± 18,23 / ns 2,9 ± 1,13/0,3 ± 0,14	Isidori et al. (2005)
Troca entre cromátides-irmãs	Dano no DNA pela recombinação mitótica	Anti-inflamatório	Ibuprofeno Ketoprofeno Naproxeno Paracetamol	-	50-100 mg/kg 50-100 mg/kg 100 mg/kg 50-400 mg	Philipose et al. (1997)
Testes de citotoxicidade
Teste lactato desidrogenase (LDH)	Oxidação de NADH a NAD+	Antiarrítmico	Amiodarona	7,2 µM-2,5 mM	-	Dzimiri e Almotrefi (1993)
Ensaio do MTT	Viabilidade celular/citotoxicidade	Anti-inflamatório	Indometacina, ketoprofeno, ibuprofeno etc.	10 µM	-	Allen et al. (1991)

• DNA: ácido desoxirribonucleico; NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida; NAD⁺: nicotinamida adenina dinucleotídeo oxidada; *fator de indução; **revertentes/µg; ns: número de revertentes não significante.

O teste com Allium cepa baseia-se no contato direto de raízes da cebola com as amostras contendo os compostos tóxicos, com o objetivo de avaliar a citogenotoxicidade medida pelas alterações cromossômicas e de divisão das células meristemáticas dessa estrutura vegetal. Um estudo com as drogas antirretrovirais zidovudina e nevirapina demonstrou que os dois fármacos inibem o crescimento em comprimento da raiz, além de induzirem mudanças no índice mitótico e aberrações cromossômicas em A. cepa (ONWUAMAH et al., 2014), conforme apresentado na Tabela 4.

O ensaio cometa é um teste toxicogenético para avaliar lesões genômicas. Células com o DNA danificado apresentam o formato de um cometa quando colocadas em agarose e submetidas à eletroforese (TICE et al., 2000). O antibiótico trimetropina foi testado quanto ao seu potencial de induzir danos no DNA. Percebeu-se esse efeito em linfócitos humanos em concentrações específicas, como mostrado na Tabela 4 (ABOU-EISHA, 2006). Já a cafeína induziu danos no DNA de eritrócitos do peixe Prochilodus lineatus, e o aumento do dano foi proporcional à concentração do fármaco (SANTOS-SILVA; MONTAGNER; MARTINEZ, 2018).

Um teste para avaliar a presença e a extensão de danos cromossômicos em células expostas a agentes genotóxicos é o de micronúcleos (MN) (BONASSI et al., 2007; HOSSEINIMEHR; KARAMI, 2005). Efeitos mutagênicos, expressos pela formação de micronúcleos, já foram observados com os antibióticos adriamicina (AL-HARBI, 1993), ciclofosfamida (HOSSEINIMEHR; KARAMI, 2005) e indometacina (DEVI; POLASA, 1987) (Tabela 4). Magdaleno, Carusso e Moretton (2017) avaliaram a genotoxicidade de antibióticos de uso veterinário pelo teste de MN. Dos fármacos testados, apenas a enrofloxacina induziu à formação de MN em células de A. cepa (Tabela 4).

Por sua vez, para avaliação da mutagenicidade, o teste de troca entre cromátides-irmãs (TCI), traduzido do inglês, sister chromatid exchange assay (SCE), tem sido aplicado. O ensaio identifica o potencial de mutagenicidade cromossômica de agentes químicos por meio do dano no DNA (STULTS; KILLEN; PIERCE, 2014) pela recombinação mitótica. Uma investigação do potencial do analgésico paracetamol de induzir danos no DNA em células da medula óssea de camundongos demonstrou que, além de provocar aberrações cromossômicas, tal fármaco aumentou a frequência da troca entre cromátides-irmãs (GIRI; SIVAM; KHAN, 1992). Tal efeito também foi notado para três diferentes anti-inflamatórios (ibuprofeno, naproxeno e cetoprofeno) usando células da medula óssea (PHILIPOSE et al., 1997) (Tabela 4).

O ensaio Salmonella/microssoma (teste de Ames) também é amplamente utilizado para avaliar a mutagenicidade de diversos compostos, entre eles fármacos, utilizando cepas da bactéria Salmonella typhimurium. O analgésico dipirona já foi avaliado pelo teste de Ames com cepas TA98 e TA100 da referida bactéria (IZUMI et al., 1991), o que mostrou que a dipirona é fracamente mutagênica para a cepa TA100 na presença e na ausência de metabolização. Isidori et al. (2005) testaram a mutagenicidade de seis antibióticos pelo teste de Ames e, entre eles, três foram mutagênicos (Tabela 4). Sulfametoxazol e lincomicina induziram à atividade mutagênica nas cepas TA98 e TA100, enquanto ofloxacina foi mutagênica apenas na cepa TA98.

TESTES DE CITOTOXICIDADE

Um dos métodos para avaliar a citotoxicidade envolve a quantificação dos danos e da integridade da membrana celular. Quando uma célula é danificada, ocorre liberação da enzima intracelular lactato desidrogenase (LHD) para o sobrenadante celular, resultando em diminuição da viabilidade celular. O efeito do fármaco amiodarona (antiarrítmico) sobre a liberação de LDH em mitocôndrias demonstrou que a substância inibiu a atividade dessas enzimas com uma relação dose-dependente, expondo sua citotoxicidade por meio de danos na membrana (DZIMIRI; ALMOTREFI, 1993) (Tabela 4).

Para avaliar a citotoxicidade de compostos individuais ou misturas complexas, por meio da conversão celular de um substrato em produto cromogênico, o ensaio colorimétrico denominado de MTT foi desenvolvido por Mosmann (1983) e é possivelmente um dos mais versáteis e empregados na literatura. O ensaio baseia-se na medida do dano induzido pelo composto/extrato no metabolismo celular de glicídios, usualmente pela avaliação da atividade de desidrogenases mitocondriais. Essas enzimas são funcionais apenas em células vivas e reduzem bioquimicamente o MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H tetrazolato de bromo) ao produto violácea e insolúvel em água conhecido como formazan (1-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-3,5-difenilformazan), que pode ser quantificado pela colorimetria.

O ensaio do MTT foi empregado por Allen et al. (1991) para avaliar a citotoxicidade de oito anti-inflamatórios não esteroidais (indometacina, ácido mefenâmico, cetoprofeno, ibuprofeno, sulindaco, aspirina, fenilbutazona e naproxeno) em células de adenocarcinoma ileocecal humana (HCT-8). Os anti-inflamatórios foram testados em concentrações de 10 µM a 10 mM, e foi observado que até 1 mM nenhum dos fármacos induziu a efeitos citotóxicos, embora todos eles tenham induzido a efeitos tóxicos na maior concentração testada (10 mM) (Tabela 4).

CONCLUSÕES

Embora a presença de fármacos no ambiente tenha sido relatada por diferentes grupos de pesquisa em diversos países, informações sobre os seus efeitos adversos em diferentes organismos e, principalmente, as concentrações consideradas limiares são ainda incipientes. Foram apresentadas neste trabalho as concentrações de fármacos quantificados em águas e efluentes brasileiros e compiladas informações sobre a toxicidade de tais contaminantes em nível aquático, celular e genético. Com base nisso, concluiu-se que as concentrações tóxicas observadas, equivalentes a CE₅₀ ou CL₅₀, foram de 10 a 100 vezes maiores que aquelas achadas no ambiente. Ainda, considerando os ensaios citotóxicos e genotóxicos, em sua maioria, viu-se que os fármacos na concentração usualmente encontrada no ambiente não apresentaram toxicidade significativa. Ensaios crônicos com elevada sensibilidade são os mais apropriados para investigar os riscos associados à presença de fármacos (ou de seus subprodutos) no ambiente. A baixa disponibilidade de dados relacionados ao efeito crônico dos fármacos sugere dificuldade em aplicar tais testes no monitoramento de amostras ambientais, uma vez que nesse caso os efeitos se referem à exposição prolongada e a doses cumulativas do agente.

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• 1
  Reg. ABES: 183632

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Abr 2020
• Data do Fascículo
  Mar-Apr 2020

Histórico

• Recebido
  04 Ago 2017
• Aceito
  26 Fev 2019