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Ciência e Agrotecnologia

versão impressa ISSN 1413-7054

Ciênc. agrotec. vol.27 no.5 Lavras out. 2003

https://doi.org/10.1590/S1413-70542003000500008 

AGRONOMIA

 

Inoculação de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli em sementes de feijoeiro através de restrição hídrica 1

 

Inoculation of bean seeds with Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli through water restriction technique

 

 

Maria Luiza Nunes Costa I; José da Cruz Machado II; Renato Mendes Guimarães III; Edson Ampélio Pozza II; Dênis Oride IV

I Engenheiro Agrônomo, Estudante de Pós-Graduação em Agronomia/Fitopatologia UFV
II Professores do Departamento de Fitopatologia da UFLA
III Professor do Setor de Sementes da UFLA
IV Engenheiro Agrônomo, bolsista de aperfeiçoamento

 

 


RESUMO 

Em diversos estudos sobre a associação de Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli com sementes de feijoeiro, há necessidade de obtenção de sementes infectadas, inclusive com graus de incidência diferenciados. Assim, objetivou-se com este trabalho testar a metodologia de inoculação de Fusariumoxysporum f. sp. phaseoli em sementes de feijoeiro utilizando meio batata-sacarose-ágar (BSA) adicionado com solutos que proporcionam restrição hídrica ao meio, permitindo o crescimento do fungo e inibindo a germinação das sementes. Foram utilizados os solutos sacarose, cloreto de potássio e manitol, adicionados ao meio BSA para obter os potenciais osmóticos de 0,8, -1,0, -1,2 MPa, e diferentes tempos de exposição das sementes ao fungo (36, 72, 108 e 144 h). Para avaliar os efeitos da colonização fúngica nas sementes, utilizaram-se testes de germinação e sanidade (blotter-test). O crescimento micelial do fungo foi avaliado in vitro, não havendo inibição em nenhum dos potenciais hídricos e solutos utilizados, observando-se maior crescimento nos potenciais osmóticos de 0,8 e -1,0 MPa. Nos maiores períodos de tempo, 108 e 144 h, o crescimento micelial foi maior, afetando o desempenho das sementes. Dos solutos utilizados, o KCl proporcionou a maior incidência média (64%) de sementes com Fusariumoxysporum f. sp. phaseoli. Quando as sementes permaneceram por 144 h sobre o mesmo soluto, a incidência foi de 70%.

Termos para indexação: colonização, fungo, solutos, sacarose, cloreto de potássio, manitol, potencial osmótico.


ABSTRACT  

The objective of the present work was to test methodology of inoculation of bean seeds with Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli using water restriction technique. For that, three solutes, sucrose, potassium chloride and manitol, added to the medium potato-sucrose-agar, PSA at three water potentials (-0.8, -1.0, -1.2 MPa) and four duration periods of the exposition of seeds to the fungus (36, 72, 108 and 144h) were used. The effects of the fungus on the performance of the seeds and emerged plants were evaluated looking at germination and health (blotter-test). The mycelial growth of the fungus in vitro, was not reduced by any osmotic treatment. Higher growth of the fungus was observed at osmotic potentials of -0.8 e -1.0 MPa. At longer durations of exposition of the seeds to the pathogen, 108 e 144h, mycelial growth of the fungus was higher and affected seed performance. The greatest mean incidence of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (64%) was detected on seeds in wich KCl was used. At 144h of inoculation period on that solute, the incidence was of 70%.

Index terms: Colonization, fungi, sucrose, potassium chloride, mannitol, osmotic potential.


 

 

INTRODUÇÃO

O feijoeiro comum (Phaseolusvulgaris L.) é um dos principais alimentos da dieta da população brasileira, sendo uma importante fonte de proteina e apresentando uma boa adaptação em diferentes condições climáticas.

A ocorrência de determinados patógenos nas sementes, mesmo em taxas relativamente baixas, pode gerar grandes perdas na produção, como é o caso de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli, agente etiológico da murcha ou amarelecimento de Fusarium em feijoeiro. A incidência desse fungo nas sementes de feijoeiro produzidas em algumas regiões do país vem aumentando nos últimos anos (Leal e Bolkan, 1981; Nunes JÚNIOR e Menten, 1985; Menezes et al., 1981; Santos et al., 1996), em razão do uso, por parte dos produtores, de grãos em substituição às sementes (Pereira e Yokoyama, 1999). Nesses casos, além da baixa germinação e vigor, as sementes possuem baixa qualidade sanitária.

Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (Fop) é um microrganismo que sobrevive no solo, sendo transmitido por sementes, sobrevivendo em seu interior, em impurezas associadas às sementes e em restos de cultura (Kendrick e Snyder, 1942; Machado, 1999). Dessa forma, o controle da referida doença torna-se extremamente difícil e, muitas vezes, impossibilitado. Do ponto de vista epidemiológico, a associação desse fungo com sementes é um fato relevante, sendo responsável pela introdução e disseminação de inóculo inicial entre regiões de cultivo.

Muitos fungos transmitidos por sementes iniciam suas atividades por ocasião da semeadura, os quais podem resultar em diminuição do estande e/ou tombamento de pré ou pós-emergência (Agarwal e Sinclair, 1987; Menten, 1991).

A diagnose preventiva no estádio de sementes, assim como o tratamento das mesmas visando ao controle do inóculo infectivo são medidas que podem, portanto, auxiliar em grande escala o combate a esse tipo de doença.

Para auxiliar os estudos de Fop associados às sementes, há necessidade, porém, de disponibilização das mesmas com o inóculo, inclusive em graus de incidência diferenciados. Em estudo de detecção do patógeno na semente, de avaliação de fungicida no controle da transmissão do patógeno pelas sementes, de ensaio de melhoramento visando à resistência ou tolerância ao patógeno (Agarwal e Sinclair, 1987) e de comportamento epidemiológico de doenças transmitidas por sementes, poder-se-á utilizar essa metodologia para obtenção das sementes infestadas.

A metodologia de inoculação de fungos em sementes  sobre  meio  de  cultura  batata-dextrose-ágar (BDA), utilizando a técnica de restrição hídrica, foi empregada por Carvalho (1999), para a obtenção de sementes de feijoeiro com Colletotrichum lindemuthianum. A técnica de restrição hídrica foi avaliada em testes de sanidade (blotter test) visando a substituir o uso de 2,4-D e em meio sólido, para inibir a germinação das sementes de feijão, arroz (Coutinho, 2000) e algodão (Machado, 2002) sendo observada a inibição da germinação das sementes, sem efeito estimulante ou inibitório, no desenvolvimento do fungo, quando comparado às metodologias padronizadas.

A avaliação da influência da restrição hídrica no crescimento fúngico tem sido realizada utilizando meio sólido controlado osmoticamente (Cook e Duniway, 1981; Wearing e Burgess, 1979; Chandler et al., 1994; Alam et al., 1996; Adebayo e Harris, 1971; Brownell e Schneider, 1985). O crescimento micelial de Fusarium é, em geral, intensificado em meios de cultura com menores potenciais osmóticos, havendo crescimento normal até -3,0 MPa (Manandhar e Bruehl, 1973).

Conduziu-se este trabalho com o objetivo de obter sementes de feijoeiro infectadas por Fop usando a técnica de restrição hídrica como metodologia de inoculação, pois na inoculação por meio de restrição hídrica, as sementes podem ser infectadas, já que permanecem por período maior de tempo em contato com o fungo, em comparação com a técnica de inoculação por meio de embebição das sementes em suspensão de conídios.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Foram realizadas inoculações de sementes de feijoeiro, com Fop utilizando como substrato batata-sacarose-ágar (BSA) modificado (com restrição hídrica) com três solutos (sacarose, cloreto de potássio e manitol), que proporcionam restrição hídrica em meio sólido.

Nos testes de crescimento micelial, utilizou-se o delineamento experimental inteiramente casualizado, com 4 repetições em esquema fatorial 3 x 3, combinando soluto (sacarose, cloreto de potássio e manitol) com potencial osmótico (-0,8, -1,0, -1,2 MPa), sendo testemunha o crescimento em meio BSA. E nos testes de germinação e sanidade, utilizou-se o delineamento experimental em blocos casualizados com esquema fatorial 3 x 3 x 4 + 4, no qual combinaram-se soluto (sacarose, KCl e manitol), potencial (-0,8, -1,0 e -1,2 MPa), tempo (36, 72, 108 e 144 horas) de incubação e tratamento adicional (sementes inoculadas nos tempos 36, 72, 108 e 144h em meio BSA).

Obtenção de isolados de Fop e das sementes de feijoeiro

Os isolados de Fop utilizados no trabalho foram obtidos de sementes de feijoeiro, sendo as culturas puras do patógeno mantidas em meio Synthetic Nutrient Agar (SNA), (Niremberg, 1981). Os isolados foram mantidos a 10ºC em tubos contendo mistura de solo-areia-composto orgânico, previamente esterilizados, sendo utilizado para inoculação o isolado que se mostrou mais patogênico ao feijoeiro no teste de patogenicidade, realizado de acordo com Rava et al. (1996).

Foram utilizadas sementes de feijoeiro  (cv. Carioca), safra 1999, sendo sua qualidade fisiológica avaliada de acordo com as Regras de Análise de Sementes (Brasil, 1992). A qualidade sanitária das sementes foi verificada por blotter-test (Machado, 1988).

Inoculação das sementes com Fusariumoxysporum f. sp. phaseoli

O inóculo do patógeno foi cultivado em meio de aveia para obtenção de uma suspensão de conídios. Essa suspensão foi calibrada para a concentração de 106 conídios/ml e 1 ml foi espalhado em placas de Petri de 15 cm de diâmetro, contendo 40 ml de meio BSA modificado. As placas foram acondicionadas em incubadora, regulada à temperatura de 25ºC e fotoperíodo de 12 horas. Após o crescimento micelial do fungo por cinco dias, foram colocadas aproximadamente 125 sementes, previamente esterilizadas com hipoclorito de sódio 1% por 1 minuto, em cada placa, e novamente incubadas nas mesmas condições. As sementes permaneceram sobre a colônia fúngica por 4 períodos de tempo (36, 72, 108 e 144 h) para cada soluto e concentração.

O meio com restrição hídrica foi preparado pela adição dos solutos sacarose, cloreto de potássio e manitol ao BSA, e para cada soluto, foram utilizadas três concentrações diferentes, de modo a proporcionar potenciais osmóticos de -0,8, -1,0 e -1,2 MPa. O cálculo das concentrações dos solutos foi realizado pelo software SPPM (Michel e Radcliffe, 1995).

Após o término dos períodos de incubação das sementes a Fop, essas foram retiradas das placas e distribuídas sobre papel de filtro, em temperatura ambiente, para retornarem ao teor de umidade inicial. Após três dias, as sementes foram colocadas em sacos de papel e armazenadas em câmara fria, onde permaneceram até o momento das avaliações.

Avaliação da metodologia de restrição hídrica em meio agarizado para inoculação de sementes de feijoeiro com Fop                

A eficiência da metodologia de inoculação do Fop em sementes de feijoeiro, utilizando meio de cultura BSA contendo os solutos para obter diferentes potenciais osmóticos, foi avaliada considerando-se os parâmetros: a) crescimento micelial; b) teste de sanidade e c) porcentagem de germinação.

O crescimento micelial foi realizado utilizando o meio BSA modificado em placas de Petri de 10 cm de diâmetro. Ao centro, colocou-se um disco de 5 mm de diâmetro, do fungo cultivado por 7 dias, à temperatura de 20ºC e fotoperíodo de 12 h. Em seguida, as placas foram acondicionadas em incubadora regulada a 25ºC, com fotoperíodo de 12 horas, durante 8 dias. O crescimento micelial foi medido diariamente pelo diâmetro médio das colônias e o cálculo do índice de crescimento micelial (ICM) do fungo foi realizado de acordo com Oliveira (1991) nas diferentes combinações de solutos, concentrações e tempo de incubação.

A sanidade foi avaliada utilizando o blotter-test, sendo as sementes incubadas em placas de Petri de 15 cm de diâmetro, contendo três folhas de papel de filtro esterilizadas e umedecidas com água destilada esterilizada. Adicionou-se o sal de ácido 2,4-diclorofenoxiacético,  concentração  de  10 ppm, à água destilada para evitar a germinação das sementes no período de incubação. As placas foram mantidas em câmara de crescimento sob luz negra (radiação na faixa de 320-400 nm), com fotoperíodo de 12 h, à temperatura de 20ºC ± 2ºC, num período de 7 dias.

A observação das sementes para identificação da micoflora foi realizada com o auxílio do microscópio estereoscópico, e quando necessário, utilizou-se o microscópio ótico para confirmação das estruturas do fungo.

O teste de germinação em rolo de papel foi conduzido com 4 repetições de 50 sementes em papel germitest (papel-toalha) umedecido com água destilada esterilizada, 2,5 vezes o peso do papel seco, em germinador regulado à temperatura constante de 25ºC + 2º. As avaliações foram realizadas seguindo os critérios estabelecidos pelas Regras para Análise de Sementes.

As análises estatísticas dos experimentos foram realizadas utilizando os programas SISVAR e SAS. O contraste de médias para comparar as médias dos tratamentos com a testemunha dos parâmetros avaliados foi o teste de t. As médias entre os tratamentos foram comparadas pelo teste Scott-Knott ou regressão, de acordo com a natureza dos dados, quantitativos ou qualitativos. Nas equações de regressão realizadas, foram calculados os pontos de máximo das curvas.

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O crescimento micelial de Fop não foi afetado pelos diferentes solutos, mas sim pelos diferentes potenciais de restrição hídrica de cada soluto. A adição de sacarose, cloreto de potássio e/ou manitol até o potencial osmótico -0.92 MPa provocou estímulo do crescimento do fungo em relação à testemunha, mas a partir desse potencial, o crescimento de Fop foi decrescente (Figura 1). Esses resultados de crescimento in vitro de Fop estão de acordo com os trabalhos anteriores de Wearing e Burgess (1979) e Manandhar e Bruehl (1973), que relatam estímulo ao crescimento micelial de Fusarium em meio de cultura com a diminuição do potenciais hídrico, até um valor limitante.

A porcentagem de germinação das sementes é inversamente proporcional à colonização de Fop nas mesmas; portanto, a maior porcentagem de germinação das sementes da testemunha, após inoculação com Fop, parece ser devida ao aumento do crescimento do fungo sobre as sementes que proporcionaram os tratamentos de restrição hídrica. Por meio desses dados, observou-se variação na germinação das sementes ao utilizar diferentes solutos e tempos de exposição das sementes ao fungo, ocorrendo diminuição da germinação à medida que aumentou o tempo de permanência das sementes sobre o fungo (Figura 2).

Nos testes de germinação, as sementes de feijoeiro inoculadas em substrato contendo cloreto de potássio foram colonizadas intensamente porFop. De acordo com Brownell & Schneider (1985), íons de potássio são facilmente acumulados pelas células microbianas, estimulando o seu desenvolvimento. Esse fato parece ter sido reproduzido no presente estudo.

A interação entre soluto e potencial foi significativa, havendo redução da germinação de sementes inoculadas apenas no potencial -1.2 MPa utilizando meio modificado com KCl (Tabela 1). Porém, o uso de potenciais osmóticos diferenciados não foi determinante ao estímulo do crescimento fúngico sobre as sementes

A incidência de Fop foi superior nas sementes de feijoeiro inoculadas que utilizaram meio BSA modificado que em meio BSA. Foram observadas diferenças significativas entre os solutos utilizados, sendo a maior porcentagem de infecção de Fop nas sementes obtida com KCl (Tabela 2). não houve diferenças significativas na incidência de Fop nas sementes, entre os diferentes potenciais osmóticos utilizados.

A incidência de Fop nas sementes de feijoeiro após inoculação pelo método de restrição hídrica foi elevada, o que pode ser observado nos resultados de germinação e incidência do fungo. Utilizando a mesma metodologia, mas inoculando Colletotrichun lindemuthianum em sementes de feijoeiro, Carvalho (1999) obteve alta porcentagem do fungo nas sementes inoculadas em meio com restrição hídrica.                 

Nas avaliações das sementes que permaneceram por maiores períodos de tempo em contato com o fungo, a germinação foi ainda menor, pois aumentando esses períodos, conseqüentemente, aumentou-se a incidência do fungo nas mesmas (Figura 3).

 

 

Na figura 3, valores em torno de 60% de Fop podem ser observados quando foram utilizados meios BSA+KCl em incubação de 72h e/ou BSA+sacarose por 108h. Verifica-se então que a incidência de Fop nas sementes é variável de acordo com a combinação soluto e tempo de incubação.

A permanência das sementes sobre o Fop em meio sólido, sem ocorrência de germinação das mesmas, por tempo prolongado (144 h) foi possível em razão da adição de solutos ao substrato, promovendo restrição hídrica. Portanto, essa técnica favoreceu a obtenção de sementes de feijoeiro comum com incidência diferenciada de Fop, de acordo com o tempo de incubação.

 

CONCLUSÕES

a) A  inoculação  das  sementes  de  feijoeiro por  meio  da  técnica  de  restrição  hídrica  possibilita  a  obtenção  de  sementes  portadoras  de  F. oxysporum f. sp. phaseoli em níveis diferenciados de infecção.

b) Os solutos sacarose, cloreto de potássio e manitol proporcionaram restrição hídrica ao meio sólido BSA, suficientes para inibir a germinação das sementes durante a colonização por F. oxysporum f. sp. phaseoli.

c) O fungo F. oxysporum f. sp. phaseoli não teve seu crescimento inibido pelos solutos utilizados durante a colonização das sementes de feijoeiro.

d) A variação nos potenciais osmóticos utilizados não acarretou mudanças significativas na colonização fúngica das sementes pelo  F. oxysporum  f. sp. Phaseoli, podendo, portanto, ser utilizado o maior potencial osmótico, -0,8 MPa.

e) Maiores períodos de incubação das sementes proporcionaram maior porcentagem de sementes colonizadas, havendo, conseqüentemente, diferentes níveis de infestação.

 

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1 Parte da tese apresentada a Universidade Federal de Lavras/UFLA Caixa Postal 37 37200-000 Lavras, MG, pelo primeiro autor, para obtenção do grau de mestre em Agronomia na área de Fitopatologia.

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