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Crescimento micelial e parasitismo de Paecilomyces lilacinus sobre ovos de Meloidogyne paranaensis em diferentes temperaturas"in vitro"

"In vitro" mycelial growth and parasitism of Paecilomyces lilacinus on Meloidogyne paranaensis eggs at different temperatures

Resumos

Paecilomyces lilacinus é um fungo de solo, parasita facultativo de ovos de nematóides, que pode crescer rapidamente "in vitro". Este trabalho teve como objetivo avaliar o crescimento micelial de P. lilacinus em diferentes temperaturas e selecionar os melhores isolados quanto à capacidade de parasitar ovos de Meloidogyne paranaensis. Foram avaliados isolados de P. lilacinus, obtidos de solos coletados na região de Londrina, PR. Para o isolamento empregou-se a técnica de diluição seriada dos solos e plaqueamento em meio de cultura semi-seletivo. A determinação do crescimento micelial e do parasitismo "in vitro" dos isolados sobre M. paranaensis foi realizada em placas de Petri contendo meio BDA. Os isolados foram incubados em B.O.D. a temperaturas de 20ºC, 22,5ºC, 25ºC, 27,5ºC e 30ºC. A avaliação do crescimento foi interrompida quando em um dos tratamentos a colônia do fungo atingiu a borda da placa de Petri e a determinação do parasitismo foi realizada depois de oito dias de incubação, calculando-se a porcentagem de ovos parasitados. O crescimento micelial dos isolados de P. lilacinus teve grande dependência da temperatura de incubação a que foram submetidos, sendo mais rápido à temperatura de 22,5ºC. Os isolados de P. lilacinus revelaram habilidade para infectar os ovos de M. paranaensis em meio BDA, principalmente na temperatura de 25ºC.

Controle biológico; nematóide de galhas; parasita de ovos; desenvolvimento fúngico


Paecilomyces lilacinus is a soil fungus, facultative parasite of nematode eggs, which develops quickly "in vitro". The mycelial growth of P. lilacinus isolates was evaluated at different temperatures and the best isolates, regarding the capacity to parasite Meloidogyne paranaensis eggs, were chosen. P. lilacinus soil isolates from Londrina, Parana state, were evaluated. Isolation was done using serial dilution of the soils and plating it in semi-selective agar medium. The determination of mycelial growth and "in vitro" parasitism of these isolates was done using Petri plates containing potato-dextrose-agar (PDA), placed in chamber at 20ºC, 22.5ºC, 25ºC, 27.5ºC or 30ºC. The evaluation started when in one of the treatments of the fungus colonies reached the edge of the Petri plate. Parasitism was determined after 8 days of incubation, calculating the percentage of parasited eggs. The mycelial growth of P. lilacinus isolates was greatly dependent on the temperature. The fastest growth occurred at 22.5ºC. The isolates of P. lilacinus were able to infect M. paranaensis eggs in PDA medium, mostly at 25ºC.

Biological control; root-knot nematode; egg parasite; fungal development


CIÊNCIAS AGRÁRIAS

Crescimento micelial e parasitismo de Paecilomyces lilacinus sobre ovos de Meloidogyne paranaensis em diferentes temperaturas"in vitro"

"In vitro" mycelial growth and parasitism of Paecilomyces lilacinus on Meloidogyne paranaensis eggs at different temperatures

Marina Capparelli CadioliI; Débora Cristina SantiagoII; Adriano Thibes HoshinoIII; Martin HomechinIV

IEngenheira Agrônoma, Pós-Graduanda, Mestrado em Agronomia – Universidade Estadual de Londrina/UEL – Centro de Ciências Agrárias – Departamento de Agronomia – Rodovia Celso Garcia Cid, PR 445 Km 380 – Campus Universitário – Cx. P. 6001 – 86051-990 – Londrina, PR – marinacadioli@hotmail.com

IIEngenheira Agrônoma, Professora Doutora – Universidade Estadual de Londrina/UEL – Centro de Ciências Agrárias – Departamento de Agronomia – Rodovia Celso Garcia Cid, PR 445 Km 380 – Campus Universitário – Cx. Postal 6001 – 86051-990 Londrina, PR – santiago@uel.br

IIIGraduando do Curso de Agronomia – Universidade Estadual de Londrina/UEL – Centro de Ciências Agrárias – Departamento de Agronomia – Rodovia Celso Garcia Cid, PR 445 Km 380 – Campus Universitário – Cx. P. 6001 – 86051-990 Londrina, PR – hoshinoagro@gmail.com

IVEngenheiro Agrônomo, Professor Doutor – Universidade Estadual de Londrina/UEL – Centro de Ciências Agrárias – Departamento de Agronomia – Rodovia Celso Garcia Cid, PR 445 Km 380 – Campus Universitário – Cx. P. 6001 – 86051-990 Londrina, PR – homechin@uel.br

RESUMO

Paecilomyces lilacinus é um fungo de solo, parasita facultativo de ovos de nematóides, que pode crescer rapidamente "in vitro". Este trabalho teve como objetivo avaliar o crescimento micelial de P. lilacinus em diferentes temperaturas e selecionar os melhores isolados quanto à capacidade de parasitar ovos de Meloidogyne paranaensis. Foram avaliados isolados de P. lilacinus, obtidos de solos coletados na região de Londrina, PR. Para o isolamento empregou-se a técnica de diluição seriada dos solos e plaqueamento em meio de cultura semi-seletivo. A determinação do crescimento micelial e do parasitismo "in vitro" dos isolados sobre M. paranaensis foi realizada em placas de Petri contendo meio BDA. Os isolados foram incubados em B.O.D. a temperaturas de 20ºC, 22,5ºC, 25ºC, 27,5ºC e 30ºC. A avaliação do crescimento foi interrompida quando em um dos tratamentos a colônia do fungo atingiu a borda da placa de Petri e a determinação do parasitismo foi realizada depois de oito dias de incubação, calculando-se a porcentagem de ovos parasitados. O crescimento micelial dos isolados de P. lilacinus teve grande dependência da temperatura de incubação a que foram submetidos, sendo mais rápido à temperatura de 22,5ºC. Os isolados de P. lilacinus revelaram habilidade para infectar os ovos de M. paranaensis em meio BDA, principalmente na temperatura de 25ºC.

Termos para indexação: Controle biológico, nematóide de galhas, parasita de ovos, desenvolvimento fúngico.

ABSTRACT

Paecilomyces lilacinus is a soil fungus, facultative parasite of nematode eggs, which develops quickly "in vitro". The mycelial growth of P. lilacinus isolates was evaluated at different temperatures and the best isolates, regarding the capacity to parasite Meloidogyne paranaensis eggs, were chosen. P. lilacinus soil isolates from Londrina, Parana state, were evaluated. Isolation was done using serial dilution of the soils and plating it in semi-selective agar medium. The determination of mycelial growth and "in vitro" parasitism of these isolates was done using Petri plates containing potato-dextrose-agar (PDA), placed in chamber at 20ºC, 22.5ºC, 25ºC, 27.5ºC or 30ºC. The evaluation started when in one of the treatments of the fungus colonies reached the edge of the Petri plate. Parasitism was determined after 8 days of incubation, calculating the percentage of parasited eggs. The mycelial growth of P. lilacinus isolates was greatly dependent on the temperature. The fastest growth occurred at 22.5ºC. The isolates of P. lilacinus were able to infect M. paranaensis eggs in PDA medium, mostly at 25ºC.

Index terms: Biological control, root-knot nematode, egg parasite, fungal development.

INTRODUÇÃO

Nematóides formadores de galhas (Meloidogyne GÖELDI) estão amplamente disseminados no Brasil e estão entre os principais problemas fitossanitários em culturas de importância econômica (CARNEIRO et al., 1996; MOURA, 1996). Dentre esses, é de grande importância a espécie M. paranaensis (CARNEIRO et al., 1996), tanto pela ampla distribuição geográfica como pela severidade dos danos causados nas diferentes culturas (CARNEIRO et al., 1996). Levantamentos realizados no Paraná e em São Paulo têm mostrado um aumento na distribuição dessa espécie em áreas cafeeiras (KRZYZANOWSKI et al., 2001; LORDELLO et al., 2001).

Os métodos mais usados para controlar fitonematóides têm sido o uso de nematicidas, variedades resistentes e rotação de culturas. No entanto, existe uma pressão da sociedade no sentido da substituição dos atuais nematicidas por princípios ativos ou por táticas de controle ecologicamente mais recomendáveis. Esse fato tem levado à busca de métodos alternativos para o controle de fitonematóides, principalmente para os gêneros de maior importância, a exemplo de Meloidogyne (CARNEIRO, 1992).

A supressão dos nematóides devido à atuação de antagonistas, observada em alguns solos, e a não recomendação de alguns nematicidas aumentaram o interesse pelo controle biológico com o emprego de fungos nematófagos (FERRAZ & SANTOS, 1995). Muitos fungos têm demonstrado capacidade de parasitar fitonematóides (CARNEIRO, 1992; MANKAU, 1980).

Paecilomyces lilacinus (THOM) SAMSON é um fungo de solo que tem se mostrado efetivo no controle de espécies de Meloidogyne (CAMPOS & CAMPOS, 1996, 1997; KERRY, 1990). Foi reportado pela primeira vez como parasita em 1976 por Jatala, quando observou a presença deste infectando ovos de M. incognita (Kofoid & White, 1919) Chitwood (1949) e Globodera pallida (Stone, 1973) Behrens (1975) sobre raízes de batatas (Solanum tuberosum L.) no Peru (JATALA, 1986). No Brasil, o primeiro relato de P. lilacinus como parasita de ovos de Meloidogyne sp. foi feito por Freire & Bridge (1985), em raízes de pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) cv. Singapura.

P. lilacinus é um anamorfo de ascomiceto da ordem Eurotiales, encontrado em diferentes regiões do mundo e tem sido observado com maior freqüência em regiões quentes. Sua presença tem sido detectada em diferentes tipos de hospedeiros e solos, cultivados ou não (FARIA & TIGANO, 1996; SOSA-GOMEZ, 2002), sendo mais comuns em profundidades variando de 0-40 cm (CARNEIRO, 1986). É um parasita facultativo de ovos de nematóides que pode crescer rapidamente "in vitro" e a sua sobrevivência no solo não depende da presença dos nematóides (CARNEIRO, 1992).

A seleção de isolados, quanto ao parasistismo, é de extrema importância na busca de microrganismos eficientes como agentes de controle biológico e adaptados a diferentes regiões. Novaretti et al. (1986), na cultura de cana-de-açúcar e Hewlett et al. (1988) em fumo, contestaram a eficiência desse fungo em condições de campo, provavelmente devido à inadequação dos métodos de aplicação, de produção de conídios do fungo e de avaliação dos ensaios (KERRY, 1990) e não adaptação do isolado a diferentes condições e tipos de solo (CARNEIRO, 1992).

Dentro de uma espécie fúngica existem variações quanto à capacidade de colonizar os ovos de nematóides. Rodríguez-Kábana et al. (1984) e Stirling & West (1991) observaram que isolados de Verticillium chlamydosporium GODDARD e de P. lilacinus apresentavam variabilidade quanto ao grau de parasitismo, sendo esta mais acentuada para P. lilacinus.

Para que se possa saber se os isolados de P. lilacinus podem, ou não, ser utilizados no controle de nematóides, é necessário definir, primeiro, quais as melhores condições de multiplicação desse fungo, principalmente no que se refere à temperatura, uma vez que esse microrganismo ficará exposto à variação térmica que ocorre no solo durante o ano (FIORETTO & VILLACORTA, 1981). Embora resultados encorajadores sejam observados em condições brasileiras (COSTA & CAMPOS, 1997; FREITAS et al., 1999; MIZOBUTSI et al., 2000), informações básicas sobre o comportamento de P. lilacinus como parasita de nematóides de galhas, em diferentes condições climáticas e ambientais do solo, são necessárias para que seu emprego na agricultura seja recomendado, especialmente no controle de M. paranaensis, nematóide carente de informações com relação ao seu manejo.

Portanto, realizou-se este trabalho com o objetivo de avaliar o crescimento micelial de P. lilacinus em diferentes temperaturas (20ºC, 22,5ºC, 25ºC, 27,5ºC e 30ºC) e selecionar os melhores isolados quanto a capacidade de parasitar ovos de M. paranaensis "in vitro".

MATERIAL E MÉTODOS

Foram avaliados 31 isolados de P. lilacinus, obtidos de amostras de solos coletadas em áreas cultivadas com café, pastagem, eucalipto e milho, na região de Londrina - PR, no período de março a maio de 2005.

Para o isolamento de P. lilacinus foi empregada a técnica de diluição seriada dos solos e plaqueamento em meio de cultura semi-seletivo de Alves et al. (1998), com pequenas modificações, composto por 20 g de farinha de aveia, 20 g de ágar, 300 mg de Venturol® (dodine 650 g.kg-1), 50 mg de solução de violeta genciana, 5 mg de Tetraciclina (cloridrato de tetraciclina 300 mg) em 1000 mL de água destilada. Após a obtenção e identificação dos isolados de P. lilacinus, estes foram repicados para meio de batata-dextrose-ágar (BDA) em tubos de ensaio, catalogados e armazenados em geladeira.

A determinação do crescimento micelial e do parasitismo "in vitro" dos isolados sobre M. paranaensis foi realizada em placas de Petri contendo 15 mL de meio ágar-água (1,5%). Discos de 5 mm de diâmetro dos isolados fúngicos, obtidos de cultivo puro em BDA, foram transferidos para o centro de cada placa. Na testemunha foi transferido apenas um disco de 5 mm de meio de BDA sem o fungo. Ao redor dos discos foram colocadas três massas de ovos de M. paranaensis, obtidas a partir de uma população pura multiplicada em plantas de tomateiro (Lycopersicon esculentum L.) cv. Santa Cruz durante 45 dias sob condições de casa-de-vegetação.

As placas foram incubadas em câmaras do tipo B.O.D. às temperaturas de 20ºC, 22,5ºC, 25ºC, 27,5ºC e 30ºC, com 12 horas de luz e 12 horas de escuro. O crescimento micelial foi acompanhado diariamente, medindo-se o diâmetro da colônia do fungo em dois sentidos perpendiculares entre si. A avaliação foi interrompida quando em um dos tratamentos a colônia do fungo atingiu a borda da placa de Petri.

A determinação do parasitismo foi realizada depois de oito dias de incubação. Para tanto, discos eqüidistantes de 9 mm de diâmetro foram retirados ao redor das massas de ovos de cada placa e foram colocados em seqüência sobre uma lâmina para microscopia. Sobre os discos foi acrescentada uma gota de lactofenol, contendo azul de algodão, e em microscópio ótico, sob aumento de 100 vezes, foi avaliada a porcentagem de ovos parasitados em relação ao número total.

Para análise estatística foi utilizado o modelo fatorial 31 x 5 (isolados x temperaturas) com 10 repetições, cinco para a obtenção do crescimento micelial e cinco para o teste de parasitismo, e as médias dos tratamentos foram comparadas por meio dos testes de Scott-knot (para isolado) e de Tukey (para temperatura) ao nível de 5% de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A variância para as temperaturas testadas mostrou significância, o que indica que o crescimento micelial dos isolados de P. lilacinus teve grande dependência da temperatura de incubação a que foram submetidos (Tabela 1). Na temperatura de 20ºC foi observado que os isolados Pae 03, 05, 10, 12 e 20 apresentaram desenvolvimento micelial superior aos demais no período considerado. Na temperatura de 22,5ºC, os melhores crescimentos foram observados para os isolados Pae 03, 06, 07, 09, 10, 11 e 13. Na temperatura de 25ºC, os isolados Pae 08 e 22 se destacaram com crescimento superior aos demais. Já para a temperatura de 27,5ºC, o isolado Pae 21 teve melhor crescimento micelial e os isolados que se destacaram na temperatura de 30ºC foram Pae 22, 24 e 30.

Com relação ao desenvolvimento micelial observou-se um aspecto interessante na temperatura de 22,5ºC, em que os isolados Pae 03, 06, 07, 09, 10, 11 e 13 apresentaram um crescimento muito mais rápido em comparação às outras temperaturas avaliadas, chegando a atingirem a borda das placas ao quinto dia de incubação. Estes resultados diferem dos obtidos por Fioretto & Villacorta (1981), os quais observaram maior crescimento de P. lilacinus nas temperaturas de 24 e 25ºC. No entanto, estes autores estudaram o comportamento apenas de um isolado proveniente do Peru.

Para os isolados Pae 02, 23 e 31 a temperatura não influenciou de maneira significativa o crescimento micelial. As temperaturas de 20 e 22,5ºC foram as melhores para o desenvolvimento do isolado Pae 05. Os isolados Pae 04, 09 e 16 tiveram crescimento semelhante tanto a 22,5 quanto a 25ºC. Já os isolados Pae 18, 27 e 29 apresentaram crescimento semelhante nas temperaturas de 22,5ºC e 27,5ºC. As temperaturas de 25 e 27,5ºC foram as melhores para o isolado Pae 25 e as temperaturas de 25 e 30ºC para os isolados Pae 22 e 24. Os isolados Pae 01, 15, 19, 20 e 30 apresentaram resultados variáveis em função das temperaturas. Já o isolado Pae 21 teve maior crescimento na temperatura de 27,5ºC e os isolados Pae 12 e 26 apresentaram maior desenvolvimento micelial nas temperaturas de 25ºC e 27,5ºC, respectivamente. E os demais apresentaram melhor crescimento micelial na temperatura de 22,5ºC. Estes resultados corroboram com o que foi citado por Felli et al. (1985) e Jatala (1986). E, por isso, a eficiência e a adaptabilidade de P. lilacinus no controle de nematóides em diferentes condições climáticas e ambientais do solo, ainda necessita ser melhor explorada. Portanto, o presente estudo pode ser importante na recomendação dos isolados em função das condições climáticas de cada região.

Quanto à capacidade de parasitismo, os isolados de P. lilacinus revelaram habilidade para infectar os ovos de M. paranaensis em meio BDA (Tabela 2). Na temperatura de 20ºC, os isolados mais agressivos aos ovos foram Pae 03, 05, 09, 10, 12, 13, 17, 20, 26, 28, 29 e 30, com percentuais de parasitismo que variaram de 55,98 a 95,23%. Na temperatura de 22,5ºC os isolados que apresentaram maior porcentagem de parasitismo foram Pae 03, 04, 05, 06, 07, 10, 12, 13, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 30 e 31, com percentuais variando de 69,98 a 98,66%. Na temperatura de 25ºC, os isolados Pae 13, 17, 22 e 26 diferiram estatisticamente dos demais, apresentando os menores percentuais de ovos parasitados. Estes percentuais variaram entre 80,39 e 87,15%, no entanto foram bem superiores àqueles menores observados nas temperaturas de 20 e 22,5ºC. Os isolados mais agressivos na temperatura de 27,5ºC foram Pae 05, 09, 11, 14, 20, 21, 22 e 26 com percentuais variando de 81,00 a 95,86%. Na temperatura de 30ºC, com exceção dos isolados Pae 04, 09, 13, 14, 17 e 29, todos os demais apresentaram percentuais de parasitismo superiores a 79,20%.

Em se considerando o parasitismo dos isolados, nas temperaturas de 25 e 30ºC, foram encontrados os maiores percentuais de parasitismo dos ovos, a exceção dos isolados Pae 04, 09, 13, 14, 17, 29 e 30, os quais na temperatura de 30ºC apresentaram percentuais semelhantes aos observados em 20ºC. Para os isolados Pae 07, 18 e 28 em 25ºC, e Pae 24 na temperatura de 30ºC, 100% dos ovos encontravam-se parasitados.

Na temperatura de 22,5ºC houve grande variação na porcentagem de parasitismo, apesar do rápido crescimento micelial observado nesta temperatura, sendo similar ao resultado obtido por Freitas et al. (1995), comparando 19 isolados de P. lilacinus de diferentes procedências quanto ao parasitismo de ovos de M. javanica, os quais obtiveram 100% de parasitismo pelos isolados procedentes da Itália e do Peru e, 70% pelo isolado originário da França. Já para os isolados brasileiros houve variação de 2 a 69% de ovos parasitados. Da mesma forma, Santos et al. (1992) observou resultado diferenciado no parasitismo de M. incognita por diferentes isolados de P. lilacinus. Esta variabilidade pode ser devida à adaptação seletiva aos vários fatores edáficos em sua origem geográfica, tal como tipo de solo ou temperatura ambiente.

Variações quanto à capacidade de colonizar os ovos de nematóides são comumente observadas dentro de uma mesma espécie fúngica. Rodríguez--Kábana et al. (1984) e Stirling & West (1991) observaram que isolados de V. chlamydosporium e de P. lilacinus apresentavam variabilidade na patogenicidade, sendo esta mais acentuada para P. lilacinus.

Mizobutsi et al. (2000) verificaram que o fungo P. lilacinus parasitou 77% dos ovos de M. javanica (Treub, 1885) Chitwood (1949), enquanto que a maioria dos isolados de outros fungos testados mostrou-se pouco eficaz no parasitismo. O fato das fêmeas adultas de Meloidogyne concentrarem seus ovos em uma matriz gelatinosa pode facilitar o desenvolvimento do P. lilacinus e o parasitismo dos ovos. Segundo Jatala (1986), fungos parasitas de ovos são mais eficientes na redução da população de nematóides em comparação com aqueles que atuam como endoparasitas e predadores. Também são considerados os agentes mais promissores para o biocontrole, uma vez que impedem ou reduzem a formação de ovos pelos nematóides (KERRY et al., 1982).

Para que se possa saber se os isolados de P. lilacinus podem, ou não, ser utilizados no controle de nematóides, é necessário definir, primeiro, quais as melhores condições de multiplicação desse fungo, principalmente no que se refere à temperatura, uma vez que esse microrganismo ficará exposto à variação térmica que ocorre no solo durante o ano (FIORETTO & VILLACORTA, 1981).

CONCLUSÕES

O crescimento micelial dos isolados de P. lilacinus teve grande dependência da temperatura de incubação a que foram submetidos, sendo mais rápido a 22,5ºC. Os isolados de P. lilacinus revelaram habilidade para infectar os ovos de M. paranaensis em meio BDA, principalmente na temperatura de 25ºC.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Dr. Rui G. Carneiro, responsável pelo Laboratório de Nematologia do IAPAR, Londrina-PR, pelo fornecimento de inóculo de M. paranaensis.

(Recebido em 9 de março de 2006 e aprovado em 17 de outubro de 2006)

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    11 Jun 2007
  • Data do Fascículo
    Abr 2007

Histórico

  • Recebido
    09 Mar 2006
  • Aceito
    17 Out 2006
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