Estudo da regeneração nervosa em nervos tibiais de ratos wistar utilizando o Fluoro-Gold® como marcador neuronal

A study on nerve regeneration in tibial nerves of wistars rats, using Fluoro-Gold® as a neuronal tracer

Resumos

The authors studied, in rats, of nerve regeneration in nerve grafts comparing with control group using Fluoro-Gold® (FG) labeled motor neurons count in spinal cord. In control group both tibial nerves were exposed to FG® and motor neurons counted in spinal cord in 48 hours, after perfusion, in a medular segment from L3 to S1. In experimental group, ressecting 8 mm, a gap was created in both tibial nerves and nerve segment of one nerve was used to repair contralateral side in a traditional nerve graft suture. After four months, right tibial nerve was exposed to FG® distal to graft and left tibial nerve exposed to FG proximal to graft. In 48 hours, after perfusion, motoneurons were counted in a medular segment from L3 to S1. In both groups medular segment was cut in 40 mm slices and all labeled cells counted. Wilcoxon and Student tests were used for statistical analysis. Control group presented a significative increased number of motoneurons when compared to experimental group. In experimental group number of motoneurons was significantly decreased when tibial nerve was exposed to FG® distal to nerve graft. Nerve graft promoted a partial block to axon migration after four months of surgery.

Transplantation autologous; Nerve regeneration; Peripheral nerves; Wistar rats; Dyes fluorescents

ARTIGO ORIGINAL

Estudo da regeneração nervosa em nervos tibiais de ratos wistar utilizando o Fluoro-Gold^® como marcador neuronal

Marco Aurélio Sertório Grecco^I; Vilnei Mattioli Leite^II; Walter Manna Albertoni^III; João Baptista Gomes dos Santos^IV; Celso Kiyoshi Hirakawa^V; Flávio Faloppa^VI; Sandra Gomes Valente^VII

^IMédico; Mestre em Ortopedia e Traumatologia

^IIProfessor Livre-Docente; Chefe da Disciplina de Cirurgia da Mão e Membro Superior

^IIIProfessor Titular; Chefe do Departamento de Ortopedia e Traumatologia

^IVMédico assistente da Disciplina de Cirurgia da Mão e Membro Superior; Mestre em Ortopedia e Traumatologia

^VProfessor Livre-Docente, coordenador do Curso de Pós-graduação

^VIDoutor em Medicina, Chefe de Clínica na Disciplina de Cirurgia da Mão e Membro Superior do Departamento de Ortopedia e Traumatologia da UNIFESP/EPM

^VIIBióloga; Mestre em Neurociências

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Os autores estudaram em ratos a regeneração nervosa no enxerto nervoso tradicional, comparando-os com grupo controle, através da contagem no nível da medula espinhal, entre L3 e S1, de motoneurônios marcados por meio de exposição do nervo tibial ao Fluoro-Gold^® (FG). No grupo controle, ambos os nervos tibiais foram expostos ao FG^®, e em 48 horas, após a perfusão, os motoneurônios foram contados. No grupo experimental, foi ressecado um segmento de 8mm do nervo tibial criando uma falha segmentar. O segmento de nervo de um foi usado para reparar o lado contralateral, utilizando sutura epineural. Após quatro meses, o nervo tibial direito foi exposto ao FG após o enxerto nervoso e, o esquerdo, antes do enxerto. Os motoneurônios foram contados após a perfusão. Ambas as medulas foram cortadas em segmentos de 40mm. Para a análise estatística foram utilizados testes de Wilcoxon e Student. O grupo controle apresentou um significativo aumento de motoneurônios quando comparado ao experimental. No grupo experimental, o número de motoneurônios foi significantemente maior, quando a exposição do nervo tibial ao FG^® era feita distalmente ao enxerto nervoso. O enxerto nervoso funciona como um bloqueio parcial para a migração dos axônios em regeneração.

Descritores: Transplante autólogo; Regeneração nervosa; Nervos periféricos; Ratos wistar; Corantes fluorescentes.

INTRODUÇÃO

As lesões do sistema nervoso periférico têm sido alvo de inúmeros estudos para compreensão e entendimento do processo de reparação nervosa, pois podem ocasionar transtornos importantes à função dos membros superiores e inferiores.

O método de sutura epineural foi descrito por Hueter (1873) e o primeiro enxerto nervoso experimental por Philipeau, Vulpian (1886)⁽¹⁰⁾.

Graças à implantação de técnicas e materiais microcirúrgicos, ocorreu um aperfeiçoamento na reconstrução das estruturas lesadas, com melhora da recuperação funcional do nervo⁽¹⁴⁾

O enxerto nervoso foi apresentado como uma das formas de tratamento de lesões nervosas com falha segmentar e suturas epineurais sob tensão^(10,11,12) e a sua utilização tem melhorado significativamente com o emprego de técnicas microcirúrgicas⁽⁵⁾. Entretanto, outros autores⁽¹³⁾, não acreditam nos resultados do emprego de tais técnicas.

Como vimos, o enxerto nervoso é empregado desde o final do século XIX. Por esse motivo, resolvemos estudar a regeneração nervosa através da contagem de motoneurônios marcados pelo FG^® por meio de: comparação entre o número de motoneurônios marcados em animais do grupo controle e o número de motoneurônios em animais do grupo experimental, onde foi feito o enxerto nervoso; comparação entre o número de motoneurônios marcados através da exposição ao FG^®, realizada proximal e distalmente ao enxerto nervoso nos animais do grupo experimental, e avaliação para verificar se há bloqueio da regeneração nervosa através do enxerto nervoso

MATERIAL E MÉTODOS

Usamos 28 ratos da raça Wistar, machos, como grupo controle. Foram usados 14 animais adultos com peso médio de 298g e com idade média de cinco meses e 14 ratos com peso médio de 155g, e com idade média de um mês, como grupo experimental.

Cada animal recebeu anestesia intraperitoneal com solução anestésica composta por hidrato de cloral (4,25g), sulfato de magnésio (2,25g), propilenoglicol (4,28ml), álcool etílico absoluto (11,5ml) e água destilada (45,7ml). (Figura 1).

Fez-se uma incisão póstero-lateral em ambas as coxas de cada pata. Utilizou-se microscópio e instrumental microcirúrgico para dissecar o nervo ciático e suas ramificações sural, peroneiro e tibial. (Figura1). No grupo controle, operamos os dois membros inferiores, expondo o nervo tibial de cada perna, seccionando-os e expondo-os imediatamente ao marcador neuronal FG^® a 3%, por um período de uma hora e 30 minutos. No grupo experimental, operarmos os dois membros inferiores, expondo o nervo tibial de cada lado e ressecando um segmento de 8mm do nervo, simulando, ao mesmo tempo, a perda de substância e a obtenção do enxerto nervoso autólogo. O segmento de nervo de um foi usado para reparar o lado contralateral, utilizando-se sutura epineural (Figura 2). Após quatro meses, os animais foram submetidos à nova cirurgia para exposição dos nervos tibiais ao marcador neuronal FG^® (Figura 3). O nervo tibial direito foi corado após o enxerto nervoso e o esquerdo antes do enxerto. Após 48 horas os animais de ambos os grupos foram novamente anestesiados e perfundidos com 50ml de solução salina isotônica intra-cardíaca para limpeza do sistema vascular, 200ml de "solução de perfusão" (4% paraformaldeído/"buffer" fosfato) rapidamente em 8 a 10 minutos, 300ml de "solução de perfusão", lentamente, em 20 minutos, 200ml de "buffer" sacarose a 10%, rapidamente, em oito a 10 minutos, 300ml de "buffer" sacarose a 10%, lentamente, em 20 minutos.

Ao término desse procedimento, com o animal em decúbito ventral, realizou-se a laminectomia dorsal e lombar. Após a exposição da medula espinhal, ressecou-se o segmento correspondente de L3 a S1. Marcou-se, então, um sulco na região dorsal deste segmento para indicar o lado direito.

A peça foi colocada em micrótomo e fatiada em cortes de 40 mm, montadas em lâminas, deixadas secando na geladeira por 24 horas. As lâminas prontas foram examinadas em microscópio ZEISS-AXIOLAB com luz fluorescente para evidenciar o FG^®. Examinou-se todos os cortes em ampliações de 100 e 400 vezes e contou-se os neurônios motores marcados (Figura 4).

Realizou-se a análise estatística aplicando-se os testes não-paramétrico de Wilcoxon sinalizado, e o teste paramétrico t-Student. O nível de significância considerado para os testes foi de 5% (p< 0,05).

RESULTADOS

O número de motoneurônios, marcados com FG^®, nos animais do grupo controle é maior que no grupo experimental submetido ao enxerto nervoso, tanto proximal como distal. Não há diferença no número de motoneurônios marcados, entre os lados direito e esquerdo, nos animais do grupo controle (Tabela 2). O número de motoneurônios, nos animais do grupo experimental, é maior quando a marcação com FG^® é feita proximal ao enxerto nervoso (Tabela 1).

DISCUSSÃO

Comumente, em reparo nervoso de lesões de nervos periféricos, a neurorrafia término-terminal é a ideal e a que apresenta melhores resultados, com o que praticamente todos os autores, citados em nosso trabalho, concordam. Entretanto, no que tange à lesão nervosa com perda de substância e à sutura sob tensão, vários tipos de enxertos, biológicos e não biológicos, podem ser empregados. Dentre esses, o enxerto nervoso autógeno é o mais utilizado desde o final do século XIX, considerado assim o "Gold Standard"⁽⁸⁾ .

A despeito da sua ampla utilização, os resultados funcionais têm sido inferiores aos da sutura término-terminal^(10,11,12), mesmo com o desenvolvimento e emprego de técnicas microcirúrgicas⁽¹⁴⁾.

Foram usados ratos da raça Wistar, por serem conhecidos biologicamente e estudados há muito tempo pela comunidade científica⁽⁴⁾.

Fatores resultantes da lesão do nervo ciático, tais como, úlceras de pele⁽⁷⁾, autofagia das partes insensíveis⁽⁶⁾ e a dificuldade do rato em manter-se em pé para a alimentação e por se tratar de nervo puramente motor, nos levaram à utilização do nervo tibial. Utilizou-se enxerto nervoso de 8mm de comprimento, respeitando-se o limite de 10mm da regeneração em tubos para ratos^(6,9).

O método utilizado para estudar a regeneração nervosa foi através da marcação neuronal retrógrada com FG^®, na concentração de 3%, Este marcador é fluorescente e permite sua observação direta ao microscópio sob uso de filtros⁽⁶⁾.

Ao analisarmos os resultados (Tabela 3), constatamos diferenças nas contagens celulares em todos os animais, porém, evidenciamos proporções semelhantes, coincidindo com os achados da literatura^(1,6,9), com alguns autores concordando que a individualidade de cada animal influencia a contagem^(1,6)

Utilizaram-se dois métodos estatísticos para definir se havia diferença significativa entre as técnicas empregadas. Os testes empregados foram t-Student e Wilcoxon sinalizado.

Na contagem neuronal dos animais do grupo de experiência, averiguamos que o lado esquerdo apresentou média de 771 motoneurônios (máximo de 1078 e mínimo de 371) e o direito 657,07 (máximo de 931 e mínimo de 342), ou seja, o lado direito apresentou, em média, 14,78% menos motoneurônios que o esquerdo (Tabela 3).

De acordo com estudo realizado por Sweet et al.⁽¹⁵⁾, o número de motoneurônios do nervo tibial foi de 982 ± 36, utilizando coloração retrógrada com HRP, o que está de acordo com o observado no grupo controle (Tabela 1).

Encontramos, em média, 20%, menos motoneurônios marcados do nervo tibial do lado esquerdo dos animais do grupo experimental (com a marcação neuronal realizada proximal ao enxerto nervoso), quando comparamos com o número do grupo controle.

Isso significa que houve uma diminuição no número de células, em decorrência de uma lesão nervosa isolada, na qual não incidiu interferência técnica do cirurgião, mostrando uma possível morte celular. Portanto, este nervo não será igual ao lado não lesado (nervo tibial normal), havendo uma dificuldade para o retorno à função normal do nervo após uma neurorrafia. Altissimi et al.⁽²⁾ analisaram a recuperação da sensibilidade em nervos digitais e apenas 13% dos pacientes chegaram ao normal.

No que se refere à contagem de motoneurônios do nervo tibial normal (perna esquerda do controle), comparada com a contagem realizada após o enxerto (perna esquerda do animal de experiência), observamos uma perda aproximada de 35%. Esta perda seria decorrente de 14,78% do próprio enxerto, somado à possível morte de motoneurônios (20%) ocasionada pela própria lesão.

Isso denota uma perspectiva ruim de regeneração nervosa após a utilização do enxerto nervoso. Mediante esses resultados por nós obtidos, parece-nos que o "Gold Standard" ainda não é ideal.

Fatores como tensão no sítio de sutura, tecido cicatricial e dois sítios de suturas podem ter influenciado o resultado da reparação nervosa^(10,11,12).

Talvez, o mais importante deste trabalho diz respeito aos 20% de morte neuronal observada após quatro meses da lesão, quando comparamos a contagem de neurônios marcados proximais ao enxerto com os neurônios marcados no grupo controle. Essa redução de número de neurônios associada às alterações topográficas de reinervação devem ser os responsáveis pelos maus resultados das neurorrafias, o que nos leva a propor a utilização de substâncias neurotróficas e neurotrópicas, com o objetivo de minimizar essa perda celular e reorientar os axônios.

CONCLUSÕES

Observou-se maior número de motoneurônios marcados em nervos tibiais, não submetidos a enxerto nervoso, expostos ao FG^®, quando comparados àqueles submetidos ao enxerto nervoso. Notou-se menor número de motoneurônios na medula espinhal, quando a exposição do nervo tibial ao FG^® era feita distalmente ao enxerto nervoso. Essa diminuição de motoneurônios, quando a exposição do nervo tibial ao FG^® era feita distalmente ao enxerto nervoso, mostra que o enxerto nervoso funciona como um bloqueio parcial para a migração dos axônios em regeneração.

Trabalho recebido em 21/05/2003

Aprovado em 27/07/2003

Trabalho realizado no Laboratório de Microcirurgia da Disciplina de Cirurgia da Mão e Membro Superior do Departamento de Ortopedia e Traumatologia e nos Laboratórios da Disciplina de Neurologia Experimental do Departamento de Neurologia e Neurocirurgia da Unifesp-EPM

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Mar 2004
• Data do Fascículo
  Dez 2003

Histórico

• Aceito
  27 Jul 2003
• Recebido
  21 Maio 2003