Avaliação do efeito do Risedronato Sódico na consolidação de fraturas: estudo experimental em ratos

Resumos

A experimental study with 40 rats of the Lewis type was done focusing the influence of sodic risedronate on fractures consolidation in the animals. They were submitted to a protein nutrition diet to a non-protein one, divided randomly in four groups, having 10 animals in each group. Like this: group 1, with a protein nutrition diet, without risedronate (control group); group II, protein nutrition diet t with risedronate , group III, non-protein diet, without risedronate; group IV, non-protein diet with risedronate. The rats were submitted to similar fractures, on the 15º day and to the euthanasia on the 43º of the experiment. The variability analyzed included the ponderous evaluation, radiographic evaluation, the bone densitometry, histomorphometric bone callus evaluation, blood dosage of calcium, phosphorus, alkaline phosphatase, total proteins, albumin and osteocalcin. It was found out the risedronate had positive influence on the fractures consolidation process in nourished rats and malnourished rats and the mineral bone density increased. The risedronate caused the formation of the best nutrition and morphology of the ripen bone tissue.

Protein malnutrition; Risedronate; Fracture healing; Rats

ARTIGO ORIGINAL

Avaliação do efeito do Risedronato Sódico na consolidação de fraturas: estudo experimental em ratos

Luiz Antonio Alcântara de Oliveira^I; Roberto Guarniero^II; Consuelo Junqueira Rodrigues^II; Paulo José de Santana^I; Marco Antonio Batista^III

^IProfessor Adjunto Doutor da FMUEL

^IIProfessor Livre-Docente da FMUSP

^IIIProfessor Assistente da FMUEL

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Realizou-se um estudo experimental com 40 ratos da raça Lewis visando-se avaliar a influência do risedronato sódico na consolidação de fraturas em animais submetidos à dieta aprotéica e dieta protéica, divididos aleatoriamente em quatro grupos, com 10 animais em cada grupo, assim constituídos: grupo I, com dieta protéica, sem risedronato (grupo controle); grupo II, dieta protéica, com risedronato; grupo III, dieta aprotéica, sem risedrionato; grupo IV, dieta aprotéica, com risedronato. Os ratos foram submetidos a fraturas semelhantes, no 15º dia e à eutanásia no 43º dia do experimento. As variáveis analisadas incluíram a evolução ponderal, avaliação radiográfica, densitometria óssea, avaliação histomorfométrica do calo ósseo, dosagens sanguíneas de cálcio, fósforo, fosfatase alcalina, proteínas totais, albumina e osteocalcina. Concluiu-se que o risedronato exerceu influência positiva no processo de consolidação de fraturas em ratos nutridos e desnutridos, e aumentou a densidade mineral óssea. O risedronato ocasionou a formação de tecido ósseo maduro de melhor qualidade e morfologia.

Descritores: Desnutrição protéica; Risedronato; Consolidação de fraturas; Ratos.

INTRODUÇÃO

A consolidação das fraturas é uma resposta especializada do organismo em que a regeneração do osso leva à restauração da integridade do esqueleto. Embora a maioria das fraturas consolide sem problemas, fatores como a desnutrição protéica, presente em nosso meio, podem interferir negativamente na consolidação de fraturas⁽⁹⁾.

Não há no arsenal farmacêutico um medicamento que acelere a consolidação das fraturas, apesar dos estudos que vêm sendo realizados no sentido de se buscar esse resultado^(3,12). Diante disso, empregou-se o risedronato sódico, um bisfosfonato formador de massa óssea, com o intuito de se observar a sua eficácia na consolidação das fraturas, através de um estudo experimental em ratos nutridos e desnutridos.

Analisou-se, através de análise estatística, o comportamento bioquímico do cálcio, fósforo e fosfatase alcalina, além das proteínas totais e albumina, e do marcador bioquímico da formação óssea, a osteocalcina. Foram também analisados estatisticamente os dados obtidos através de avaliações ponderal, radiográfica, densitométrica, histológica e histomorfométrica.

O objetivo deste trabalho é avaliar a influência do risedronato sódico, experimentalmente, no processo de consolidação de fraturas em ratos machos adultos, nutridos e subnutridos, nos quais foram provocadas fraturas nas tíbias direitas.

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estadual de Londrina, Pr, em Parecer BIO 033/00 e pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo sob o protocolo nº 669/00.

MATERIAL E MÉTODO

Foram utilizados 40 ratos de laboratório de linhagem Lewis, machos, adultos, isogênicos, com peso inicial variando entre 250 e 342 gramas.

Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos com dez animais em cada grupo, assim distribuídos: grupo I, com dieta protéica, sem o risedronato (grupo controle); grupo II, com dieta protéica, com risedronato; grupo III, com dieta aprotéica, sem risedronato; grupo IV, com dieta aprotéica, com risedronato, sendo mantidos em gaiolas, contendo cinco animais em cada uma, feitas de polietileno opaco, e fechadas com tampa de aço inoxidável em forma de grade, forradas com sepilho, e higienizadas três vezes por semana. No recinto onde os animais permaneciam, o período de luz foi de 12 horas, com temperatura, umidade e nível de ruído mantidos estáveis.

A dieta aprotéica, fornecida aos animais dos grupos III e IV, é padronizada e utilizada para desnutrição experimental em animais de laboratório.

Para a análise bioquímica, foram realizadas coletas de sangue através de punção cardíaca nos dias 1º, 15º e 43º do experimento.

No 15º dia, os ratos foram submetidos a fratura fechada do terço médio das tíbias direitas, realizadas manualmente por flexão forçada, procurando-se obter similaridade quanto ao traço, localização e mobilização do periósteo, estando os animais sob anestesia, através de injeção intraperitoneal de solução composta de cetamina na dose de 40 mg/kg e de xilazina na dose de 5 mg/kg^(7,14) de peso corporal diluídos em 1 ml de solução salina. Após a realização das fraturas, os animais dos grupos II e IV passaram a receber dose diária de 1 mg/kg/dia de risedronato sódico, através de gavagem com cateter de polietileno especialmente adaptado, medindo 5 cm de comprimento e 1 mm de diâmetro, sendo a solução preparada imediatamente antes de cada administração oral. A contenção do animal foi feita por técnico habilitado, e, afastando-se a mandíbula com espátula, administrou-se o medicamento aos grupos II e IV, sem necessidade de anestesia. A administração da solução de risedronato sódico foi efetuada em dose única diária, após a fratura, durante 28 dias.

A eutanásia dos animais ocorreu 28 dias após a realização das fraturas, no 43º dia do experimento, atendendo-se a um protocolo de administração de dose letal obtida com anestesia injetável intraperitoneal de barbitúrico após a indução anestésica com halotano, finalizando com dose letal de cloreto de potássio. Após esse procedimento, realizou-se a pesagem e a desarticulação coxo-femoral direita dos animais para estudo do calo ósseo.

A avaliação do material de estudo foi feita de acordo com a evolução ponderal dos animais e das dosagens séricas do cálcio, fósforo, fosfatase alcalina, proteínas totais, albumina e osteocalcina no 1^º, 15^º e 43^º dias, e do estudo radiográfico, planimetria, densitometria, histologia e histomorfometria do calo ósseo no final do estudo.

Para o estudo estatístico, utilizou-se a técnica de análise de variância para o delineamento inteiramente casualizado, e mascaramento do tipo duplo-cego, em esquema fatorial de tratamento, com desdobramento dos graus de liberdade do efeito da interação entre a dieta e a medicação. Os dados obtidos foram analisados em nível de significância de 5%, ou seja, os testes foram considerados significativos quando p<0,05.

RESULTADOS

A seguir, as tabelas com as médias e os desvios-padrões das variáveis mensuradas e sua respectiva análise de variância.

DISCUSSÃO

A avaliação clínica comparativa e sistemática da formação do calo ósseo em fraturas apresenta muitas dificuldades, pois há inúmeras diferenças individuais no que diz respeito à natureza e ao local da fratura, curso e duração da consolidação. Porém, particularmente difícil é estudar os métodos terapêuticos capazes de influenciar a formação do calo ósseo. Assim, é natural que se aborde esse problema experimentalmente, para podermos comparar de maneira homogênea o material, isto é, as mesmas condições quanto ao sexo, idade, peso, dieta, natureza e localização da fratura. Além disso, em países em desenvolvimento como o Brasil, deve-se considerar o estado nutricional como fator influente na consolidação de fraturas, pois dele depende a restauração à integridade do esqueleto.

Neste experimento, o animal utilizado foi o rato, por ser o modelo mais prático e comum. As fraturas são de rápida consolidação, dispensando imobilização externa ou interna, e sem complicações importantes. O modelo também possibilita a coleta de sangue para a o estudo bioquímico. As alterações ósseas relacionadas à evolução do calo ósseo podem ser facilmente verificadas nesse modelo animal⁽¹⁰⁾. O modelo também permite a avaliação da formação do calo ósseo em situações como a desnutrição⁽⁹⁾, ou da ação de substâncias como a calcitonina⁽⁸⁾, alendronato sódico⁽¹²⁾, fluoreto de sódio⁽²⁾, complexo osseína-hidroxiapatita⁽³⁾.

As fraturas foram obtidas por osteoclasia manual⁽¹³⁾, e mostraram similaridade satisfatória, com pequenas diferenças de localização, porém sem necessidade de se criar um dispositivo mecânico para a sua realização. A comparação de consolidação de fraturas experimentais exige similaridade, o que se procurou obter neste experimento. Os animais não foram imobilizados, tendo sido deixados livres para a deambulação, porque a imobilização, além de ser desnecessária, poderia criar possibilidade de interferência pela presença de material de síntese⁽⁸⁾.

A via peritoneal, para a realização da anestesia, é a mais usada para roedores. Não houve complicações durante o ato anestésico, o que nos permite assegurar a eficácia desta conduta.

A dieta aprotéica para desnutrição experimental⁽¹¹⁾ levou à desnutrição protéica, verificada na análise dos valores das proteínas totais (p<0,0001) e da albumina (p=0,0153). A desnutrição protéica assim obtida teve interferência direta na consolidação das fraturas, o que concorda com observações obtidas em outros estudos^(8,9).

O medicamento utilizado neste experimento com o fim de se analisar sua possível influência como adjuvante na consolidação das fraturas, o risedronato sódico, é um piridinil bisfosfonato de terceira geração que, como outros bisfosfonatos, inibe a reabsorção óssea mediada pelos osteoclastos⁽⁵⁾.

A formação de uma ponte entre os fragmentos de um osso fraturado constitui o passo mais importante na sua consolidação; a quantidade de calo ósseo é a porção visível nas radiografias⁽¹⁾. As fraturas experimentais nas tíbias de ratos atingem a fase de ossificação em torno da quarta semana de evolução, quando já demonstram evidências radiográficas de consolidação. Com base nesses dados, foi determinada a eutanásia dos animais 28 dias após a realização das fraturas, para a avaliação radiográfica, densitométrica e histológica do calo ósseo.

A desnutrição dos animais dos grupos III e IV foi evidenciada pela significante perda de peso (p<0,0001), o que foi observado já no 15º dia do experimento, ocasião em que foram realizadas as fraturas, persistindo a perda de peso até o final do experimento.

Para a avaliação planimétrica, foram feitas radiografias (Figuras 1 e 2) depois da desarticulação do joelho. Na avaliação radiográfica, a diferença entre os resultados médios dos calos ósseos foi estatisticamente significante (p<0,0001), havendo menor área de calo ósseo nos grupos que consumiram a dieta desprovida de proteínas, o que concorda com os achados de outros estudos⁽⁹⁾ que demonstraram haver calo mais abundante nas fraturas em ratos nutridos quando comparados aos subnutridos.

A análise densitométrica mostrou diferença estatisticamente significante quando houve a administração do risedronato. Os bisfosfonatos se aderem aos minerais do osso, agindo sobre os osteoclastos, têm alta seletividade de localização e retenção nos ossos, e podem aumentar a massa óssea⁽⁵⁾. Este fato vem também confirmar o mecanismo de ação do risedronato como inibidor da reabsorção óssea mediada pelos osteoclastos.

Comparando os grupos com dieta aprotéica com e sem risedronato, os estudos histológicos não apresentaram diferença significante quanto à quantidade de osso formado, porém observou-se que no grupo com dieta aprotéica com risedronato, havia mais tecido ósseo maduro, evidenciando calcificação ao exame anátomo-patológico, quando comparado ao grupo com dieta aprotéica sem o medicamento. Assim, qualitativamente, o risedronato contribuiu para a formação de tecido ósseo maduro, de melhor qualidade e morfologia, embora quantitativamente não tenha oferecido diferença significativa, ao exame histológico, nas amostras dos grupos submetidos às dietas protéica e aprotéica (Figuras 3-6). Essa diferença na qualidade do tecido ósseo foi também observada nos grupos com dieta protéica, comparando-se os grupos com e sem risedronato, o que constata que o risedronato melhora a arquitetura trabecular^(6,12).

Na avaliação dos componentes teciduais das diferentes amostras, ao se avaliar a porcentagem de tecido fibroso, e de osso neoformado, verificou-se que não houve significância estatística nos grupos de diferentes dietas, com ou sem a administração do risedronato. Porém, quando avaliado o percentual de tecido cartilagíneo, verificou-se diferença estatisticamente significante (p<0,05), com aumento do mesmo, quando o risedronato foi administrado ao grupo de dieta aprotéica. Isso é significativo por ser provável que a cartilagem evolua para ossificação endocondral. Contudo, não há garantia disso, visto que é possível a evolução para retardo de consolidação ou mesmo para pseudartrose.

Na avaliação laboratorial dos níveis de cálcio, observou-se diferença significativa nos níveis séricos do cálcio (p<0,05) nos grupos que receberam o risedronato tanto de dieta aprotéica como o de dieta protéica, confirmando o efeito hipocalcemiante dos bisfosfonatos⁽⁵⁾.

A análise dos níveis séricos da fosfatase alcalina revelou diferença estatisticamente significante nos grupos com dietas diferentes, sendo diminuída nos grupos com dieta aprotéica, o que pode ser explicado pela desnutrição; porém, a adição do risedronato não causou diferença estatisticamente significante nos diferentes grupos.

A análise das variações dos níveis séricos das proteínas totais, possibilitou verificar que houve diferença estatisticamente significante quando analisada a dieta (p<0,001), confirmando a desnutrição protéica. A adição do risedronato não causou diferença significativa nos grupos que receberam o medicamento.

Em relação à análise dos níveis séricos da albumina, houve diferença estatisticamente significante na análise das diferentes dietas. A presença do risedronato na dieta protéica foi estatisticamente significante, o que pode sugerir que esse medicamento talvez interfira no metabolismo dessa proteína, abrindo espaço para mais estudos desse assunto.

A osteocalcina, uma proteína de baixo peso molecular, sintetizada pelos osteoblastos, e específica para o tecido ósseo, tem seus níveis séricos aumentados na formação óssea⁽⁴⁾. Neste experimento, os níveis séricos desta proteína estiveram aumentados no grupo em que o risedronato foi administrado aos animais que consumiam a dieta aprotéica, apresentando diferença estatisticamente significante (p=0,0024) aos 43 dias. Apresentou, também, diferença estatisticamente significante (p=0,0498) no grupo que recebeu dieta protéica. A osteocalcina é produzida e liberada pelos osteoblastos durante a formação óssea, e o aumento sérico deste marcador do metabolismo ósseo neste experimento, principalmente quando da administração do risedronato, demonstra uma elevação da atividade osteoblástica que traduz produção óssea, isto é, anabolismo.

O risedronato exerceu influência significativa em diversas variáveis, como na quantidade relativa de cartilagem, que é o sítio para a ossificação endocondral, presente no calo ósseo; na densitometria óssea; no marcador da formação óssea, a osteocalcina; sendo sua ação principalmente nos animais desnutridos. Isso pode ter uma aplicação clínica importante, principalmente em se tratando de pacientes que vierem a sofrer fraturas estando em situação de carência nutricional, como pacientes acamados por longo período, idosos, ou em outra situação de desvantagem, o que certamente nos desafia a novas pesquisas nessa área.

CONCLUSÕES

O risedronato sódico administrado por via oral na dose de 1 mg/kg de peso corporal exerceu influência positiva no processo de consolidação de fraturas em ratos nutridos ou desnutridos.

O risedronato sódico apresentou significância estatística na avaliação da densidade mineral óssea nos ratos nutridos e desnutridos.

Na avaliação bioquímica, a osteocalcina demonstrou que o risedronato contribuiu positivamente para a formação óssea nos animais.

Trabalho recebido em 14/04/03

Aprovado em 06/04/04

Trabalho realizado no Instituto de Ortopedia e Traumatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da universidade de São Paulo (FMUSP) e na Faculdade de Medicina da Universidade Estadual de Londrina (FMUEL)

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Jun 2004
• Data do Fascículo
  Jun 2004

Histórico

• Aceito
  06 Abr 2004
• Recebido
  14 Abr 2003